CN107899022B - 一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药学技术领域，公开了一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体及制备方法，以纳米雷公藤甲素脂质体为药物载体；用聚乙二醇PEG进行隐形化修饰制得隐形化雷公藤甲素纳米脂质体；采用共价偶联法将脑靶向配体Lf连接到PEG‑TP纳米脂质体表面制得隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体。本发明通过对制备工艺的优化，成功制备了粒径分布均匀、包封率较高、稳定性好的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体，相关结果未见文献报道；制备的Lf‑PEG‑TP纳米脂质体平均粒径为105.98±2.65nm，包封率为55.96±2.13％，Lf偶百分率为79.26±3.57％。

Description

一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体及制备方法

技术领域

本发明属于医药学技术领域，尤其涉及一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体及制备方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的中枢神经系统退行性疾病，以进行性记忆减退、认知障碍、人格改变为主要特征，多发生在老年期或老年前期，在老年人死亡原因中仅次于心血管病、脑血管病和恶性肿瘤而居第4位。据《2015年世界阿尔茨海默病报告》，全球约有4680万痴呆患者，并且每年新发病例990万(全球每3秒新增1例)；全球老年痴呆医疗费用已从2010年的6040亿美元增加到了2015年的8180亿美元，增长了35.4％，AD已成为当今和未来人类所面临的最大的全球公共健康和社会保健挑战之一。中国阿尔茨海默病患者人数已居世界第一，而只有21％的患者得到了规范诊断，仅19.6％接受了药物治疗。目前国内外阿尔茨海默病临床治疗药物主要是姑息对症的胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸受体拮抗剂，只能暂时缓解临床症状，且毒副作用大、不良反应多，长期用药患者常难以耐受。因此，加强AD防治药物研发迫在眉睫。

长期以来，中医药对老年认知障碍(健忘、痴呆)的防治积累了丰富的经验，AD中医药防治研究也日益为国内外学者所瞩目。近年大量研究表明常用中草药雷公藤主要成分、具有抗炎和免疫调节活性的雷公藤甲素(Triptolide，TP)具有显著的神经保护和抗AD生物学活性。在AD的病理过程中，沉积于细胞外的Aβ以及由Aβ聚集和纤维化而成的SP是启动AD脑内慢性炎症反应的重要因素之一，雷德亮等研究发现，TP可以抑制APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马内Aβ沉积和老年斑的形成，并且抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化与增殖，以及抑制活化的星形胶质细胞诱导表达环氧化酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)，说明TP具有NSAIDs的部分特性，对该模型小鼠或AD脑内慢性炎症反应具有一定的抑制作用，或可用于AD的预防和治疗。Wang等发现TP能改善5XFAD转基因AD模型小鼠的学习记忆能力，减少Aβ在5XFAD转基因AD模型小鼠脑内的产生和积聚。吕诚等研究发现，给予TP治疗后，AD模型大鼠海马IL-1β蛋白和mRNA的表达明显下降。免疫组化法观察到用药组胞核表达NF-κB的细胞数明显减少，TP对AD模型大鼠海马NF-κB的活化有抑制作用^[9]。

然而，雷公藤甲素具有显著的抗AD药效活性，同时也是引起不良反应的主要成分，TP在消化、循环、血液等系统和多脏器分布，对免疫系统、血液系统、消化系统、心脏、肝脏、肾脏均具有明显的毒副作用，会引起严重不良反应，严重影响限制了TP的临床应用；其体内广泛分布同时降低了其脑内药物浓度和生物利用度。大剂量TP可提高诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达，进而形成大量超氧根离子引起肝毒性；TP可使肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)和NO释放增加，TNF的过度分泌引起肝损伤。TP对肾脏的毒性主要表现为对近曲小管上皮细胞的损伤作用，并且与凋亡蛋白酶3的激活有关。TP的心脏毒性与血钾降低有关，且具有剂量相关性。

因此TP的减毒增效一直为学术界所关注。纳米靶向制剂是TP减毒增效的重要方向。梅之南等自制雷公藤甲素固体脂质纳米粒，并观察其对肝脏的影响，发现雷公藤甲素固体脂质纳米粒能减少雷公藤甲素在小鼠体内产生MDA，说明固体脂质纳米粒可减少雷公藤甲素在小鼠体内脂质过氧化反应的发生，显著降低雷公藤甲素对肝脏的损伤。刘明星等采用改良的自乳化溶剂蒸发法制备雷公藤甲素聚乳酸纳米粒，并通过口服给予大鼠考察其减毒作用，发现纳米粒非常显著降低了肝毒性和肾毒性。Xu等研究了雷公藤甲素的凝胶微乳液(TP-MTH)在兔子、小鼠、狗及豚鼠身上的安全性，结果只可以观察到轻度可逆的皮肤红肿，说明雷公藤甲素的凝胶乳液可以减轻对皮肤的局部刺激。Xue等自制雷公藤多苷固体脂质纳米粒(TG-SLNs)，并口服给予大鼠，观察其对生殖功能的影响，发现给予TG-SLNs的大鼠的精子活率明显升高，没有出现睾丸萎缩现象，并且血清中睾酮水平正常。

对于TP防治AD的研究，多集中在药效学和机理，并没有进一步的对TP增效减毒的剂型改良研究的报道。现有的技术，证明了TP防治AD的有效性，却没有解决TP的药理毒性，减缓了TP治疗AD的临床应用步伐。

综上所述，现有技术存在的问题是：

老年性痴呆目前还不能被治愈，现有的治疗药物只能暂时缓解AD的症状，且副作用大；现有技术，没有结合天然中药活性成分雷公藤甲素和现代先进载药技术，制备具有脑靶向性的隐形纳米脂质体，应用于AD的防治；而且TP在体内广泛分布，产生的多脏器毒性局限了其临床应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体及制备方法。本发明弥补了用于AD防治的TP增效减毒的一项剂型改良空白，解决了具有脑靶向性的隐形纳米脂质体制备的技术问题。

本发明是这样实现的，一种隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP，所述隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP以纳米雷公藤甲素脂质体为药物载体；用聚乙二醇PEG进行隐形化修饰制得。

本发明另一目的在于提供一种隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP的制备方法，包括：选择薄膜分散-超声法；磷脂/胆固醇比为2：1；氯仿用量为20ml；载药温度为40℃；载药时间为60min；药脂比为l：50。

进一步，所述隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP的制备方法采用薄膜分撒-超声法，具体包括：

按质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1分别称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为制备脂质体的膜材，以及为氢化大豆卵磷脂总质量的1/50的雷公藤甲素；

溶于20ml体积比为2/1的氯仿/甲醇混合溶剂中；将该混合溶剂置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，将15ml PBS缓冲溶液加入圆底烧瓶，于40℃恒温水浴上旋转水合60min；使脂质体膜脱落，得混悬液；

冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG-TP纳米脂质体。

进一步，所述40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿中，旋转速度为100rpm；所述将15ml PBS缓冲溶液加入圆底烧瓶中，pH为7.4。

本发明另一目的在于提供一种隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP包封率的检测方法，采用凝胶柱过滤法测定隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP的包封率，具体包括：

预装柱：称取葡聚糖凝胶Sephadex G-50 5g，加入蒸馏水100ml浸泡过夜，置90℃溶胀2h，室温过夜，使之完全溶胀；在不断搅拌下缓缓加入一根底部装有筛板1cm×25cm的玻璃层析柱，除尽气泡；加入50ml pH7.4的PBS平衡过夜，3倍-4倍柱体积的PBS冲洗备用；

