CN102258475B - 黄豆苷元固体脂质纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种疏水性药物黄豆苷元的固体脂质纳米粒及其制备方法。所述固体脂质纳米粒平均粒径小于100nm，按重量份计，包含：黄豆苷元1份、磷脂5～30份、表面活性剂1～50份和固体脂质材料1-40份，其中，黄豆苷元和磷脂形成复合物，被固体脂质或者固体脂质和磷脂包载。该黄豆苷元固体脂质纳米粒以薄膜分散法或热熔分散法制得。本发明首先将黄豆苷元与磷脂形成复合物，然后进一步包载于固体脂质纳米粒中，以克服黄豆苷元制备过程中的溶解性差、稳定性差、制备困难的难题；其平均粒径小于100nm，8小时体外释放达到58.4％，口服生物利用度高；可进一步制备成包括胶囊、口服混悬液、口服液等口服制剂，为患者服药提供方便。

Description

黄豆苷元固体脂质纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种疏水性药物黄豆苷元固体脂质纳米粒以及该固体脂质纳米粒的制备方法。

背景技术

黄豆苷元(Daidzein，又名大豆黄素)是一种异黄酮类化合物，主要存在于豆科植物野葛和粉葛的干燥根或大豆中，具有扩张冠状动脉、股动脉、脑动脉，增加血流量的作用，能降低心肌耗氧量，改善冠脉血流量。临床上主要用于心脑血管疾病的治疗，对高血压、冠心病、脑血栓、脑损伤、预防动脉硬化、脑缺血等具有确切疗效，还可用于更年期综合症、心绞痛、心肌梗塞、老年痴呆、骨质疏松等疾病的预防和治疗。但是，黄豆苷元几乎不溶于水，而且脂溶性也很差，在乙醇中的溶解度仅为0.1mg/mL，属于水溶性和脂溶性均较差的药物。据文献报道，黄豆苷元口服生物利用度极低，大鼠体内口服生物利用度仅为6.1％，严重限制了黄豆苷元在临床上的应用，其主要原因在于溶解性差和胃肠道中的代谢。目前，提高黄豆苷元溶解性和口服生物利用度的策略主要有：①对黄豆苷元进行结构改造，即以甲氧基、羟基、氨基、乙酰氨基等基团对异黄酮结构的4位或7位进行取代；②环糊精包合技术或固体分散体技术增加黄豆苷元的水溶性，提高黄豆苷元的口服生物利用度。

固体脂质纳米粒主要由天然或者合成的固体脂质材料组成，具有良好的生物相容性，能够包载水难溶性药物，提高其口服吸收。常规的固体脂质纳米粒制备方法为溶剂蒸发法、微乳法、高压乳化法等。制备过程中，需要将药物溶于合适的药剂学上能够接受的有机溶剂中，但是黄豆苷元在这些溶剂中的溶解度均很差，很难直接将其制备成固体脂质纳米粒。

因此，本发明首先将黄豆苷元与磷脂形成复合物，然后进一步包载于固体脂质纳米粒中，以克服黄豆苷元制备过程中的溶解性差、稳定性差、制备困难的难题，提高药物的口服生物利用度。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种粒径小于100nm的黄豆苷元固体脂质纳米粒，它能改善黄豆苷元的溶解度、溶出度和稳定性，从而提高其口服生物利用度。

本发明的另一个目的在于提供上述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法。

根据本发明的一个目的，本发明提供了一种黄豆苷元固体脂质纳米粒，按重量份计，该固体脂质纳米粒包含：

黄豆苷元          1份；

磷脂              5～30份；

表面活性剂        1～50份；

固体脂质          1～40份；

其中，黄豆苷元和磷脂形成复合物，被固体脂质或者固体脂质和磷脂包载。

优选地，本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒，按重量份计，该固体脂质纳米粒包含：

黄豆苷元          1份；

磷脂              5～25份；

表面活性剂        5～40份；

固体脂质          1～30份。

更优选地，本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒，按重量份计，该固体脂质纳米粒包含：

黄豆苷元            1份；

磷脂                10～20份；

表面活性剂          10～30份；

固体脂质            1～20份。

本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒的平均粒径小于100nm，并优选小于90nm，更优选30～80nm。

其中，所述磷脂选自天然或合成的磷脂中，选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和氢化蛋黄卵磷脂之中，优选的是，所述大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥70％，蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥70％，氢化大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥80％，氢化蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥80％。

