CN115372109A - 一种循环肿瘤细胞染色试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种循环肿瘤细胞染色试剂盒，所述试剂盒包括过滤器、单独包装的嗜碱性染液和嗜酸性染液，其特征在于，所述嗜碱性染液中包括伊红Y和苯甲醇；所述嗜酸性染液中包括亚甲蓝和山梨糖醇；所述过滤器包括平均孔径为6‑7μm的滤膜。本发明通过在嗜碱性染液中加入苯甲醇，在嗜酸性染液中加入山梨糖醇，可以有效提高光照对于伊红Y和亚甲蓝的影响，从而使得本发明的循环肿瘤细胞染色试剂盒无需避光保存就可以长期稳定使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，更具体地说是涉及一种循环肿瘤细胞染色试剂盒及其应用。
背景技术
肿瘤液态活检是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，区别于传统的临床诊断手段，该方法具有简便、安全、无创、实时等特点。广义而言，肿瘤液态活检主要是指以外周血液为主的体液标本中细胞及核酸的检测。通常包括了CTC（循环肿瘤细胞）和ctDNA（游离DNA）两大类，是目前精准医疗的最前沿领域之一，临床应用价值极其显著，在肿瘤的诊疗领域具有良好的应用前景。
临床上很大一部分被诊断为癌症的患者可以仅依靠手术和辅助治疗手段缓解病症，但是经过一段时间的潜伏期后会有超过80%的癌症患者死于肿瘤细胞的转移和复发。原因在于经过初步的治疗后由于肿瘤细胞的暂时性休眠，其可以在这种状态下传播到其他组织器官中，而在这个过程中，肿瘤细胞会发生一系列的表观改变，如上皮细胞间质转化过程，从而使其逃避免疫监测和对药物发生耐药，进而实现转移。
肿瘤细胞的逃逸无疑给临床治疗造成了很大的困扰，因此，很多医生和临床科研人员都希望有一种快捷、精确的技术方法能够有效地克服该难题。在某些癌症的发生过程中，有少量的癌细胞从原生肿瘤中脱离进入血液，随血液循环四处游走或转移至新病灶，这部分癌细胞即CTC（循环肿瘤细胞），可从血液中分离得到，用癌细胞表面的常见分子标志物识别。这些癌细胞的DNA能够被用来了解导致患者癌变的突变基因。CTC是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。CTC检测通过捕捉检测外周血中痕量存在的CTC，监测CTC类型和数量变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。此外，这类癌细胞本身可经实验室培养，用于个体化抗癌药物的体外筛选。与ctDNA/cfDNA检测相比，CTC检测具有自己的特点，目前，有几家公司已经开始提供这样的测试，数以百计的临床试验正在进行中。
CTC检测不仅可提供预后预测、复发风险评估和疗效监测，同时CTC的分子分析还可以反映患者肿瘤的基因信息，指导个体化用药。目前，靶向治疗已成为恶性肿瘤治疗的主要手段。靶向治疗药物作用于特定的靶标基因发挥药效，其药物疗效与肿瘤患者的基因信息密切相关。因此，患者接受靶向药物治疗之前，必须接受系列的基因检测，根据患者的基因特点，采用不同的治疗方案，实施个体化治疗。CTC是游离于患者血液中的肿瘤细胞，携带了肿瘤的全部基因，可以作为基因检测的样本。CTC分析通过对获取的CTC进行基因分析，能实时反映肿瘤的基因状况，清楚地指导患者下一步的药物选择，提高治疗效果。
目前检测CTCs的方法主要为基于PCR或免疫学的方法，它们都无法获得详细的细胞形态学的信息，并且所需试剂或仪器较昂贵。也有人用染色的方法从形态学角度来鉴定CTCs，如巴氏染色法、H&E染色法和MGG染色法，各种方法特征如下：
巴氏染色法：是国内外广泛使用的组织病理学和细胞病理学染色方法，具有“细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆着色艳丽”优点，但其所需试剂多，操作步骤繁琐，需时长，并且对操作人员技术要求较高。且在应用于细胞病理学染色时，其中的多种化学物质对细胞内蛋白及微细结构有一定破坏作用。
H&E染色法：H&E染色原理与巴氏染色类似，只是用伊红取代EA36和橘黄G6，其中使用的乙醇-盐酸分化液同样对蛋白质有水解作用，可能使染色质细微结构、特别是细小的核仁消失。同样地，操作步骤较多和需时较长。
MGG染色法：MGG是May-Grünwald-Giemsa的简称，也是一种常见的细胞病理学染色方法，利用Romanowsky Stain技术原理改良而成。各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对染色液中的酸性染料（曙红）和碱性染料（亚甲蓝和天青）的亲和力也不一样。因此，相应各类细胞及细胞成分呈现不同的着色，从而达到辨别其形态特征的目的。