洗脱曲线的绘制：取制备好的隐形化雷公藤甲素脂质体lml上柱，用pH7.4的PBS洗脱，速率1ml/min；收集洗脱液，每管2ml，进液相测定，记录峰面积，计算浓度，绘制洗脱曲线；

Sephadex G-50凝胶柱对游离药物回收率的分析：配制浓度0.20mg/ml的雷公藤甲素甲醇溶液，挥干甲醇；加入PBS溶液lml，超声降低药物颗粒，并涡旋震荡促使其溶解；上柱，洗脱，收集游离药物，进液相测定，记录峰面积，计算柱回收率；

包封率的测定：取待测包封率的隐形化雷公藤甲素脂质体lml上柱，洗脱分离，过滤分离隐形化雷公藤甲素脂质体后，分管收集脂质体和游离药物，按下式计算包封率：

式中W_总表示脂质体混悬液中雷公藤甲素总量，W_游表示游离的雷公藤甲素量。

本发明另一目的在于提供一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP，所述隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP采用共价偶联法将脑靶向配体Lf连接到PEG-TP纳米脂质体表面制得。

本发明另一目的在于提供、一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP的制备方法，包括：载药温度为40℃，载药时间为60min，药脂比为l：50，Lf溶液浓度为2.0mg/ml，孵育时间4.0h。

进一步，所述隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP的制备方法具体包括：

按质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1分别称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为制备脂质体的膜材，以及为磷脂总质量的1/50的雷公藤甲素；

溶于20ml体积比为2/1的氯仿/甲醇混合溶剂中；将该混合溶剂置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，将15ml PBS缓冲溶液加入圆底烧瓶，于40℃恒温水浴上旋转水合60min；使脂质体膜脱落，得混悬液；

冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG-TP纳米脂质体。

采用共价偶联法对已制备的PEG-TP纳米脂质体进行脑靶向修饰；

先用SATP试剂将Lf进行巯基化：将适量的Lf和SATP溶液混合，加入PBS缓冲溶液，搅拌反应30min；

反应结束后以10K超滤管在转速为4000r/min条件下超滤4次；再将巯基化的Lf溶于去离子水配制成2.0mg/ml浓度的Lf溶液；37℃恒温磁力搅拌下，将Lf溶液按等体积缓慢加入PEG-TP纳米脂质体混悬液中，孵育4.0h，制得Lf-PEG-TP纳米脂质体。

进一步，所述加入PBS缓冲溶液pH为7.4。

本发明另一目的在于提供一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TPLf偶联百分率的测定方法，包括：

取制备的Lf-PEG-TP脂质体悬浮液，在10000rpm下离心30min，取上清，使用考马斯亮蓝法测定上清液游离蛋白含量，按下式计算脂质体中Lf偶联百分率：

式中W_总表示脂质体混悬液中Lf总量，W_游表示游离的Lf质量。

本发明的优点及积极效果为：

根据AD的核心病理机制-免疫炎症学说，本发明从中药治疗AD的研究中发现，雷公藤甲素(Triptolide，TP)兼备抗炎免疫活性和神经保护作用，有望成为治疗AD的潜在药物。为了对TP进行增效减毒，本发明制备了抗AD的TP脑靶向纳米载体药物：以纳米脂质体为药物载体；用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)进行隐形化修饰，降低肝、脾、肾等组织的药物分布；选用乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)为脑靶向头基，提高隐形化TP纳米脂质体的脑靶向性。

本发明通过对制备工艺的优化，成功制备了粒径分布均匀、包封率较高、稳定性好的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体，相关结果未见文献报道。

本发明的葡聚糖凝胶过滤-高效液相色谱法检测操作简单，精密度高、重复性良好，适用于Lf-PEG-TP脂质体的包封率的测定。

本发明确定了隐形化雷公藤甲素脂质体的含量和包封率的测定方法。建立雷公藤甲素的高效液相测定方法并绘制标准曲线，进行可靠性分析；采用葡聚糖凝胶柱过滤法分离隐形化雷公藤甲素纳米脂质体和游离的雷公藤甲素，进行回收率的考察后，高效液相法检测雷公藤甲素的含量，计算包封率。绘制雷公藤甲素在1.5625μg/ml-100μg/ml浓度范围的标准曲线，浓度与主药峰面积的线性关系良好，回归方程为Y＝19732X+9458(R2＝0.999，n＝5)；葡聚糖凝胶柱过滤法测定包封率对游离药物回收率为99.86％，对脂质体回收率较好。

本发明优化了隐形化雷公藤甲素纳米脂质体(PEG-TP纳米脂质体)的制备工艺：以包封率为考核指标，筛选PEG-TP纳米脂质体的制备方法；通过改变磷脂/胆固醇比例、有机溶剂用量、药脂比、载药温度和载药时间，优化PEG-TP纳米脂质体制备工艺。制备方法的筛选中，PEG-TP纳米脂质体的包封率为薄膜分散-超声法>机械匀浆法>乙醇注入法，相应的分散度(Polydispersity，PDI)为0.298＜0.319＜0.401，最终选择薄膜分散-超声法；脂质体制备工艺中，磷脂/胆固醇比为2：1时制备的脂质体稳定性好，氯仿用量为20ml时制备的脂质体粒径分布较好，正交优化实验结果显示最佳制备条件：载药温度为40℃、载药时间为60min、药脂比为l：50；最后按照优化条件制得的PEG-TP纳米脂质体包封率为52.69士1.82％。

本发明优化了具有脑靶向功能的隐形化雷公藤甲素纳米脂质体(Lf-PEG-TP纳米脂质体)的制备工艺：采用共价偶联法将脑靶向配体Lf连接到已优化制备的PEG-TP纳米脂质体表面，以脂质体表面Lf偶联百分率为考核指标，通过改变Lf浓度和孵育时间，优化Lf-PEG-TP纳米脂质体的制备工艺。按照Lf溶液浓度2.0mg/ml、孵育时间4.0h，制备的Lf-PEG-TP纳米脂质体平均粒径为105.98±2.65nm，包封率为55.96±2.13％，Lf偶百分率为79.26±3.57％。

本发明成功制备了粒径分布均匀、包封率较高、稳定性好的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体，初步解决了TP脑靶向纳米载体药物制备的关键技术问题，可望为AD治疗提供新药物新方法、开辟新思路，具有重要的研究价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例提供的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体的制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的高效液相色谱法测定雷公藤甲素的标准曲线(n＝5)图；

图3是本发明实施例提供的不同对药脂比对PEG-TP脂质体包封率的影响图；

图4是本发明实施例提供的不同对载药时间对PEG-TP脂质体包封率的影图；

图5是本发明实施例提供的不同对载药温度对PEG-TP脂质体包封率的影响图；

图6是本发明实施例提供的Lf浓度对Lf-PEG-TP脂质体中Lf偶联百分率的影响图；

图7是本发明实施例提供的孵育时间对Lf-PEG-TP脂质体中Lf偶联百分率的影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明进行了隐形化雷公藤甲素纳米脂质体(PEG-TP纳米脂质体)的前分析：建立雷公藤甲素的高效液相测定方法并绘制标准曲线，进行可靠性分析；采用葡聚糖凝胶柱过滤法分离隐形化雷公藤甲素纳米脂质体和游离的雷公藤甲素，进行回收率的考察后，高效液相法检测雷公藤甲素的含量，计算包封率，确定PEG-TP纳米脂质体的包封率测定方法。

