CN115372521A - 植物鞘氨醇和/或n-乙酰植物鞘氨醇的分离鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物鞘氨醇和/或N‑乙酰植物鞘氨醇的分离鉴定方法，包括如下步骤：采用高效液相色谱法对植物鞘氨醇或N‑乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液进行分离检测，得到第一色谱图；采用所述高效液相色谱法对含有植物鞘氨醇和/或N‑乙酰植物鞘氨醇的样品进行分离检测，得到第二色谱图；根据第一色谱图、第二色谱图以及植物鞘氨醇或N‑乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液浓度确定所述样品中植物鞘氨醇和/或N‑乙酰植物鞘氨醇及其含量；该方法对植物鞘氨醇的含量与N‑乙酰植物鞘氨醇进行了快速、准确有效的检测，为植物鞘氨醇的质量控制提供可靠的检测分析方法；该方法具有操作简单、数据准确可靠、重现性好的特点。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的分离纯化技术领域，具体涉及一种植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的分离鉴定方法。
背景技术
植物鞘氨醇(Phyto sphingosine)，又称神经鞘氨醇，学名2-氨基-4-十八烯-1,3-二醇，是一种含有不饱和烃基链的十八碳氨基醇。其结构式如下所示：
植物鞘氨醇为新型化妆品原料，研究发现，植物鞘氨醇，这种长链有机分子除了水分保持和屏障功能之外，在抗炎舒缓、抑制微生物、调控上皮角化增殖以及治疗痤疮等方面都有着不俗的表现和优异效果。植物鞘氨醇之所以对皮肤作用显著，一个很重要的原因是因为它作为PPARs(过氧化物酶体增殖物激活受体)的配体来发挥作用，因此即使添加量很小，也同样可以发挥作用。经发酵、提取、水解得到植物鞘氨醇。
目前无文献报到植物鞘氨醇的含量与有关物质的测定，但对于具有相似的结果的物质多采用NMR与液相色谱柱前衍生法，采用上述方法操作复杂与仪器设备昂贵，不适用于工业生产质量监控；此外，植物鞘氨醇中影响质量最大杂质为N-乙酰植物鞘氨醇；然而，采取衍生方法无法准确获取植物鞘氨醇中N-乙酰植物鞘氨醇以及其他杂质的含量，为植物鞘氨醇在化妆品使用领域的安全带来潜在风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的分离鉴定方法，本发明分离鉴定方法能够实现样品中植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的分离鉴定，实现植物鞘氨醇以及N-乙酰植物鞘氨醇的分离纯化，提高了植物鞘氨醇的纯度。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的分离鉴定方法，所述方法包括如下步骤：
采用高效液相色谱法对植物鞘氨醇或N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液进行分离检测，得到第一色谱图；
采用所述高效液相色谱法对含有植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的样品进行分离检测，得到第二色谱图；
根据第一色谱图、第二色谱图以及植物鞘氨醇或N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液浓度确定所述样品中植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇及其含量；
所述高效液相色谱法以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为三氟乙酸水溶液；
所述流动相B为乙腈。
优选地，所述三氟乙酸水溶液浓度为0.04％～0.06％。
优选地，所述梯度洗脱程序为：
0～5min，流动相A 50v/v％；
5～25min，流动相A 50v/v％～30v/v％；
25～30min，流动相A 30v/v％～20v/v％；
30～35min，流动相A 20v/v％；
35～36min，流动相A 20v/v％～50v/v％；
36～45min，流动相A 50v/v％。
优选地，所述梯度洗脱的流速为0.9～1.0ml/min。
优选地，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为C8色谱柱；
所述色谱柱规格长度为100-200mm，内径为4.0-5.0mm，填料粒径为4.0-6.0μm。
优选地，所述色谱柱的柱温为35～40℃。
优选地，所述高效液相色谱法所采用的CAD检测器的雾化温度为50℃，进样量为10μL。
优选地，所述植物鞘氨醇的对照品溶液浓度为0.3～0.5mg/ml；所述N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液浓度为0.3～0.5mg/ml。