针对循环肿瘤细胞染色试剂盒，中国授权专利CN104931324B公开了一种循环肿瘤细胞的染色试剂盒，包括固定液、免疫磁性微球和染色试剂，还包括封闭液，封闭液含有离子去污剂和蛋白保护剂，免疫磁性微球的表面被有抗EpCAM和Her2的联合抗体，染色试剂为含FITC-CK19或FITC- Her2、Cy3-CD45和DAPI的复合荧光染色试剂。这样循环肿瘤细胞的染色试剂盒具有血液白细胞干扰少，CTC细胞特有富集、捕获，循环肿瘤细胞染色效果好的优点。
此外，中国授权专利CN102980793B公开了一种循环肿瘤细胞染色试剂盒及其应用，该染色试剂盒包括过滤器和分装的嗜碱性染液、嗜酸性染液、等渗溶液、固定液，其中：该过滤器包括8μm孔径的滤膜；该嗜碱性染液为伊红Y的甲醇溶液；该嗜酸性染液为含有美兰、天青I的磷酸盐缓冲液；该固定液为含有多聚甲醛和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。本发明的染色试剂盒染色效果好，而且制备简单，成本低，操作简便，需时短，大大提高了工作效率。
然而，由于循环肿瘤细胞染色试剂盒主要采用色素进行染色，所使用的部分色素在光照下会发生变质，从而导致染色效果失真。因此，通常而言，循环肿瘤细胞染色试剂盒需要避光保存，由此带来的保存和使用上的不便。
发明内容
基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够在自然光条件下长期保存的循环肿瘤细胞染色试剂盒。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种循环肿瘤细胞染色试剂盒，所述试剂盒包括过滤器、单独包装的嗜碱性染液和嗜酸性染液，其特征在于，所述嗜碱性染液中包括伊红Y和苯甲醇；所述嗜酸性染液中包括亚甲蓝和山梨糖醇；所述过滤器包括平均孔径为6-7μm的滤膜。本发明通过在嗜碱性染液中加入苯甲醇，在嗜酸性染液中加入山梨糖醇，可以有效提高光照对于伊红Y和亚甲蓝的影响，从而使得本发明的循环肿瘤细胞染色试剂盒无需避光保存就可以长期稳定使用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述嗜碱性染液的溶剂是甲醇。
在本发明的一个优选实施方式中，所述嗜碱性染液中伊红Y的浓度为0.05-0.2（m/v）%。
在本发明的一个优选实施方式中，所述嗜碱性染液中苯甲醇的浓度为0.3-1.0（v/v）%；优选的，所述嗜碱性染液中苯甲醇的浓度为0.4-0.6（v/v）%。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述嗜酸性染液的溶剂为PBS缓冲溶液。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述嗜酸性染液的pH值为6.3-7.0之间。
在本发明的一个优选实施方式中，所述嗜酸性染液中亚甲蓝的浓度为0.1-0.3（m/v）%。
在本发明的一个优选实施方式中，所述嗜酸性染液中山梨糖醇的浓度为0.05-0.3（m/v）%；优选的，所述嗜酸性染液中山梨糖醇的浓度为0.15-0.25（m/v）%。
在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒的包装为透光性包装。
本发明另一方面还涉及上述循环肿瘤细胞染色试剂盒在制备对循环肿瘤细胞进行染色的试剂盒中的应用。
有益效果
本发明通过在嗜碱性染液中加入苯甲醇，在嗜酸性染液中加入山梨糖醇，可以有效提高光照对于伊红Y和亚甲蓝的影响，从而使得本发明的循环肿瘤细胞染色试剂盒无需避光保存就可以长期稳定使用。
附图说明
图 1 和图 2 为利用本发明实施例的循环肿瘤细胞染色试剂盒对前列腺癌肿瘤细胞 系 PC3 的染色结果。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：循环肿瘤细胞染色试剂盒的制备
1.嗜碱性染液的配制：
用量筒称取1000ml分析级甲醇加入至烧杯中，用天平称取1g伊红Y，加入烧杯中，震摇使伊红Y充分溶解，再加入5ml 苯甲醇，混合均匀之后0.22μm滤膜过滤，室温保存备用。
2.嗜酸性染液的配制：
先用天平称取10g磷酸氢二钠和12.5g磷酸二氢钾，溶于1000毫升蒸馏水中，制成PBS溶液，再称取2g 亚甲蓝和2g山梨糖醇溶于该PBS溶液中，将pH调节至6.6，0.22μm孔径滤膜过滤，室温保存备用。
3.过滤器的制备
取直径为13mm，孔径为6.5μm的滤膜装入13mm规格的针头式过滤器中，组成本发明的染色试剂盒的过滤器。
实施例2：循环肿瘤细胞染色试剂盒的制备
1.嗜碱性染液的配制：
用量筒称取1000ml分析级甲醇加入至烧杯中，用天平称取1g伊红Y，加入烧杯中，震摇使伊红Y充分溶解，再加入8ml 苯甲醇，混合均匀之后0.22μm滤膜过滤，室温保存备用。