本发明进行了隐形化雷公藤甲素纳米脂质体(PEG-TP纳米脂质体)的制备：以包封率为考核指标，筛选PEG-TP纳米脂质体的制备方法；通过改变磷脂/胆固醇比例、有机溶剂用量、药脂比、载药温度和载药时间，优化PEG-TP纳米脂质体制备工艺。

本发明进行了具有脑靶向功能的隐形化雷公藤甲素纳米脂质体(Lf-PEG-TP纳米脂质体)的制备技术分析：采用共价偶联法将脑靶向配体Lf连接到PEG-TP纳米脂质体表面，以脂质体表面Lf偶联百分率为考核指标，通过改变Lf浓度和孵育时间，优化Lf-PEG-TP纳米脂质体制备工艺。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。

本发明实施例提供的隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP，所述隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP以纳米雷公藤甲素脂质体为药物载体；用聚乙二醇PEG进行隐形化修饰制得。

本发明实施例提供一种隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP的制备方法，包括：选择薄膜分散-超声法；磷脂/胆固醇比为2：1；氯仿用量为20ml；载药温度为40℃；载药时间为60min；药脂比为l：50。

所述隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP的制备方法采用薄膜分撒-超声法，具体包括：

按质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1分别称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为制备脂质体的膜材，以及为磷脂总质量的1/50的雷公藤甲素；

溶于20ml体积比为2/1的氯仿/甲醇混合溶剂中；将该混合溶剂置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，将15ml PBS缓冲溶液加入圆底烧瓶，于40℃恒温水浴上旋转水合60min；使脂质体膜脱落，得混悬液；

冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG-TP纳米脂质体。

所述40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿中，旋转速度为100rpm；所述将15mlPBS缓冲溶液加入圆底烧瓶中，pH为7.4。

本发明实施例提供一种隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP包封率的检测方法，采用凝胶柱过滤法测定隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP的包封率，具体包括：

预装柱：称取葡聚糖凝胶Sephadex G-50 5g，加入蒸馏水100ml浸泡过夜，置90℃溶胀2h，室温过夜，使之完全溶胀；在不断搅拌下缓缓加入一根底部装有筛板1cm×25cm的玻璃层析柱，除尽气泡；加入适量pH7.4的PBS平衡过夜，3倍～4倍柱体积的PBS冲洗备用；

洗脱曲线的绘制：取制备好的隐形化雷公藤甲素脂质体lml上柱，用pH7.4的PBS洗脱，速率1ml/min；收集洗脱液，每管2ml，进液相测定，记录峰面积，计算浓度，绘制洗脱曲线；

Sephadex G-50凝胶柱对游离药物回收率的分析：配制浓度0.20mg/ml的雷公藤甲素甲醇溶液，挥干甲醇；加入PBS溶液lml，超声降低药物颗粒，并涡旋震荡促使其溶解；上柱，洗脱，收集游离药物，进液相测定，记录峰面积，计算柱回收率；

包封率的测定：取待测包封率的隐形化雷公藤甲素脂质体lml上柱，洗脱分离，过滤分离隐形化雷公藤甲素脂质体后，分管收集脂质体和游离药物，按下式计算包封率：

式中W_总表示脂质体混悬液中雷公藤甲素总量，W_游表示游离的雷公藤甲素量。

本发明实施例在于提供一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP，所述隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP采用共价偶联法将脑靶向配体Lf连接到PEG-TP纳米脂质体表面制得。

本发明实施例提供的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP的制备方法，包括：载药温度为40℃，载药时间为60min，药脂比为l：50，Lf溶液浓度为2.0mg/ml，孵育时间4.0h。

如图1所示，本发明实施例提供的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP的制备方法具体包括：

S101:按质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1分别称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为制备脂质体的膜材，以及为磷脂总质量的1/50的雷公藤甲素；溶于20ml体积比为2/1的氯仿/甲醇混合溶剂中；将该混合溶剂置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，将15ml PBS缓冲溶液加入圆底烧瓶，于40℃恒温水浴上旋转水合60min；使脂质体膜脱落，得混悬液；

S102:冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG-TP纳米脂质体。

S103:采用共价偶联法对已制备的PEG-TP纳米脂质体进行脑靶向修饰；先用SATP试剂将Lf进行巯基化：将适量的Lf和SATP溶液混合，加入PBS缓冲溶液，搅拌反应30min；反应结束后以10K超滤管在转速为4000r/min条件下超滤4次；再将巯基化的Lf溶于去离子水配制成2.0mg/ml浓度的Lf溶液；37℃恒温磁力搅拌下，将Lf溶液按等体积缓慢加入PEG-TP纳米脂质体混悬液中，孵育4.0h，制得Lf-PEG-TP纳米脂质体。

所述加入PBS缓冲溶液pH为7.4。

本发明实施例提供一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP Lf偶联百分率的测定方法，包括：

取制备的Lf-PEG-TP脂质体悬浮液，在10000rpm下离心30min，取上清，使用考马斯亮蓝法测定上清液游离蛋白含量，按下式计算脂质体中Lf偶联百分率：

式中W_总表示脂质体混悬液中Lf总量，W_游表示游离的Lf质量。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

1、隐形化雷公藤甲素纳米脂质体的前分析：

1.1实验材料

主要实验试剂见表1-1。

表1-1主要实验试剂

主要实验仪器：实验中涉及的实验仪器列于表1-2。

表1-2主要实验仪器

主要溶液配制

(1)对照品溶液的制备：精密称取雷公藤甲素标准品5mg，置于5ml容量瓶中，加入色谱甲醇溶解雷公藤甲素并定容至5ml，充分混匀后得浓度为1mg/ml的母液。

(2)标准溶液的制备：将母液依次稀释成浓度为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml的标准溶液，4℃冰箱内保存备用。

(3)样品溶液的制备：精确移取1ml隐形化雷公藤甲素脂质体置于10ml容量瓶中，加入适量的甲醇，超声10min，定容至刻度，即得。

1.2实验方法

1.2.1雷公藤甲素HPLC检测方法的建立

1)隐形化雷公藤甲素脂质体的制备

精确称取处方量的雷公藤甲素、氢化大豆卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入10ml氯仿，于涡旋振荡器上震荡溶解，得脂质溶液I；将溶液I置于磨口旋转蒸发瓶中，40℃恒温水浴，减压旋转蒸发除去氯仿；使脂质材料在旋转蒸发瓶底部形成均匀类脂膜，向瓶中加入PBS溶液10ml，水化得到隐形化雷公藤甲素脂质体；冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得隐形化雷公藤甲素纳米脂质体。

2)隐形化空白脂质体的制备

精确称取处方量氢化大豆卵磷脂、胆固醇和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入氯仿溶解，于旋转蒸发仪上真空旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀的脂质体薄膜后，加入PBS水合成脂质体，超声处理，微孔过滤，即得隐形化空白纳米脂质体。

3)色谱条件

色谱柱：μ-BondapakC18(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长：218nm；流动相：甲醇/1％甲酸(体积比90/10)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