优选地，所述含有植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的样品中植物鞘氨醇和N-乙酰植物鞘氨醇的浓度分别为0.03～0.07mg/ml。研究表明，在该范围之内，样品中植物鞘氨醇和N-乙酰植物鞘氨醇的峰面积与对照品的峰面积具有线性关系，可以试验样品中植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的含量的准确测定。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明应用高效液相色谱方法，采用C8色谱柱柱，通过对色谱条件与进样程序进行优化筛选，得到本申请技术方案；采用本申请技术方案可有效地分离确定样品中植物鞘氨醇以及N-乙酰植物鞘氨醇的含量，并且植物鞘氨醇与N-乙酰植物鞘氨醇间的分离度大于1.5；同时按《中国药典》2020年版四部通则<0512>(高效液相色谱法)及通则<9101〉(分析方法验证指导原则)的定义和验证方法，进行专属性，灵敏度，准确度验证，植物鞘氨醇的准确度回收率为98.9％～100.8％，植物鞘氨醇的定量限为0.002％；N-乙酰植物鞘氨醇的定量限为0.002％，结果表明本发明技术方案具有较高的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例中系统适应性溶液的液相色谱图；
图2为本发明实施例中0.07mg/mL的供试品溶液的液相色谱图；
图3为本发明实施例中0.4mg/mL的供试品溶液的液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本发明实施例提供一种植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的分离鉴定方法，该方法包括如下步骤：
采用高效液相色谱法对植物鞘氨醇或N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液进行分离检测，得到第一色谱图；
采用所述高效液相色谱法对含有植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的样品进行分离检测，得到第二色谱图；
根据第一色谱图、第二色谱图以及植物鞘氨醇或N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液浓度确定所述样品中植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇及其含量；
所述高效液相色谱法以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为三氟乙酸水溶液；
所述流动相B为乙腈。
在本发明中通过采用高效液相色谱法能够实现对样品中植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的分离，通过流动相的选择，达到了植物鞘氨醇与N-乙酰植物鞘氨醇间的分离度为6.6；进而本申请技术方案实现了植物鞘氨醇的分离纯化，具体地，植物鞘氨醇的准确度回收率可达98.9％～100.8％，植物鞘氨醇的定量限为0.002％；N-乙酰植物鞘氨醇的定量限为0.002％。
在本发明中对三氟乙酸水溶液浓度不作严格限制，优选地，在一些实施放方式中三氟乙酸水溶液浓度可以为0.04％～0.06％中任一数值；更优选地，在一实施方式中，三氟乙酸水溶液浓度可以为0.05％，该浓度下能够更好的实现植物鞘氨醇与N-乙酰植物鞘氨醇的分离。
在一些实施方式中，梯度洗脱程序可以为：
0～5min，流动相A 50v/v％；
5～25min，流动相A 50v/v％～30v/v％；
25～30min，流动相A 30v/v％～20v/v％；
30～35min，流动相A 20v/v％；
35～36min，流动相A 20v/v％～50v/v％；
36～45min，流动相A 50v/v％。
通过上述梯度洗脱程序的限定，实现了植物鞘氨醇与N-乙酰植物鞘氨醇及其他杂质的分离，提高了植物鞘氨醇的分离纯度。
在一些实施方式中，梯度洗脱的流速为0.9～1.0ml/min。
在一些实施方式中，高效液相色谱法采用的色谱柱可以为C8色谱柱；
进一步地，色谱柱规格长度为100-200mm，内径为4.0-5.0mm，填料粒径为4.0-6.0μm。
更进一步地，色谱柱的柱温可以为35～40℃中任一数值。
在一些实施方式中，高效液相色谱法所采用的CAD检测器的雾化温度可以为50℃，进样量可以为10μL。
在一些实施方式中，植物鞘氨醇的对照品溶液浓度可以为0.03～0.05mg/ml；N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液浓度可以为0.03～0.05mg/ml。
在一些实施方式中，含有植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的样品中植物鞘氨醇和N-乙酰植物鞘氨醇的浓度分别为0.03～0.07mg/ml。研究表明，在该范围之内，样品中植物鞘氨醇和N-乙酰植物鞘氨醇的峰面积与对照品的峰面积具有线性关系，可以试验样品中植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的含量的准确测定。
以下通过具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。
实施例
1、色谱条件与检测仪器
高效液相色谱仪：岛津LC-2030Plus；
检测器Thermo ScientificTM CoronaTM VeoTM电雾式检测器；
色谱柱：Ulimate LP-C8 4.6×150mm，5Micron；
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液；
流动相B：乙腈；
检测参数:雾化器温度50℃；