所述表面活性剂选自油酸钠、吐温80、吐温20、HS-15(聚乙二醇15羟硬脂酸酯)、普朗尼克F68和普朗尼克F127中。

所述固体脂质选自硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、棕榈酸、单棕榈酸甘油酯、二棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯和山嵛酸甘油酯等中。

本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒，按照药剂学上的常规方法，可进一步制备成口服制剂或注射制剂，包括胶囊、口服混悬液、口服液、注射液、注射用冻干粉针。

根据本发明的另一个目的，本发明提供了上述黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，包括薄膜分散法和热熔分散法。

方法一  薄膜分散法，主要包括以下步骤：

(1)取1重量份黄豆苷元和4-15重量份的磷脂，加入适量有机溶剂分散，得到一反应液，其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物；

(2)对步骤(1)得到的反应液在磁力搅拌下加热回流2～24小时，然后回收有机溶剂，得固体或半固体残留物；

(3)将步骤(2)得到的残留物真空干燥以除去残留有机溶剂，即得黄豆苷元与磷脂的复合物；

(4)取步骤(3)得到的黄豆苷元与磷脂的复合物、构成5～30重量份的剩余的磷脂、1～50重量份表面活性剂和1～40重量份固体脂质成分，溶解于有机溶剂中，然后减压旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜，其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷或其混合物；

(5)向步骤(4)得到的薄膜中加入蒸馏水，水浴加热并振摇，将薄膜洗脱下来，制得乳白色混悬液；

(6)将制得的乳白色混悬液采用探头超声处理，或者采用高压均质的方法均质，即得无色透明或者淡蓝色乳光的固体脂质纳米粒悬液。

其中，在步骤(1)中，所述有机溶剂的用量应使黄豆苷元的浓度为50～7000μg/mL，优选为1500～5000μg/mL。

在步骤(2)中，所述加热温度为40℃～60℃，并采用减压回流反应2～24小时。

在步骤(3)中，所述真空干燥时间为2～48小时。

在步骤(5)中，所述蒸馏水的温度与水浴温度相同，水浴温度比固体脂质材料熔融温度高0～10℃。

在步骤(6)中，所述超声处理时间为10～600s；或者高压均质压力为5000～22000psi，均质次数为2～20次。

方法二  热熔分散法，主要包括以下步骤：

(1)取1重量份黄豆苷元和4-15重量份的磷脂，加入适量有机溶剂分散，得到一反应液，其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物；

(2)对步骤(1)得到的反应液在磁力搅拌下加热回流2～24小时，然后回收有机溶剂，得固体或半固体残留物；

(3)将步骤(2)得到的残留物真空干燥以除去残留有机溶剂，即得黄豆苷元与磷脂的复合物；

(4)将1～40重量份的固体脂质加热熔融；

(5)将步骤(3)得到的黄豆苷元与磷脂的复合物和构成5～30重量份的剩余的磷脂溶解于有机溶剂中，然后加入到熔融的固体脂质中，不断搅拌除去有机溶剂，得到一均匀固体脂质混合物；其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或其任意混合物；

(6)将1～50重量份的表面活性剂溶于蒸馏水中，加热至温度比固体脂质熔融温度高0～10℃；

(7)将上述步骤(6)得到的含有表面活性剂的水溶液在不断搅拌下加入到上述步骤(5)得到的熔融的固体脂质混合物中，然后继续搅拌，得乳白色混悬液；

(8)将制得的乳白色混悬液采用探头超声处理，或者采用高压均质的方法均质，即得无色透明或者淡蓝色乳光的固体脂质纳米粒悬液。

其中，在步骤(1)中，所述有机溶剂的用量应使黄豆苷元的浓度为50～7000μg/mL，优选为1500～5000μg/mL。

在步骤(2)中，所述加热温度为40℃～60℃，并采用减压回流反应2～24小时。

在步骤(3)中，所述真空干燥时间为2～48小时。

在步骤(4)中，所述加热温度为所用固体脂质熔点以上0～10℃。

在步骤(5)中，将步骤(3)得到的黄豆苷元与磷脂的复合物和构成5～30重量份的剩余的磷脂溶解于有机溶剂中，其中有机溶剂的用量为使黄豆苷元与磷脂的复合物和构成5～30重量份的剩余的磷脂溶解的最小用量。