4)专属性实验

分别进样对照品溶液、空白脂质体溶液和雷公藤甲素纳米脂质体溶液各20μL，比较色谱图。

5)线性范围考察

进样标准溶液20μl，记录色谱峰面积，以雷公藤甲素色谱峰面积对浓度回归得标准曲线。

6)精密度实验

精密吸取三个不同浓度(1.5625μg/ml、25μg/ml和100μg/ml)的雷公藤甲素标准溶液，于日内每隔2小时分别进样20μl进液相测定，记录雷公藤甲素色谱峰面积，同一供试品溶液，重复进样5次；每日同一时间测定一次，共测5天，计算日内及日间的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

7)稳定性实验

取样品溶液，分别于0、2、4、8、12和24h时间点进样测定，记录雷公藤甲素峰面积，计算RSD。

8)回收率实验

精密量取隐形化雷公藤甲素纳米脂质体5份，每份1ml，置于10ml，容量瓶中；再分别精密加入雷公藤甲素对照品0.5mg，加甲醇至刻度线后测定，进样20μl，进液相测定，记录雷公藤甲素色谱峰面积，计算回收率。

1.2.2隐形化雷公藤甲素纳米脂质体包封率检测方法的建立

采用凝胶柱过滤法测定隐形化雷公藤红甲素纳米脂质体的包封率。

1)预装柱

称取葡聚糖凝胶Sephadex G-50约5g，加入蒸馏水100ml浸泡过夜，置90℃溶胀2h，室温过夜，使之完全溶胀；在不断搅拌下缓缓加入一根底部装有筛板的玻璃层析柱(1cm×25cm)，除尽气泡；加入适量pH7.4的PBS平衡过夜，3-4倍柱体积的PBS冲洗备用。

2)洗脱曲线的绘制

取制备好的隐形化雷公藤甲素脂质体lml上柱，用pH7.4的PBS洗脱，速率1ml/min；收集洗脱液，每管2ml，进液相测定，记录峰面积，计算浓度，绘制洗脱曲线。

3)Sephadex G-50凝胶柱对游离药物回收率的考察

配制浓度0.20mg/ml的雷公藤甲素甲醇溶液，挥干甲醇；加入PBS溶液1ml，超声降低药物颗粒，并涡旋震荡促使其溶解；上柱，按上述方法洗脱，收集游离药物，进液相测定，记录峰面积，计算柱回收率。

4)包封率的测定方法

取待测包封率的隐形化雷公藤甲素脂质体lml上柱，按照上述方法洗脱分离，分管收集脂质体和游离药物，计算包封率。

1.3实验结果与讨论

1.3.1雷公藤甲素HPLC检测方法的建立

1)专属性实验

由雷公藤甲素色谱图可知。专属性实验中，雷公藤甲素(保留时间4.5min)与其他成分完全分离，峰形较好，空白脂质体对测定无干扰。

2)线性范围考察

线性范围考察以雷公藤甲素色谱峰面积对浓度回归得标准曲线，见图2。回归方程为Y＝19732X+9458(R²＝0.999，n＝5)。结果表明，高效液相法用于雷公藤甲素的测定，在1.5625μg/ml-100μg/ml浓度范围内线性关系较好。

3)精密度实验

精密度测定示日内的RSD为1.03％-1.77％，日间的RSD为0.54％-1.12％，见表1-3。结果表明,高效液相法测定雷公藤甲素的日间差和日内差RSD均小于2％，该方法的精密度良好。

表1-3高效液相色谱法测定雷公藤甲素的精密度实验结果

4)稳定性实验

稳定性实验结果显示0-24h稳定性良好，具体见表1-4。

表1-4高效液相色谱法测定雷公藤甲素的稳定性实验结果

5)回收率实验

回收率实验结果见表1-5，高效液相法测定雷公藤甲素的平均回收率为99.9％，RSD为0.20％。

表1-5高效液相色谱法测定雷公藤甲素的回收率实验结果

高效液相色谱法(high efficiency liquid chromatography，HPLC)是一种通过流通性液体或液化状态的物质流经固定色谱的固定相后被分离的色谱分析方法，这种方法能够将成分有效的分离。和其他分离方法相比，高效液相色谱法具有柱效高、灵敏度高、分离速度快、适用范围广、重复性好、操作方便等优点，在中药化学研究中得到广泛应用，并为中药分析研究工作提供了条件。在含量测定方面，几乎各种结构类型的中药活性成分均有使用高效液相色谱测定含量的报道。方等建立高效液相色谱法，检测甲磺酸伊马替尼脂质体的含量及有关物质，结果表明该方法用于检测甲磺酸伊马替尼脂质体的含量及有关物质准确、灵敏、可靠。曾等建立盐酸罗哌卡因多囊脂质体中药物含量及包封率的测定方法，结果显示该方法操作简单，结果准确，适合用于盐酸罗哌卡因多囊脂质体含量和包封率测定。刘等采用高效液相色谱法测定多西紫杉醇长循环热敏脂质体的包封率，并考察方法的可行性，结果表明该方法简便快速，准确可靠，可用于测定多西紫杉醇长循环热敏脂质体的包封率。

1.3.2隐形化雷公藤甲素纳米脂质体包封率检测方法的建立

1)洗脱曲线的绘制

采用葡聚糖凝胶柱过滤法洗脱曲线的结果可知，脂质体和游离药物分离良好，脂质体在6m1-18ml收集，游离药物在24m1-44ml收集，扩散明显。

2)Sephadex G-50凝胶柱对游离药物回收率的考察

柱回收率考察结果见表1-6。葡聚糖凝胶柱对游离药物回收率为99.86％，RSD为0.22％，

表明葡聚糖凝胶对雷公藤甲素没有吸附。

表1-6葡聚糖凝胶柱的回收率实验结果

3)包封率的测定

Sephadex G-50凝胶柱过滤分离隐形化雷公藤甲素脂质体后，分管收集脂质体和游离药物，按下式计算包封率：

式中W_总表示脂质体混悬液中雷公藤甲素总量，W_游表示游离的雷公藤甲素量。隐形化雷公藤甲素脂质体的包封率为31.67±1.26％。

通过葡聚糖凝胶过滤与高效液相色谱法相结合检测PEG-TP脂质体的包封率操作简便，减少了误差传递。脂质体包封率的测定方法包括两类：一类是直接对制剂进行测定，常用的方法又核磁共振、电子自旋共振光谱、荧光染料钙黄绿素的荧光淬灭反应等；另一类是分离出脂质体来测定，常用的有离心法、葡聚糖凝胶过滤法、微型柱离心法、透析法、大孔树脂法、滤膜法等。凝胶过滤法是利用分子筛的原理，使混合组分依据分子的大小不同而得到分离。脂质体由于其分子比游离药物大，不易进入凝胶内部而先被洗脱，游离药物后被洗脱。白等以葡聚糖凝胶分离结合高效液相色谱法测定立依托泊苷脂质体包封率，结论为葡聚糖凝胶分离结合高效液相色谱法操作简单，精密度高、重复性良好，适用于依托泊苷脂质体的包封率的测定。刘等采用葡聚糖凝胶柱层析法-高效液相色谱法测定脂质体中葛根素的含量和包封率，结果显示该方法准确、灵敏，可用于冰片葛根素脂质体中葛根素含量及包封率的测定。

