CN114113358A - 一种依替米星的检测方法 - Google Patents

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何永飞
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Abstract

本发明公开了一种依替米星的检测方法，采用柱后衍生化法，其中，色谱条件为：流动相A：甲醇或乙腈，流动相B：三氟乙酸；流动相A与流动相B的体积比为35～5：65～95；衍生化试剂为邻苯二甲醛溶液，衍生化试剂流速0.5～1.0 mL/min，衍生化反应温度40℃～70℃；检测器为紫外‑可见光检测器，检测波长为330～350nm。本发明的HPLC‑柱后衍生化法，在分离基质时采用与成品方法类似的流动相离子对，经色谱柱分离后进行衍生化反应使其拥有紫外吸收，这样既能有与成品类似的杂质分离度，又能直接读取产品纯度；且衍生化后的产物均为邻苯衍生物，紫外吸收强度一致，主成分与杂质的紫外吸收一致。

Description

一种依替米星的检测方法
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种依替米星的检测方法。
背景技术
硫酸依替米星(etimicin)是新一代半合成氨基糖苷类抗生素。依替米星含量测定的方法主要有微生物法、旋光法、HPLC法。微生物法操作繁琐，误差大，目前该法已被淘汰；旋光法精确性差，重复性低；相对而言，HPLC法灵敏度高，精确性好，但依替米星只具有紫外末端吸收，难以用紫外检测器直接进行测定，通常要对样品进行柱前衍生化处理，或换用其他通用型检测器如蒸发光散射检测器(ELSD)等。
中国专利文献CN 102565208A(申请号 CN201010610364.3)公开了一种测定硫酸依替米星原料及其制剂的含量和有关物质的检测方法,采用柱前衍生化法。衍生化条件为取样品适量浓度4mL加OPA溶液1mL以异丙醇稀释至10mL，30～60℃水浴避光加热，即得衍生化溶液。发明采用高效液相色谱法，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱，粒径4～10μm，柱规格为150～250mm×4.6～8.0mm；流动相分为有机相和水相，其中有机相与水相的体积比为55～75：45～25，有机相为甲醇或乙腈，水相为25%冰醋酸含离子对试剂庚烷磺酸钠0.01M～0.03M，以氨水或醋酸铵调节pH范围为2.5～3.5；流速为0.5～1.0ml/min；进样量为10～20μl；检测器为常规紫外-可见光检测器，检测波长为330～350nm。该法使用常规检测器和高效液相色谱仪，实现在线检测硫酸依替米星及其制剂的含量和有关物质。柱前衍生化法费时，衍生化可能会产生许多衍生化峰，杂质的分离度差，与成品的分析方法相差较大，不能很好的起到中间体监控的目的。
中国专利文献CN 102798674B（申请号 CN201210258929.5）公开了一种依替米星的检测方法，采用UPLC或UHPLC-ELSD，以分离纯化后的含乙醇的依替米星解吸液作为样品直接进行分析。使用ELSD检测器的话，对于依替米星的纯化过程中的在线检测而言，成本较高、操作繁琐，纯度虚高。
对于依替米星生产过程中得到的依替米星解析液，成品检测一般采用HPLC-ELSD的检测方法，但该法浓度与峰面积不直接成线性，一般采用外标法计算。如果检测物质是中间体，一般中间体无明确含量，外标计算不准确，故中间体的检测不采用该方法，一般采用柱前衍生化法，该方法可直接计算样品纯度，但柱前衍生化法与成品方法差距较大，不能与成品中的杂质一一对应，不能很好的控制成品质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种采用HPLC-柱后衍生化法对依替米星进行检测的方法，实现在线检测依替米星解析液纯度及含量，操作简单，结果准确可靠。
实现本发明目的的技术方案是一种依替米星的检测方法，采用柱后衍生化法，先将待检测的依替米星样本经HPLC色谱柱分离，分离后进行衍生化反应，得到的衍生物进紫外-可见光检测器检测。其中，
色谱条件为：流动相A：甲醇或乙腈，流动相B：0.01M～0.03M三氟乙酸溶液；流动相A与流动相B的体积比为35～5：65～95，流速为0.5～1.0mL/min。
衍生化试剂为邻苯二甲醛溶液，衍生化试剂流速0.5～1.0 mL/min，衍生化反应温度40℃～70℃。
检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为330～350nm。
其中，流动相B用氨水或醋酸铵调节pH为2.5～3.5。
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱，填料粒径4～10μm，柱规格150～250mm×4.6～8.0mm。
所述邻苯二甲醛溶液的配制方法如下：称取硼酸10～15g，氢氧化钠5～10g，加水800mL溶解；称取邻苯二甲醛200～500mg，用10mL甲醇溶解，将邻苯二甲醛溶液加入硼酸缓冲溶液中，加水稀释至1L，再加入硫代乙醇酸0.5～2.0mL，混匀待用。
本发明具有积极的效果：
（1）本发明的HPLC-柱后衍生化法，在分离基质时采用与成品方法类似的流动相离子对，经色谱柱分离后进行衍生化反应使其拥有紫外吸收，这样既能有与成品类似的杂质分离度，又能直接读取产品纯度；且衍生化后的产物均为邻苯衍生物，紫外吸收强度一致，主成分与杂质的紫外吸收一致。