在步骤(6)中，采用水浴加热，加热温度比固体脂质材料熔融温度高0～10℃。

在步骤(8)中，所述超声处理时间为10～600s；或者高压均质压力为5000～22000psi，均质次数为2～20次。

本发明提供的黄豆苷元与磷脂的复合物显著提高了药物的亲水性和亲脂性，克服了黄豆苷元固体脂质纳米粒制备困难的缺点，而且能够促进药物在胃肠道的吸收，进一步包载于固体脂质纳米粒中，减少了药物与外界环境的接触，提高了药物的稳定性，减少了药物在胃肠道中的代谢；本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒平均粒径小于100nm，有助于增加药物对细胞膜的粘附能力，改善药物在胃肠道的吸收特性，这些特点使得本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒体内生物利用度显著提高。

本发明先将黄豆苷元与磷脂制备成复合物，然后再与磷脂、表面活性剂和固体脂质结合制备成黄豆苷元固体脂质纳米粒。经测定，其平均粒径小于100nm，并优选小于90nm，更优选为30～80nm，8小时体外释放达到58.4％。SD大鼠体内药动学结果表明，与黄豆苷元混悬液相比，口服生物利用度提高了6.8倍。

本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒，大鼠体内口服生物利用度有极显著提高，因而，可进一步制备成包括胶囊、口服混悬液、口服液等口服制剂，为患者服药提供方便。同时，由于该固体脂质纳米粒的粒径均小于100nm，可过滤灭菌供注射使用，制成注射液和注射用冻干粉针等制剂，为黄豆苷元的临床应用增加一条给药途径。

附图说明

图1为常规方法制备的黄豆苷元混悬液和本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒的释放曲线。

图2为本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒的粒径分布谱图(其中，横坐标的单位为nm；纵坐标的单位为％)。

图3为常规方法制备的黄豆苷元混悬液和本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒在大鼠体内的平均血药浓度-时间曲线。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

制备实施例

黄豆苷元原料来源于陕西慧科植物开发有限公司；

大豆卵磷脂来源于上海太伟药业有限公司；蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和氢化蛋黄卵磷脂来源于德国Lipoid公司，其中，大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥70％，蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥70％，氢化大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥80％，氢化蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥80％。

油酸钠来源于上海试剂一厂；吐温20、吐温80、单硬脂酸甘油酯、棕榈酸甘油酯、硬脂酸、棕榈酸来源于国药集团化学试剂有限公司；HS-15、普朗尼克F68、普朗尼克F127来源于德国BASF公司；山嵛酸甘油酯来源于法国佳法赛公司，二硬脂酸甘油酯、二棕榈酸甘油酯来源于美国Accustandard公司。

实施例1

组成：

黄豆苷元            100mg

大豆卵磷脂            1.0g

油酸钠                1.0g

山嵛酸甘油酯          0.2g

制备方法：采用薄膜超声分散法制备，具体制备操作如下：

取黄豆苷元100mg和大豆卵磷脂0.5g，加入100mL甲醇，50℃下减压回流，同时维持温度磁力搅拌2小时，然后减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体残留物，真空干燥12小时，得到黄豆苷元与磷脂的复合物；

向黄豆苷元与磷脂的复合物中加入大豆磷脂0.5g、油酸钠1.0g、山嵛酸甘油酯0.2g，将其溶解于20mL二氯甲烷中，然后旋转蒸发成薄膜；向薄膜中加入20mL预热为50℃的蒸馏水，在50℃水浴中水平振摇5min得乳白色混悬液，探头(JYD-650智能型超声波细胞粉碎机)超声90s，即得无色透明的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液。

测得其平均粒径35.3nm，包封率72.66％，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的12小时累积释放率为79.4％。

实施例2

组成：

黄豆苷元                100mg

蛋黄卵磷脂              1.0g

油酸钠                  1.0g

单硬脂酸甘油酯          0.5g

制备方法：采用薄膜-高压均质法制备，具体制备操作如下：

取黄豆苷元100mg和蛋黄卵磷脂0.5g，加入100mL甲醇，50℃下减压回流，同时维持温度磁力搅拌4小时，然后减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体残留物，真空干燥8小时，得到黄豆苷元与磷脂的复合物；

向黄豆苷元与磷脂的复合物中加入蛋黄卵磷脂0.5g、油酸钠1.0g、单硬脂酸甘油酯0.5g，溶解于50mL甲醇中，然后旋转蒸发成薄膜；向薄膜中加入20mL预热为50℃的蒸馏水，在50℃水浴中水平振摇5min得乳白色混悬液，然后高压均质5次(压力为10000～20000psi)，即得黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液。