2.隐形化雷公藤甲素纳米脂质体的制备工艺

2. 1实验材料

1)主要实验试剂见表2-1。

表2-1主要实验试剂

2)主要实验仪器：实验中涉及的实验仪器列于表2-2。

表2-2主要实验仪器

2.2实验方法

2.2.1隐形化雷公藤脂质体的制备方法的选择

1)薄膜分撒-超声法

分别精密称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1)作为制备脂质体的膜材，以及雷公藤甲素(磷脂总质量的1/20)^[60]，溶于15ml氯仿/甲醇(体积比2/1)混合溶剂中；将该溶液置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发(100rpm)，除去氯仿；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，将15ml PBS(pH7.4)缓冲溶液加入圆底烧瓶，于40℃恒温水浴上旋转水合，使脂质体膜脱落，得混悬液；冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG-TP纳米脂质体。

2)机械匀浆法

隐形化空白纳米脂质体的制备：分别精密称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇(物质的量比为HSPC：Chol＝2：1)，溶于15ml氯仿/甲醇(体积比2/1)混合溶剂中；将该溶液置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发除去氯仿；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，加入15ml PBS缓冲溶液，于40℃恒温水浴上旋转水合，使脂质体膜脱落，得混悬液；冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG化空白纳米脂质体，4℃冰箱内保存备用。

称取处方量的雷公藤甲素(磷脂总质量的1/20)，溶于氯仿溶液，装入玻璃离心管中；放入通风橱，通风挥干氯仿；将制备好的处方量PEG化空白纳米脂质体加入离心管，漩涡震荡搅拌30min，即得PEG-TP纳米脂质体。

3)乙醇注入法

分别精密称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1)作为制备脂质体的膜材，以及雷公藤甲素(磷脂总质量的1/20)，溶于氯仿，得到混合溶液；吸取1ml混合溶液，置于EP管中，挥干氯仿；加入乙醇0.75ml超声溶解脂质及药物，吸入注射器备用；吸取10mlPBS，倒入20ml玻璃瓶，置于磁力搅拌器60℃磁力搅拌，将0.75ml脂质的乙醇液缓缓注入1PBS中(两相体积比应≤7.5：100)，继续搅拌2小时，尽量挥发除去乙醇，即得PEG-TP纳米脂质体。

以上三种方法制得的PEG-TP纳米脂质体，已包封率和粒径分布为考察指标，择优选择制备方法。

2.2.2隐形化雷公藤脂质体的制备工艺的优化

根据PEG-TP纳米脂质体制备方法的筛选结果，采用薄膜分散法-超声制备PEG化空白脂质体和PEG-TP纳米脂质体纳米脂质体，以脂质体的粒径分布、包封率及稳定性为考察指标，对处方进行单因素考察，改变其中某一条件而固定其它条件不变，考察不同磷脂和胆固醇比例、氯仿用量对PEG化空白纳米脂质体的影响，以及药脂比、载药时间和载药温度对TP-PEG化纳米脂质体的影响。

1)磷脂和胆固醇比例

一定比例的胆固醇能够稳定脂质体的化学性质，改善脂质体的分子结构，降低脂质体的被氧化速率，提高脂质体膜的通透性和流动性^[61]。固定其他制备条件不变，改变胆固醇与磷脂的比例，按薄膜分散-超声法制备PEG化空白纳米脂质体，测定脂质体的粒径分布，考察不同磷脂、胆固醇比例对脂质体粒径及稳定性的影响。

2)氯仿用量

薄膜分散法制备的脂质体其粒径分布与脂膜的均匀程度和厚度有一定关系。最初有机溶剂的用量越大，脂质的溶解越充分，最后形成的干燥脂质膜越薄且均匀，水化形成脂质体应该相对铰小、较均匀；但使用过多的氯仿，相应的旋转蒸发时间就会延长，可能对磷脂的稳定性产生影响。固定其它制备条件不变，改变起初氯仿的用量，分别用10ml氯仿、20ml氯仿溶解，按薄膜分散-超声法制备PEG化空白纳米脂质体，采用动态光散射仪测定纳米脂质体的粒径分布，考察不同氯仿用量对脂质体粒径的影响。

3)药脂比

脂溶性药物可溶解于脂质体的磷脂双分子层的夹层中，一般情况下，掺入脂质双分子层的脂溶性药物浓度大约为1％-10％(重量比)，而不会严重破坏双层结构，但过量的药物掺入会严重影响脂质双分子层的形成。固定其他条件不变(载药时间30min，载药温度25℃)，改变雷公藤甲素与磷脂的比例，按薄膜分散-超声法制备PEG-TP纳米脂质体，考察药脂比对包封率的影响。

4)载药时间

载药时间过短，脂质体不能充分包载药物；时间过长，易对脂质体的稳定造性造成影响。固定其他条件不变(药脂比1：10，载药温度25℃)，改变水合作用时间，按薄膜分散-超声法制备PEG-TP纳米脂质体，考察水合时间对脂质体包封率的影响。

5)载药温度

在制备脂质体的过程中，温度必须在磷脂的相变温度以上，以完成药物的包载，然而温度过高容易破坏脂质体的稳定性。固定其他条件不变(药脂比1：10，载药时间30min)，改变载药温度，按薄膜分散-超声法制备PEG-TP纳米脂质体，考察不同载药温度对脂质体包封率的影响。

2.2.3正交实验设计优化制备条件

基于考察单因素对PEG-TP纳米脂质体包封率的影响的实验结果，进行正交设计优化条件。三个因素分别为载药温度(A)、药物-磷脂质量比(B)和载药时间(C)，分别取三水平，选用L₉(4³)正交表进行实验。实验因素与水平见表2-3。

表2-3处方正交设计因素水平表

2.2.4最佳制备条件验证

采用薄膜分散-超声法，按照最佳优化制备条件，制备隐形化雷公藤甲素纳米脂质体，检测脂质体的包封率和粒径，验证最佳制备条件。

将PEG-TP纳米脂质体混悬液超声分散，取1-2滴置于载玻片，室温晾干，于场发射扫描电镜(FESEM)下观察形态并拍照。将PEG-TP纳米脂质体稀释后，于激光粒度分析仪检测粒径大小粒度分布。

2.3实验结果与讨论

2.3.1隐形化雷公藤脂质体的制备方法的确定

分别采用薄膜分撒-超声法、机械匀浆法和乙醇注入法制备PEG-TP纳米脂质体。

不同制备方法制得的PEG-TP纳米脂质体包封率：薄膜分散-超声法>机械匀浆法>乙醇注入法。脂质体的粒度检测结果显示薄膜分散-超声法、机械匀浆法和乙醇注入法的PDI值分别为0.298＜0.319＜0.401，PDI值越小说明粒径分布的范围越窄，脂质体的粒径具有较好的规整度，由此表明薄膜分散-超声法制备得到的PEG-TP纳米脂质体粒径比较均一。

乙醇注入法是将脂质和药物的乙醇溶液快速注入到水相中，由于乙醇在水中被快速稀释，充分混合，从而形成小单层脂质体。采用本法制备的PEG-TP纳米脂质体的包封率为28.6％左右，低于其他两种方法。乙醇在基质中的浓度最高为7.5％，限制了分散脂质的量，因此导致制备得到的脂质体浓度相当低，且乙醇在脂质体中难以除去，故排除该法。

薄膜分散法是Bangham发明的一种用于制备的多层囊泡结构的经典方法，对于大部分药物有较好的包封效果，尤其适用于脂溶性药物的包裹^[63]。对各种磷脂水分散体进行超声处理是最早采用的处理两亲性脂质的机械方法之一，其中探头式超声是小规模制备纳米脂质体应用最广泛的方法。本实验采用薄膜分散-超声法制备的PEG-TP纳米脂质体的包封率为35.9％，是三种方法中最高的，且对应的粒径分布情况最佳。