（2）本发明的检测方法专属性良好，主峰依替米星与最近杂质奈替米星分离度为3.7（通常大于1.5能完全分离）；各杂质分离度最小为2.4，均大于1.5，能完全分离。
本发明的检测方法定量限为1µg/mL；线性范围为1µg/mL～1200µg/mL；主成分重复性RSD为0.98%。
（3）本发明的检测方法以分离纯化后的依替米星解吸液作为样品直接进行分析；使用常规紫外-可见光检测器和高效液相色谱仪，就可以实现在线检测依替米星解吸液纯度及含量，该方法快速准确，适用于依替米星解析液纯度及含量的检测。
附图说明
图1为主成分与各杂质之间分离度的专属性图谱。
具体实施方式
以下实施例的含依替米星的待检物质是依替米星制备过程中，分离纯化后的依替米星解吸液，例如CN201210002717.0公开的制备硫酸依替米星的方法中，各步骤收集的解吸液。
依替米星的检测方法，是先将待检测的依替米星解吸液经HPLC色谱柱分离，分离后进行衍生化反应，得到的衍生物进紫外-可见光检测器检测。
使用的设备、材料和条件如下：
色谱仪：安捷伦公司1260系列液相色谱仪，配柱后衍生系统和紫外-可见光检测器；ChemStation工作站。
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱，填料粒径4～10μm，柱规格150～250mm×4.6～8.0mm。
流动相A：甲醇或乙腈；流动相B：0.01M～0.03M三氟乙酸溶液，以氨水或醋酸铵调节pH范围为2.5～3.5。
流动相A与流动相B的体积比为35～5：65～95；流速为0.5～1.0mL/min。
进样量为10～20μL。
衍生化试剂：称取硼酸10～15g，氢氧化钠5～10g，加水800mL溶解；称取邻苯二甲醛200～500mg，用10mL甲醇溶解，将邻苯二甲醛溶液加入硼酸缓冲溶液中，加水稀释至1L，再加入硫代乙醇酸0.5～2.0mL，混匀待用，现配现用。
衍生条件：衍生化试剂流速0.5～1.0 mL/min，衍生化反应温度40℃～70℃。
紫外-可见光检测器检测波长为330～350nm。
（实施例1）
对依替米星制备过程中分离纯化后的依替米星解吸液取样。
色谱条件：填料粒径5μm，柱规格150mm×6.6mm。
流动相中，乙腈：0.01M三氟乙酸=35：65；流速0.5mL/min。
进样量10μL。
本实施例的衍生化试剂：称取硼酸10g，氢氧化钠5g，加水800mL溶解；称取邻苯二甲醛200mg，用10mL甲醇溶解，将邻苯二甲醛溶液加入硼酸缓冲溶液中，加水稀释至1L，再加入硫代乙醇酸0.5mL，混匀待用，现配现用。
衍生条件：衍生化试剂流速0.5mL/min，衍生化反应温度45℃。
检测波长为330nm。
主成分与各杂质之间分离度的专属性图谱见图1，主峰依替米星与最近杂质奈替米星分离度为3.7，各杂质分离度最小为2.4，均大于1.5；依替米星和待检物中的主要杂质能完全分离。根据面积归一化法，即能计算得到依替米星的含量。
（实施例2）
本实施例的依替米星的检测方法其余与实施例1相同，不同之处在于：
色谱条件：填料粒径6μm，柱规格250mm×6.6mm。
流动相中，甲醇：0.02M三氟乙酸=20：80；流速1.0mL/min。
进样量20μL。
衍生条件：衍生化试剂流速1.0mL/min，衍生化反应温度65℃。
检测波长为350nm。
检测结果：依替米星和待检物中的主要杂质均达到基线分离。
（实施例3）
本实施例的依替米星的检测方法其余与实施例1相同，不同之处在于：
色谱条件：填料粒径8μm，柱规格250mm×8mm。
流动相中，甲醇：0.03M三氟乙酸=15：85；流速1.0mL/min。
进样量20μL。
衍生条件：衍生化试剂流速1.0mL/min，衍生化反应温度55℃。
检测波长为345nm。
检测结果：依替米星和待检物中的主要杂质均达到基线分离。

Claims (4)

1.一种依替米星的检测方法，其特征在于：采用柱后衍生化法，其中，
色谱条件为：流动相A：甲醇或乙腈，流动相B：0.01M～0.03M三氟乙酸溶液；流动相A与流动相B的体积比为35～5：65～95，流速为0.5～1.0mL/min；
衍生化试剂为邻苯二甲醛溶液，衍生化试剂流速0.5～1.0 mL/min，衍生化反应温度40℃～70℃；
检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为330～350nm。
2.根据权利要求1所述的依替米星的检测方法，其特征在于：流动相B用氨水或醋酸铵调节pH为2.5～3.5。
3.根据权利要求1所述的依替米星的检测方法，其特征在于：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱，填料粒径4～10μm，柱规格150～250mm×4.6～8.0mm。
4.根据权利要求1所述的依替米星的检测方法，其特征在于邻苯二甲醛溶液的配制方法如下：称取硼酸10～15g，氢氧化钠5～10g，加水800mL溶解；称取邻苯二甲醛200～500mg，用甲醇溶解，将邻苯二甲醛溶液加入硼酸缓冲溶液中，加水稀释至1L，再加入硫代乙醇酸0.5～2.0mL，混匀待用。
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