测得其平均粒径44.9nm，包封率91.73％，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的8小时累积释放率为58.4％。

实施例3

组成：

黄豆苷元            100mg

氢化大豆卵磷脂      1.0g

吐温80              1.0g

硬脂酸              0.5g

制备方法：采用热熔-高压均质法制备，具体制备操作如下：

取黄豆苷元100mg和氢化大豆卵磷脂0.6g，加入100mL甲醇，50℃下减压回流，同时维持温度磁力搅拌6小时，然后减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体残留物，真空干燥10小时，得到黄豆苷元与磷脂的复合物；

向黄豆苷元与磷脂的复合物中加入氢化大豆磷脂0.4g，溶于5mL氯仿中，然后加入到熔融的硬脂酸(0.5g，80℃)中，混合均匀，不断搅拌，挥去有机溶剂，得到混合均匀的固体脂质混合物；

同时将1.0g吐温80溶于50mL蒸馏水中，水浴加热到80℃，然后加入到上述混合均匀的固体脂质混合物中，搅拌10min，得乳白色混悬液，然后高压均质5-10次(压力为10000～20000psi)，即得黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液。

测得其平均粒径62.8nm，包封率90.34％，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的12小时累积释放率为66.9％。

实施例4

组成：

黄豆苷元                100mg

氢化蛋黄卵磷脂          2.0g

普朗尼克F68             1.0g

棕榈酸                  1.0g

制备方法：采用热熔-超声分散法制备，具体制备操作如下：

取黄豆苷元100mg和氢化蛋黄卵磷脂1.0g，加入150mL甲醇，60℃下减压回流，同时维持温度磁力搅拌12小时，减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体残留物，真空干燥24小时，得到黄豆苷元与磷脂的复合物；

向黄豆苷元与磷脂的复合物中加入氢化蛋黄卵磷脂1.0g，溶解于5mL氯仿中，然后加入到熔融的棕榈酸(1.0g，80℃)中，混合均匀，不断搅拌，挥去有机溶剂，得到混合均匀的固体脂质混合物；

同时将1.0g普朗尼克F68溶于50mL蒸馏水中，水浴加热到80℃，然后加入到上述混合均匀的固体脂质混合物中，搅拌10～15min，得乳白色混悬液，然后探头超声300s，即得带有淡蓝色乳光的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液。

测得其平均粒径78.9nm，包封率88.96％，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的12小时累积释放率为75.3％。

实施例5

组成：

黄豆苷元                100mg

大豆卵磷脂            1.0g

吐温20                3.0g

山嵛酸甘油酯          2.0g

制备方法：采用热熔-超声分散法制备，具体制备操作如下：

取黄豆苷元100mg和大豆卵磷脂1.0g，加入200mL甲醇，50℃下减压回流，同时维持温度磁力搅拌6小时，减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体残留物，真空干燥8小时，得到黄豆苷元与磷脂的复合物；

将黄豆苷元与磷脂的复合物溶于10mL氯仿中，然后滴加到熔融的山嵛酸甘油酯(2.0g，80℃)中，混合均匀，不断搅拌，挥去有机溶剂，得到混合均匀的固体脂质混合物；

同时将3.0g吐温20溶于50mL蒸馏水中，水浴加热到80℃，然后加入到上述混合均匀的固体脂质混合物中，搅拌10-15min，得乳白色混悬液，然后探头超声270s，即得带有淡蓝色乳光的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液。

测得其平均粒径56.2nm，包封率90.65％，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的12小时累积释放率为65.4％。

实施例6

组成：

黄豆苷元            100mg

蛋黄卵磷脂          1.0g

HS-15               2.0g

单棕榈酸甘油酯      0.5g

制备方法：采用薄膜超声分散法制备，具体制备操作如下：

取黄豆苷元100mg和蛋黄卵磷脂0.5g，加入100mL甲醇，50℃下减压回流，同时维持温度磁力搅拌2小时，减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体残留物，真空干燥24小时，得到黄豆苷元与磷脂的复合物；