2.嗜酸性染液的配制：
先用天平称取10g磷酸氢二钠和12.5g磷酸二氢钾，溶于1000毫升蒸馏水中，制成PBS溶液，再称取2g 亚甲蓝和1g山梨糖醇溶于该PBS溶液中，将pH调节至6.6，0.22μm孔径滤膜过滤，室温保存备用。
3.过滤器的制备
取直径为13mm，孔径为6.5μm的滤膜装入13mm规格的针头式过滤器中，组成本发明的染色试剂盒的过滤器。
比较例1：
1.嗜碱性染液的配制：
用量筒称取1000ml分析级甲醇加入至烧杯中，用天平称取1g伊红Y，加入烧杯中，震摇使伊红Y充分溶解，再加入5ml 丙二醇，混合均匀之后0.22μm滤膜过滤，室温保存备用。
2.嗜酸性染液的配制：
先用天平称取10g磷酸氢二钠和12.5g磷酸二氢钾，溶于1000毫升蒸馏水中，制成PBS溶液，再称取2g 亚甲蓝和2g甘露醇溶于该PBS溶液中，将pH调节至6.6，0.22μm孔径滤膜过滤，室温保存备用。
3.过滤器的制备
取直径为13mm，孔径为6.5μm的滤膜装入13mm规格的针头式过滤器中，组成本发明的染色试剂盒的过滤器。
实施例3：稳定性实验
将实施例1、2和比较例1所制备的试剂盒分别置于避光环境和自然光环境，室温条件下保存3个月，采用紫外吸光度检测其中伊红Y和亚甲蓝的浓度，以新制备的试剂盒中伊红Y和亚甲蓝的浓度作为100%基准，每组重复3次，实验结果如表1所示。
表1
上述实验结果表明，本发明实施例的试剂盒在避光保存的状态下与比较例1的伊红Y和亚甲蓝的浓度没有实质性的差异，但是，本发明实施例的试剂盒在自然光环境下保存3个月，伊红Y和亚甲蓝的浓度仍然能够保持在较高的水平，比较例1中伊红Y和亚甲蓝的浓度下降较为明显。
实施例4：肿瘤细胞系染色 ：
1. 取 2ml 新鲜传代的人结肠癌细胞HT29，调整细胞浓度至约 0.5×106/ml，充分混匀。
2. 用移液枪取 1μL（约 500 个）细胞加入至固定液中，固定十分钟，用0.9wt %氯化钠溶液润湿过滤器的滤膜。
3. 将上述含有细胞的固定液用巴氏管转移至过滤器中，利用负压使固定液经滤膜流出，细胞被截留在滤膜上。
4. 取六孔板，在其中一孔中放置一块合适大小的封口膜，将过滤器放置于封口膜上，以防止过滤器中液体流出。
5.向过滤器中滤膜上加300μL嗜碱性染液，染色30秒，利用负压使染液经过滤器流出，尽量将嗜碱性染液去除干净。
6. 将过滤器再次放置于封口膜上，并向过滤器中加 300μL 嗜酸性染液，染色 30秒，利用负压使染液经过滤器流出，尽量将嗜酸性染液去除干净。
7. 向过滤器中加 5ml 氯化钠溶液，利用负压使氯化钠溶液经过滤器流出，尽量将其去除干净。
8. 拆开过滤器，取下滤膜，晾干，封片，镜检，染色结果见图 1 和图 2。
实验结果如图 1 和图 2 所示 ：人结肠癌细胞HT29 细胞核质区分明显。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (10)
1.一种循环肿瘤细胞染色试剂盒，所述试剂盒包括过滤器、单独包装的嗜碱性染液和嗜酸性染液，其特征在于，所述嗜碱性染液中包括伊红Y和苯甲醇；所述嗜酸性染液中包括亚甲蓝和山梨糖醇；所述过滤器包括平均孔径为6-7μm的滤膜。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述嗜碱性染液的溶剂是甲醇。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，所述嗜碱性染液中伊红Y的浓度为0.05-0.2（m/v）%。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，所述嗜碱性染液中苯甲醇的浓度为0.3-1.0（v/v）%。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，所述嗜酸性染液的溶剂为PBS缓冲溶液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述嗜酸性染液的pH值为6.3-7.0之间。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，所述嗜酸性染液中亚甲蓝的浓度为0.1-0.3（m/v）%。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，所述嗜酸性染液中山梨糖醇的浓度为0.05-0.3（m/v）%。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的试剂盒，所述试剂盒的包装为透光性包装。
10.权利要求1-9任意一项所述试剂盒在制备对循环肿瘤细胞进行染色的试剂盒中的应用。
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