机械匀浆法是在薄膜分散法制备空白脂质体基础上，将药物加入到PEG化空白脂质体悬液中，适当超声后进行涡旋震荡匀质。在机械作用下药物掺入脂质双分子层得到含药脂质体。虽然机械匀浆法方法简单、对仪器设备要求不高，但是制备的PEG-TP纳米脂质体的包封率为31.7％，稍低于薄膜分散-超声法。

综上所述，薄膜分散-超声法比较适用于制备PEG-TP纳米脂质体。

2.3.2隐形化雷公藤脂质体制备工艺的优化

1)磷脂和胆固醇比例的确定

按照不同磷脂/胆固醇(DSPC/Chol)比例制备的PEG化空白纳米脂质体，采用场发射扫描电镜观察，粒径分布没有明显的差别；置于4℃冰箱内保存，定期观察稳定性，结果见表2-4。实验中脂质体的稳定性，开始没有受到胆固醇比例增加的影响；但是，胆固醇的比例继续增加，使处方3制备的脂质体在放置第10天开始出现沉淀。

胆固醇具有双亲性分子，一段时亲水的羟基，另一端是甾醇环和疏水环基链。在脂质体中，胆固醇镶嵌于磷脂分子之间，胆固醇的羟基与磷脂的头基相结合，另一端插入双分子层疏水烷基链中。胆固醇与磷脂双分子层的作用分为两种：一种为羟基与磷脂头基间的氢键作用，另一种是甾醇环烷基链结构在磷脂疏水链之间的填充作用。适量的胆固醇可以增强脂质体膜的刚性，增加其稳定性，然而过量的胆固醇超过磷脂双分子层的可容纳程度，破坏双分子层的结果，降低脂质体的稳定性。

因此，从稳定性角度来看，最终选择DSPC/Chol(质量比)为2：1来制备PEG化空白纳米脂质体。

表2-4不同处方PEG化空白脂质体的稳定性

2)氯仿用量的确定

分别用10ml氯仿、20ml氯仿溶解处方量的氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺配置混合溶液I，将溶液I恒温水浴减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质薄膜，相比之下，氯仿用量为20ml的溶液I所形成的脂质薄膜更为均匀，没有结块。制备的隐形化空白纳米脂质体，采用动态光散射仪测定纳米脂质体的粒径分布，考察不同氯仿用量对脂质体粒径的影响。结果显示：10ml氯仿制备的脂质体粒径范围在40nm-650nm之间，平均粒径为165.75nm，20ml氯仿制备的脂质体粒径范围在40nm-430nm之间，平均粒径为125.99nm。说明适当增加氯仿用量，有利于改善脂质体的粒径分布。最终确定氯仿用量为20ml。

3)药脂比

固定其他条件不变，改变雷公藤甲素与磷脂的比例，按薄膜分散-超声法制得PEG-TP纳米脂质体，实验所得脂质体包封率与药脂比的关系见图3。

由图3可见，随着药脂比的增加，PEG-TP脂质体包封率逐渐增加；药脂比为1:50时，该脂质体的包封率最大；然后随着药脂比的增加，PEG-TP脂质体包封率逐渐减少。可见脂质体的包封率与药脂比有着直接关系，投药量过多，超出磷脂的承载能力，则无法形成稳定的脂质体，较高的包封率需要一个最佳的药脂比。

4)载药时间

其他反应条件不变，以不同的水合作用时间制备PEG-TP纳米脂质体，包封率与药脂比的关系见图4。

由图4可见，PEG-TP脂质体的包封率随水合时间延长而增加；当水合时间增加到60min时，PEG-TP脂质体的包封率达到最大值；随着水合时间的继续延长，PEG-TP脂质体的包封率逐渐降低。水合时间过长会对脂质体稳定性产生一定影响，较高的包封率需要一个适宜的载药时间。

5)载药温度

不同载药温度制备的PEG-TP纳米脂质体包封率与载药温度的关系见图5。可见随着载药温度的升高，PEG-TP脂质体的包封率先增大后又稍有降低，提示脂质体.包裹雷公藤甲素需要一个最佳温度。

2.3.3正交优化结果

表2-5正交实验的极差分析结果

正交实验结果见表2-5，包封率为指标对正交结果进行评价，由偏差分析结果可知载药温度、药脂比和载药时间这三种因素对包封率的影响大小先后顺序为B>C>A，表明药物和磷脂的质量比对PEG-TP纳米脂质体包封率的影响最大，载药温度影响最小。确定最佳制备条件为A₂B₂C₃，载药温度40℃、药脂比l：50、载药时间为60min。

2.3.4最佳制备条件验证

采用薄膜分散-超声法，按照最佳优化制备条件，制备PEG-TP纳米脂质体。扫描电镜照片可见，PEG-TP脂质体大小比较均匀，粒径范围大概为50-210nm，纳米粒之间无粘连，形态为圆形，比较规整。能谱仪(EDS)分析结果可知主要成分为C和O，可判断为脂质分子膜。

激光衍射粒度分析仪测定PEG-TP纳米脂质体的粒径平均粒径为112.5nm；粒径范围为55.9-227.5nm，与扫描电镜结果基本相符。

按照葡聚糖凝胶过滤-高效液相色谱法检测优化条件制得的PEG-TP纳米脂质体包封率，最后结果为52.69士1.82％。

制备脂质体所强调的不是膜组装，而是如何形成适当大小、包封率高和稳定性好的囊泡。制备方法的不同，脂质体的粒径、结构以及包封率都不尽相同，本研究首先筛选了制备PEG-TP纳米脂质体的最佳方法。确定了薄膜分散-超声法后，又根据单因素考察结果优化了该方法的制备工艺，初步解决了隐形化雷公藤甲素脂质体制备的技术问题。

隐形脂质体是近年来为了克服普通脂质体易被网状内皮系统识别吞噬而造成其体内循环时间短的缺陷发展起来的一种特殊类型的脂质体载体系统，它相对于普通脂质体在癌区有相对较高的浓度，盐酸多柔比星脂质体已成功用于临床。隐形脂质体药物的活性取决于表面活性物质和制剂工艺，因此对于隐形脂质体的研究都始于制备工艺的优化。李等采用薄膜分散法，以包封率、载药量和6h累积释放率为指标评价、优化处方，研制了依托泊苷隐形脂质体。仵等以孵化温度、孵化时间、透析时间、药脂比和硫酸铵浓度为主要影响因素，研究了硫酸铵梯度法制备苦参碱隐形脂质体工艺技术。

3.隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体的制备工艺研究

3.1实验材料

1)主要实验试剂见表3-1。

表3-1主要实验试剂

2)主要实验仪器：实验中涉及的实验仪器列于表3-2。

表3-2主要实验仪器

3)主要溶液配制

(1)SATP溶液的配制：精密称取SATP3.5mg溶于250μl DMSO中，浓度为14mg/ml。

(2)脱保护剂溶液的配制：精密称取1.74g盐酸羟氨和0.292g EDTA，溶于40ml去离子水中，用1mol/l NaOH溶液调节pH至7.5，用去离子水定容至50ml。

(3)考马斯亮蓝G-250溶液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95％乙醇，加入100ml 85％的磷酸，用蒸馏水补充至1000ml，置棕色瓶中密塞，4℃冰箱内保存备用。