向黄豆苷元与磷脂的复合物中加入蛋黄卵磷脂0.5g、HS-152.0g、单棕榈酸甘油酯0.5g，溶解于50mL氯仿/甲醇(氯仿、甲醇的体积比为2∶1)中，旋转蒸发成薄膜，向薄膜中加入20mL预热为80℃的蒸馏水，80℃水浴中水平振摇5-10min得乳白色混悬液，然后探头超声300s，即得黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液。

测得其平均粒径71.6nm，包封率92.37％，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的12小时累积释放率为71.1％。

实施例7

组成：

黄豆苷元            100mg

大豆卵磷脂          1.0g

普朗尼克F127        2.0g

二硬脂酸甘油酯      0.5g

制备方法：采用热熔-超声分散法制备，具体制备操作如下：

取黄豆苷元100mg和大豆卵磷脂1.0g，加入200mL四氢呋喃，50℃下减压回流，同时维持温度磁力搅拌4小时，减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体残留物，真空干燥8小时，得到黄豆苷元与磷脂的复合物；

将上述黄豆苷元与磷脂的复合物加入10mL二氯甲烷中溶解，然后滴加到熔融的二硬脂酸甘油酯(0.5g，80℃)中，混合均匀，不断搅拌，挥去有机溶剂，得混合均匀的固体脂质混合物；同时将2.0g普朗尼克F127溶于50mL蒸馏水中，水浴加热到80℃，然后加入到上述混合均匀的固体脂质混合物中，搅拌10-15min，得乳白色混悬液，然后探头超声360s，即得带有淡蓝色乳光的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液。

测得其平均粒径66.3nm，包封率92.65％，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的12小时累积释放率为69.5％。

实施例8

组成：

黄豆苷元            100mg

大豆卵磷脂          1.0g

吐温80              1.5g

二棕榈酸甘油酯      0.5g

制备方法：采用热熔-高压均质法制备，具体制备操作如下：

取黄豆苷元100mg和大豆卵磷脂1.0g，加入200mL四氢呋喃/二氧六环混合溶液(四氢呋喃、二氧六环的体积比为3∶1)中，50℃下减压回流，同时维持温度磁力搅拌6小时，减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到固体残留物，真空干燥6小时，得黄豆苷元与磷脂的复合物；

将上述黄豆苷元与磷脂的复合物溶于10mL乙酸乙酯/氯仿混合溶剂中(乙酸乙酯、氯仿的体积比是1∶3)，然后滴加到熔融的二棕榈酸甘油酯(0.5g，80℃)中，混合均匀，不断搅拌挥去有机溶剂，得混合均匀的固体脂质混合物；

同时将1.5g吐温80溶于50mL蒸馏水中，水浴加热到80℃，然后加入到上述混合均匀的固体脂质混合物中，搅拌10-15min，得乳白色混悬液，然后高压均质5-10次(压力为10000～22000psi)，即得黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液。

测得其平均粒径54.7nm，包封率91.42％，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的12小时累积释放率为70.2％。

测试实施例

下面通过对本发明实施例1-8制备的黄豆苷元脂质纳米粒的各种测定实验，进一步说明本发明所提供的黄豆苷元脂质纳米粒的优点。

一、本发明黄豆苷元固体脂质纳米粒包封率的测定：

实施例9

取本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液1mL加入超滤管(膜截留分子量3KDa)，于4000×g、4℃下离心超滤30min，移取滤液，HPLC分析，记录峰面积，并按外标法计算游离药物的量(W)；另取本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液1mL，置于5mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，HPLC分析，记录峰面积，并按外标法计算总药量(W₀)。

包封率％＝(1-W/W₀)×100％。

其中，HPLC分析条件：安捷伦1100；色谱柱：ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(35∶65，v/v)；检测波长：248nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min。

本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒包封率为91.73％。

实施例10

将本发明实施例1、3～8制备得到黄豆苷元固体脂质纳米粒，分别按照实施例9所述的相同方法，测定其包封率，测定结果见下表：

试验样品来源	包封率
		实施例1	72.66％
实施例3	90.34％
		实施例4	88.96％
实施例5	90.65％
		实施例6	92.37％
实施例7	92.65％

实施例8

91.42％

二、本发明黄豆苷元固体脂质纳米粒的体外释放试验

实施例11

取黄豆苷元混悬液(按照常规方法制备：取黄豆苷元混悬于质量浓度为0.5％的羧甲基纤维素钠的水溶液中，并使其中黄豆苷元的浓度与所测黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液中黄豆苷元的浓度相同，制得黄豆苷元混悬液)和本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液各1mL，分别密封于透析袋中(截留分子量MWCO＝12K)，然后将两个透析袋分别置于含有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝6.8，37℃)的锥形瓶中，37℃恒温振荡(THZ-C恒温振荡器，转速为100rpm)，于0、0.5、1、2、3、4、6、8小时各从锥形瓶中取样1.0mL，每次取样后补充1.0mL相同温度的磷酸盐缓冲液至锥形瓶中。