流速1.0ml/min；
色谱温度：40℃；
进样量：10μL；
梯度洗脱程序如表1所示：
表1
2、溶液配制：
系统适应性溶液的配制：
取植物鞘氨醇对照品约20mg和N-乙酰植物鞘氨醇对照品2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量超声溶解并稀释至刻度，作为系统适应性溶液。
对照品溶液的配制：
取植物鞘氨醇对照品与N-乙酰植物鞘氨醇对照品各20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量超声溶解并稀释至刻度，精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中；加甲醇稀释至刻度，作为有关物质对照品溶液。植物鞘氨醇对照品溶液：
含有植物鞘氨醇和N-乙酰植物鞘氨醇的样品的配制：
取含有植物鞘氨醇和N-乙酰植物鞘氨醇的样品7mg，精密测定置100ml量瓶中，加甲醇适量超声溶解并稀释至刻度，得到0.07mg/mL的供试品溶液；再按照上述方法配制得到的0.4mg/ml的供试品溶液。
取上述系统适应性溶液、对照品溶液和供试品溶液，精密量取上述溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，进行梯度洗脱，记录色谱图，其中图1为系统适应性溶液的液相色谱图；
图2为0.07mg/mL的供试品溶液的液相色谱图；
图3为0.4mg/mL的供试品溶液的液相色谱图；
由图1～图3可知，植物鞘氨醇与N-乙酰植物鞘氨醇间的分离度为6.6，可见，本申请技术方案能够实现，植物鞘氨醇与N-乙酰植物鞘氨醇的分离纯化。
本发明首次对植物鞘氨醇的含量与N-乙酰植物鞘氨醇进行了快速、准确有效的检测，为植物鞘氨醇的质量控制提供可靠的检测分析方法。该方法具有操作简单、数据准确可靠、重现性好的特点，具有较大的积极进步和可实际运用的价值。
按《中国药典》2020年版四部通则<0512>(高效液相色谱法)及通则<9101〉(分析方法验证指导原则)的定义和验证方法，进行验证，植物鞘氨醇准确度回收率为98.9％～100.8％之间；植物鞘氨醇的定量限为0.002％；N-乙酰植物鞘氨醇的定量限为0.002％，结果表明该方法具有较高的灵敏度，能够有效控制有关物质的量。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (9)
1.一种植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用高效液相色谱法对植物鞘氨醇或N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液进行分离检测，得到第一色谱图；
采用所述高效液相色谱法对含有植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的样品进行分离检测，得到第二色谱图；
根据第一色谱图、第二色谱图以及植物鞘氨醇或N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液浓度确定所述样品中植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇及其含量；
所述高效液相色谱法以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为三氟乙酸水溶液；
所述流动相B为乙腈。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三氟乙酸水溶液浓度为0.04％～0.06％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：
0～5min，流动相A 50v/v％；
5～25min，流动相A 50v/v％～30v/v％；
25～30min，流动相A 30v/v％～20v/v％；
30～35min，流动相A 20v/v％；
35～36min，流动相A 20v/v％～50v/v％；
36～45min，流动相A 50v/v％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为0.9～1.0ml/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为C8色谱柱；
所述色谱柱规格长度为100-200mm，内径为4.0-5.0mm，填料粒径为4.0-6.0μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为35～40℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法所采用的CAD检测器的雾化温度为50℃，进样量为10μL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物鞘氨醇的对照品溶液浓度为0.03～0.05mg/ml；所述N-乙酰植物鞘氨醇的对照品溶液浓度为0.03～0.05mg/ml。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有植物鞘氨醇和/或N-乙酰植物鞘氨醇的样品中植物鞘氨醇和N-乙酰植物鞘氨醇的浓度分别为0.03～0.07mg/ml。
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