(4)蛋白质对照品溶液的配制：精密称取乳铁蛋白1.0mg，用少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水稀释至10ml，即为0.1mg/ml蛋白质对照品溶液，4℃冰箱内保存备用。

(5)样品溶液的配制：精密吸取离心后的Lf-PEG-TP脂质体上清液0.5ml，加蒸馏水稀释至100ml，即得样品溶液。

3.2实验方法

3.2.1隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体制备工艺

分别精密称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1)作为制备脂质体的膜材，以及雷公藤甲素(磷脂总质量的1/5)，溶于30ml氯仿/甲醇(体积比2/1)混合溶剂中；将该溶液置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发除去有机溶剂；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，将15ml PBS(pH7.4)缓冲溶液加入圆底烧瓶，于40℃恒温水浴上旋转水合60min，使脂质体膜脱落，得混悬液；冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG-TP纳米脂质体。

采用共价偶联法对已制备的PEG-TP纳米脂质体进行脑靶向修饰，先用SATP试剂将Lf进行巯基化：将适量的Lf和SATP溶液混合，加入PBS缓冲溶液(pH7.4)，搅拌反应30min，反应结束后以10K超滤管在转速为4000r/min条件下超滤4次；再将巯基化的Lf溶于去离子水配制成一定浓度的Lf溶液；37℃恒温磁力搅拌下，将Lf溶液按等体积缓慢加入PEG-TP纳米脂质体混悬液中，孵育一定的时间，制得Lf-PEG-TP纳米脂质体。

1)Lf浓度对Lf-PEG-TP脂质体中Lf偶联百分率的影响

按照上述脂质体的制备方法，分别加入浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml的Lf溶液，制备Lf-PEG-TP纳米脂质体，考察不同Lf浓度对Lf-PEG-TP纳米脂质体中Lf偶联百分率的影响。

2)孵育时间对Lf-PEG-TP脂质体中偶联百分率的影响

按照上述脂质体的制备方法，分别孵育1.0h、2.0h、3.0h、4.0h和5.0h，制备Lf-PEG-TP纳米脂质体，考察不同孵育时间对Lf-PEG-TP纳米脂质体中Lf偶联百分率的影响。

3.2.2隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体的表征

1)Lf-PEG-TP纳米脂质体形貌观察和粒径检测

将制备的Lf-PEG-TP纳米脂质体于激光粒度分析仪上测量粒径；场发射扫描电镜下，观察脂质体的的大小、形状及分散性等性质。

2)考马斯亮蓝法测乳铁蛋白含量

建立工作曲线回归方程：分别精密吸取蛋白质对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8ml，置于10ml具塞试管中；分别加入蒸馏水至1ml，加入考马斯亮蓝G-250溶液4ml，混匀，放置10min，于紫外-可见分光光度仪595nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，进行线性回归，建立工作曲线回归方程。

取样品溶液0.5ml，同时作5个重复，以随行试剂为空白，按照上述方法分别于紫外-可见分光光度仪595nm波长测定吸光度，代入工作曲线回归方程，计算样品中蛋白质含量。

3)Lf-PEG-TP纳米脂质体Lf偶联百分率的测定

取制备的Lf-PEG-TP脂质体悬浮液，在10000rpm下离心30min，取上清，使用考马斯亮蓝法测定上清液游离蛋白含量，按下式计算脂质体中Lf偶联百分率：

式中W_总表示脂质体混悬液中Lf总量，W_游表示游离的Lf质量。

3.3实验结果与讨论

1)考马斯亮蓝法测乳铁蛋白含量

考马斯亮蓝法测乳铁蛋白含量，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，进行线性回归，建立工作曲线回归方程，表明蛋白质在10-80μg/ml浓度范围内与吸光度之间符合Lamber-Beer定律。

考马斯蓝染色法又称Bradford法，是Bradford于1976年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当棕红色的考马斯亮蓝G-250染料的阴离子与蛋白质分子多肽链中具有酰胺基结构结合后，相互作用形成染色复合物，使溶液的颜色由棕红色变为蓝色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。Bradford法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，正得到越来越广泛的应用。本发明采用Bradford法测定游离乳铁蛋白的含量，操作快捷、经济且结果较为准确。

2)Lf浓度对Lf-PEG-TP脂质体中Lf偶联百分率的影响

以不同浓度的Lf溶液制备Lf-PEG-TP纳米脂质体，考察Lf浓度对Lf-PEG-TP纳米脂质体中Lf偶联百分率的影响，Lf溶液与脂质体偶联百分率的关系曲线见图6。

随着Lf溶液浓度的增加，Lf-PEG-TP脂质体中偶联百分率逐渐升高；当Lf溶液浓度为2.0mg/ml时，脂质体的偶联百分率达到最大值：随着Lf溶液浓度的继续增加，Lf-PEG-TP脂质体中偶联百分率开始下降。

3)孵育时间对Lf-PEG-TP脂质体中偶联百分率的影响

采用不同浓度的孵化时间制备Lf-PEG-TP纳米脂质体，考察孵化时间对Lf-PEG-TP纳米脂质体中Lf偶联百分率的影响，结果见图7。

随着孵育时间的延长，Lf-PEG-TP脂质体中偶联百分率逐渐升高；当孵育时间达到4.0h时，脂质体的偶联百分率达到最大值：随着孵育时间的继续延长，Lf-PEG-TP脂质体中偶联百分率开始下降。

Lf浓度和孵育时间对Lf-PEG-TP脂质体中Lf偶联百分率的影响呈相似的趋势，说明在Lf溶液浓度为2.0mg/ml和孵育时间达到4.0h时，Lf在Lf-PEG-TP脂质体中的吸附趋向饱和。肖等构建受体介导的脑靶向姜黄素纳米脂质载体，将Lf通过静电作用吸附在脂质体表面，分析了Lf溶液度和温孵时间对脂质体表面吸附Lf的影响，结果显示乳铁蛋白与姜黄素纳米脂质载体的静电吸附作用存在一个吸附与解吸附的过程，当乳铁蛋白浓度为2.0mg/ml、温孵时间为6h时，乳铁蛋白在姜黄素纳米脂质载体表面的吸附趋于饱和。

4)隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体的表征

按照隐形化雷公藤甲素纳米脂质体的制备条件，将Lf以共价偶联的方式连接在脂质体表面，Lf溶液浓度为2.0mg/ml，孵育时间为4.0h，制备Lf-PEG-TP脂质体。粒径测量结果表明，以优化工艺制备的Lf-PEG-TP脂质体粒径均匀、大小适中的空白脂质体，平均粒径为105.98±2.65nm，PEG-TP脂质体接上脑靶向头基乳铁蛋白后，形状、粒径、分散度均未发生明显改变。场发射扫描电镜照片可知Lf-PEG-TP脂质体形状规则、边界圆整、分散度好，与PEG-TP脂质体形状相似。葡聚糖凝胶过滤-高效液相法测得Lf-PEG-TP脂质体的包封率为55.96±2.13％。考马斯亮蓝法测乳铁蛋白含量，计算得出Lf-PEG-TP脂质体中Lf偶百分率为79.26±3.57％。

Lf-PEG-TP脂质体中，带正电的乳铁蛋白及其肽段通过静电相互作用与带负电的脂质体相互吸引并结合，同时通过化学偶联连接在脂质体表面。优选偶联反应条件：Lf浓度和孵育时间，提高了脂质体表面的乳铁蛋白连接率，为Lf-PEG-TP脂质体更多的通过血液循环单向转运进入病理性脑部间隙奠定了基础。