采用高效液相色谱法测定各次取样溶液中黄豆苷元的浓度，测定方法如下：高效液相色谱仪：安捷伦1100；色谱柱：ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(35∶65，v/v)；检测波长：248nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min。

以常规方法制备的黄豆苷元混悬液及本发明实施例2制备的固体脂质纳米粒体外释放曲线见附图1。结果可见：8小时黄豆苷元混悬液体外释放只有10％，而本发明的黄豆苷元脂质纳米粒的体外释放则超过50％，因而本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒的体外释放大大增加。

实施例12

将本发明制备实施例1、3～8得到黄豆苷元固体脂质纳米粒，分别按照实施例11所述的相同方法，进行体外释放试验，试验结果见下表所示：

试验样品来源	在pH6.8的磷酸盐缓冲液中的12小时累积释放率
		实施例1	79.4％
实施例3	66.9％
		实施例4	75.3％
实施例5	65.4％
		实施例6	71.1％
实施例7	69.5％
		实施例8	70.2％

三、粒径测定

实施例13

取本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液1mL，用蒸馏水稀释10倍，以NICOMP 380ZLS粒径测定仪测定其粒径。结果见附图2。可以看出，本发明实施例2制备的黄豆苷元脂质纳米粒的平均粒径为44.9nm。

实施例14

将本发明制备实施例1、3～8得到黄豆苷元固体脂质纳米粒，分别按照实施例13所述的相同方法，测定其粒径，测定结果见下表所示：

试验样品来源	平均粒径
		实施例1	35.3nm
实施例3	62.8nm
		实施例4	78.9nm
实施例5	56.2nm
		实施例6	71.6nm

实施例7	66.3nm
		实施例8	54.7nm

四、大鼠体内生物利用度测定

实施例15

取健康SD大鼠12只，雄性，体重200-250g，随机分成2组，每组6只。分别灌胃给予上述常规方法制备的黄豆苷元混悬液(实施例11制备)和本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒悬液，以黄豆苷元质量计，给药剂量均为20mg·kg^-1。给药后10min、0.5h、1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、6.0h、8.0h、12h和24h经大鼠眼球后静脉丛取血，血浆样品处理后，以芹菜素为内标，采用LC-MS-MS检测(采用大气压化学电离源作为离子源；电晕放电电流3.0μA；温度为450℃；离子源气体(N₂)压力为60psi；气帘气体(N₂)压力为10psi；正离子方式检测；去簇电压(DP)为90V；扫描方式为多反应监测(MRM)，碰撞能量(CE)分别为45eV(黄豆苷元)和40eV(内标芹菜素)；用于定量分析的离子反应分别为m/z255.4→m/z 137.0(黄豆苷元)和m/z 271.1→m/z 153(内标芹菜素)；碰撞气压力为5psi；扫描时间为200ms，血浆中的药物浓度测定结果见附图3。

SD大鼠体内药动学结果表明，与常规方法制备的黄豆苷元混悬液相比，本发明实施例2制备的黄豆苷元固体脂质纳米粒在大鼠体内15min达到峰浓度，Cmax由667±65ng/mL提高到14512±2390ng/mL，AUC_0-∞由8302±1590ng·h/mL提高到50688±6991ng·h/mL，黄豆苷元固体脂质纳米粒口服生物利用度提高了6.8倍。由此可见，本发明的黄豆苷元固体脂质纳米粒对于改善黄豆苷元口服生物利用度有很好的效果。

Claims (11)

1.一种黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，以薄膜分散法制备，包括以下步骤：

（1）取1重量份黄豆苷元和5-30重量份中的4-15重量份的磷脂，加入有机溶剂分散，得到一反应液，其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物，所述有机溶剂的用量使黄豆苷元的浓度为50～7000μg/mL；