随着对主动靶向策略研究的不断深入，乳铁蛋白作为一种安全、有效、新型的脑靶向功能分子备受人们的青睐。李等将苯甲酰胺类衍生物(125I-AIBZM)包载于纳米脂质体载药系统，采用化学偶联的方式制备了125I-AIBZM纳米脂质体和125IAIBZM-Lf纳米脂质体，通过小鼠荧光活体成像实验证实了Lf介导脑靶向的功能。Chen等构建了乳铁蛋白载阿霉素前阳离子脂质体(DOX-Lf-PCL)，用以治疗胶质瘤，采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术来评价不同DOX处方在BCECs和胶质瘤细胞C6的摄取率，体外试验结果表明DOX-Lf-PCLs比其它剂型更有效的限制了C6细胞的增长；并带正电的Lf通过静电吸附作用修饰带有负电荷的前体阳离子脂质体(Lf-PCL)，通过受体和吸附的双重介导达到了脑部靶向的目的。乳铁蛋白修饰的脂质体载体药物有望成为治疗老年性痴呆、帕金森症等神经退行性疾病的有效药物。

4.结论

本发明通过对制备工艺的优化，成功制备了粒径分布均匀、包封率较高、稳定性好的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体，相关结果未见文献报道。

本发明葡聚糖凝胶过滤-高效液相色谱法检测操作简单，精密度高、重复性良好，适用于Lf-PEG-TP脂质体的包封率的测定。

本发明薄膜分散-超声法制备Lf-PEG-TP纳米脂质体的最佳工艺条件：载药温度为40℃，载药时间为60min，药脂比为l：50，Lf溶液浓度为2.0mg/ml，孵育时间4.0h；制备的Lf-PEG-TP纳米脂质体平均粒径为105.98±2.65nm，包封率为55.96±2.13％，Lf偶百分率为79.26±3.57％。

图6是本发明实施例提供的Lf浓度对Lf-PEG-TP脂质体中Lf偶联百分率的影响图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP，其特征在于，采用共价偶联法将脑靶向配体Lf连接到PEG-TP纳米脂质体表面制得隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP，所述隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP，以纳米雷公藤甲素脂质体为药物载体，用聚乙二醇PEG进行隐形化修饰制得；

隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP的制备方法包括：选择薄膜分散-超声法；磷脂/胆固醇比为2：1；氯仿用量为20ml；载药温度为40℃；载药时间为60min；药脂比为l：50；按质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1分别称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为制备脂质体的膜材，以及为氢化大豆卵磷脂总质量的1/50的雷公藤甲素；溶于体积比为2/1的氯仿/甲醇混合溶剂中；将该混合溶剂置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，将15mlPBS缓冲溶液加入圆底烧瓶，于40℃恒温水浴上旋转水合60min；使脂质体膜脱落，得混悬液；冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG-TP纳米脂质体；其中所述40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿中，旋转速度为100rpm；所述将15ml PBS缓冲溶液加入圆底烧瓶中，pH为7.4；采用共价偶联法对已制备的PEG-TP纳米脂质体进行脑靶向修饰；先用SATP试剂将Lf进行巯基化：将适量的Lf和SATP溶液混合，加入PBS缓冲溶液，搅拌反应30min；反应结束后以10K超滤管在转速为4000r/min条件下超滤4次；再将巯基化的Lf溶于去离子水配制成2.0mg/ml浓度的Lf溶液；37℃恒温磁力搅拌下，将Lf溶液按等体积缓慢加入PEG-TP纳米脂质体混悬液中，孵育4.0h，制得Lf-PEG-TP纳米脂质体。

2.如权利要求1所述的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP，其特征在于，所述隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP包封率的检测方法采用凝胶柱过滤法测定隐形化雷公藤甲素纳米脂质体PEG-TP的包封率，具体包括：预装柱：称取葡聚糖凝胶SephadexG-505g，加入蒸馏水100ml浸泡过夜，置90℃溶胀2h，室温过夜，使之完全溶胀；在不断搅拌下缓缓加入一根底部装有筛板1cm×25cm的玻璃层析柱，除尽气泡；加入50mlpH7.4的PBS平衡过夜，3倍～4倍柱体积的PBS冲洗备用；洗脱曲线的绘制：取制备好的隐形化雷公藤甲素脂质体lml上柱，用pH7.4的PBS洗脱，速率1ml/min；收集洗脱液，每管2ml，进液相测定，记录峰面积，计算浓度，绘制洗脱曲线；Sephadex G-50凝胶柱对游离药物回收率的分析：配制浓度0.20mg/ml的雷公藤甲素甲醇溶液，挥干甲醇；加入PBS溶液1ml，超声降低药物颗粒，并涡旋震荡促使其溶解；上柱，洗脱，收集游离药物，进液相测定，记录峰面积，计算柱回收率；

包封率的测定：取待测包封率的隐形化雷公藤甲素脂质体lml上柱，洗脱分离，过滤分离隐形化雷公藤甲素脂质体后，分管收集脂质体和游离药物，按下式计算包封率：

式中W_总表示脂质体混悬液中雷公藤甲素总量，W_游表示游离的雷公藤甲素量。

3.如权利要求1所述的隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP，其特征在于，所述隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP Lf偶联百分率的测定方法，其特征在于，所述Lf偶联百分率的测定方法包括：取制备的Lf-PEG-TP脂质体悬浮液，在10000rpm下离心30min，取上清，使用考马斯亮蓝法测定上清液游离蛋白含量，按下式计算脂质体中Lf偶联百分率：

式中W_总表示脂质体混悬液中Lf总量，W_游表示游离的Lf质量。

4.一种如权利要求1所述隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP的制备方法，其特征在于，所述隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP的制备方法具体包括：按质量比为HSPC：Chol：DSPE-PEG2000＝4：2：1分别称取氢化大豆卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为制备脂质体的膜材，以及为磷脂总质量的1/50的雷公藤甲素；溶于20ml体积比为2/1的氯仿/甲醇混合溶剂中；将该混合溶剂置于l00ml磨口圆底烧瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发，除去氯仿；至圆形瓶壁上形成均匀脂质薄膜，将15mlPBS缓冲溶液加入圆底烧瓶，于40℃恒温水浴上旋转水合60min；使脂质体膜脱落，得混悬液；冰浴下，探针超声，工作2秒，停3秒，共超声10分钟；0.22μm微孔滤膜，即得PEG-TP纳米脂质体；采用共价偶联法对已制备的PEG-TP纳米脂质体进行脑靶向修饰；先用SATP试剂将Lf进行巯基化：将适量的Lf和SATP溶液混合，加入PBS缓冲溶液，搅拌反应30min；反应结束后以10K超滤管在转速为4000r/min条件下超滤4次；再将巯基化的Lf溶于去离子水配制成2.0mg/ml浓度的Lf溶液；37℃恒温磁力搅拌下，将Lf溶液按等体积缓慢加入PEG-TP纳米脂质体混悬液中，孵育4.0h，制得Lf-PEG-TP纳米脂质体。

5.如权利要求4所述隐形化脑靶向雷公藤甲素纳米脂质体Lf-PEG-TP的制备方法，其特征在于，所述加入PBS缓冲溶液pH为7.4。

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