（2）对步骤（1）得到的反应液在磁力搅拌下在40℃～60℃的温度下加热减压回流反应2～24小时，然后回收有机溶剂，得固体或半固体残留物；

（3）将步骤（2）得到的残留物真空干燥以除去残留有机溶剂，即得黄豆苷元与磷脂的复合物；

（4）取步骤（3）得到的黄豆苷元与磷脂的复合物、5~30重量份的磷脂中除了步骤(1)中使用的4-15重量份的磷脂以外的磷脂、1～50重量份表面活性剂和1～40重量份固体脂质成分，溶解于有机溶剂中，然后减压旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜，其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷或其混合物；

（5）向步骤（4）得到的薄膜中加入蒸馏水，水浴加热并振摇，将薄膜洗脱下来，制得乳白色混悬液；

（6）将制得的乳白色混悬液采用探头超声处理，或者采用高压均质的方法均质，即得无色透明或者淡蓝色乳光的固体脂质纳米粒悬液。

2.如权利要求1所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，

在步骤（3）中，所述真空干燥时间为2～48小时；

在步骤（5）中，所述蒸馏水的温度与水浴温度相同，水浴温度比固体脂质材料熔融温度高0～10℃；

在步骤（6）中，所述超声处理时间为10～600s；或者高压均质压力为5000～22000psi，均质次数为2～20次。

3.如权利要求1所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂的用量使黄豆苷元的浓度为1500～5000μg/mL。

4.一种黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，以热熔分散法制备，包括以下步骤：

（1）取1重量份黄豆苷元和5-30重量份中的4-15重量份的磷脂，加入有机溶剂分散，得到一反应液，其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或其混合物，所述有机溶剂的用量使黄豆苷元的浓度为50～7000μg/mL；

（2）对步骤（1）得到的反应液在磁力搅拌下在40℃～60℃的温度下加热减压回流反应2～24小时，然后回收有机溶剂，得固体或半固体残留物；

（3）将步骤（2）得到的残留物真空干燥以除去残留有机溶剂，即得黄豆苷元与磷脂的复合物；

（4）将1~40重量份的固体脂质加热熔融；

（5）将步骤（3）得到的黄豆苷元与磷脂的复合物和5~30重量份的磷脂中除了步骤(1)中使用的4-15重量份的磷脂以外的磷脂溶解于有机溶剂中，然后加入到熔融的固体脂质中，不断搅拌除去有机溶剂，得到一均匀固体脂质混合物；其中所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或其任意混合物；

（6）将1~50重量份的表面活性剂溶于蒸馏水中，加热至温度比固体脂质熔融温度高0～10℃；

（7）将上述步骤（6）得到的含有表面活性剂的水溶液在不断搅拌下加入到上述步骤（5）得到的熔融的固体脂质混合物中，然后继续搅拌，得乳白色混悬液；

（8）将制得的乳白色混悬液采用探头超声处理，或者采用高压均质的方法均质，即得无色透明或者淡蓝色乳光的固体脂质纳米粒悬液。

5.如权利要求4所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，

在步骤（3）中，所述真空干燥时间为2～48小时；

在步骤（4）中，所述加热温度为所用固体脂质熔点以上0～10℃；

在步骤（5）中，将步骤（3）得到的黄豆苷元与磷脂的复合物和5~30重量份的磷脂中除了步骤(1)中使用的4-15重量份的磷脂以外的磷脂溶解于有机溶剂中，其中有机溶剂的用量为使黄豆苷元与磷脂的复合物和除了步骤(1)中使用的4-15重量份的磷脂以外的构成5~30重量份的磷脂的剩余的磷脂溶解的最小用量；

在步骤（6）中，采用水浴加热，加热温度比固体脂质材料熔融温度高0～10℃；

在步骤（8）中，所述超声处理时间为10～600s；或者高压均质压力为5000～22000psi，均质次数为2～20次。

6.如权利要求4所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂的用量使黄豆苷元的浓度为1500～5000μg/mL。

7.如权利要求1-6中任一项所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述固体脂质纳米粒的平均粒径为30～80nm。

8.如权利要求1-6中任一项所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和氢化蛋黄卵磷脂。

9.如权利要求8所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥70%，蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥70%，氢化大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥80%，氢化蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量≥80%。

10.如权利要求1-6中任一项所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂选自油酸钠、吐温80、吐温20、聚乙二醇15羟硬脂酸酯、普朗尼克F68和普朗尼克F127。

11.如权利要求1-6中任一项所述的黄豆苷元固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述固体脂质选自硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、棕榈酸、单棕榈酸甘油酯、二棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯和山嵛酸甘油酯。

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