CN115315267A - 用于预防或治疗脱发的肽及其用途 - Google Patents

Abstract

根据本发明的方面的肽、以及含有该肽的药物组合物和皮肤外用制剂促进个体毛囊细胞的生长，并增加毛发生长相关细胞因子的量，从而具有毛发养护、毛发生长、或促进毛发生长的作用，并因此具有有效地治疗、改善或预防脱发的作用。

Description

用于预防或治疗脱发的肽及其用途

技术领域

本公开涉及用于预防或治疗脱发的肽及其用途。

背景技术

睾酮参与骨骼肌增加、生殖器发育、精子发生和性欲，这些是男性身体特征的正常方面。另一方面，当双氢睾酮作用于相关组织时，发展出负面的方面(如痤疮、皮脂增加、脱发和前列腺增生)。其中，脱发(主要为男性中)的研究已进行了长的时间，但脱发和毛发生长的机制尚未得到准确阐明。然而，在重视外表的现代社会中，对其的预防和治疗的需求变得迫切。

最近，女性中脱发的病例也在增加。尽管在女性型秃发的大多数患者中没有观察到雄激素增加，但已知原因为甲状腺疾病以及体内铁和微量元素的缺乏。虽然女性型秃发在大程度上受母系(母亲方面)的影响，但与男性型秃发相比，家族史并不清楚。最近，随着女性型秃发数量的增加，美容行业及相关领域中对各种治疗和程序的需求在增加。

头发是活的有机体，它规律地重复进行周期性变化，包括生长期阶段、退行期阶段和休止期阶段。此外，每根头发重复进行独立的生成和毁灭，从而保持头发的恒定数量。头发的数量从出生即决定。然而，在青春期后，头发由于性激素的作用变为终毛过程经常被误认为是数量的增加。生长期阶段是头发由于毛囊的活性和活跃的细胞分裂而生长的时期，并维持约2-6年，所有头发中约85％处于这个阶段。生长期阶段中的毛球细胞被由基质细胞组成的毛乳头包围以呈圆形，并且用于产生新头发的细胞分裂是活跃的。退行期阶段是毛囊停止生长并迅速收缩的时期。此时，头发的形状类似于棍棒。退行期耗费约2-3周，并且所有头发中约5％处于退行期阶段。休止期阶段是毛囊细胞活性完全消失的时期。在2-3个月的时期中，毛囊被从处于休止期的头发根部生长出来的处于生长期的头发推出并脱落，或者通过梳理或洗发等机械作用自然脱落。一般来说，脱发是指由于在生长周期中处于生长期阶段的头发的比例减少同时处于退行期阶段或休止期阶段的头发数量增加，因而异常脱落的头发数量增加。

头发由头皮脱落的脱发的原因多种多样，并大致分为雄性激素的作用、精神压力、过氧化脂质在头皮中堆积、药物副作用、慢性疾病(例如白血病或肺结核)、由放射疗法引起的副作用和营养缺乏。此外，近年来脱发已知成为男性的问题。然而，对于预防和治疗女性脱发，特别是年轻人脱发的需求正在增长。

目前用作毛发生长和毛发养护剂的药物包括用于将充足的血液循环至头皮的血管扩张剂，用于抑制雄性激素作用的雌性激素，以及用于对将睾酮转化为5-二氢睾酮(5-DHT)的5α-还原酶进行抑制的抗雄激素剂。血管扩张剂包括卡普氯铵、米诺地尔和各种植物提取物，雌性激素包括雌激素、雌二醇和孕酮，并且抗雄激素剂包括非那雄胺和十五烷酸。

然而，由于脱发治疗的效果不足或副作用，需要开发针对脱发的更有效和安全的治疗或毛发养护剂。局部或口服给予的米诺地尔对皮肤产生刺激，例如头皮上的疼痛、红斑、炎症、感染或刺激，并具有降低血压的作用。因此，高血压患者(包括服用抗高血压药物的患者)在给予时应谨慎。此外，非那雄胺由于抑制雄性激素活性的作用而具有例如勃起功能障碍和性欲降低的缺点。

因此，与现有的基于化学的组合物不同，本发明人通过发明促红细胞生成素衍生肽来降低副作用的风险，解决了上述问题。

发明内容

技术目标

本公开的示例性实施方式提供了用于预防和治疗脱发或促进毛发生长的药物组合物，所述药物组合物包含肽作为活性成分，所述肽包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：3所组成的组中的任意一种氨基酸序列。

此外，本公开的示例性实施方式提供了用于预防或改善脱发的皮肤外用制剂组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所组成的组中的任意一种氨基酸序列。

有益效果

根据一个方面的组合物包含新型肽。通过根据一个方面的肽、含该肽的药物组合物和皮肤外用制剂，个体毛囊细胞的生长得到促进，并且毛发细胞因子的表达增加，以具有毛发养护、毛发生长或促进毛发生长的效果，从而确保了有效地治疗、改善或预防脱发的效果。

附图说明

图1示出了在用三种类型的根据一个方面的肽处理真皮乳头细胞后3天通过MTT测定进行分析的图。

图2示出了在用三种类型的根据一个方面的肽处理人毛囊器官培养物后3天、6天和9天的长度测量的图。

图3示出了通过用三种类型的根据一个方面的肽处理真皮乳头细胞来对参与毛发生长相关细胞的增殖中的重要细胞因子的基因表达量进行确定的图。

图4示出了通过用三种类型的根据一个方面的肽处理外根鞘细胞来对参与毛发生长相关细胞的增殖中的重要细胞因子的基因表达量进行确定的图。

图5示出了通过将三种类型的根据一个方面的肽注射至动物的皮肤中来检查毛发的长度生长的图像。

图6示出了通过将三种类型的根据一个方面的肽注射至动物的皮肤中三次来检查毛发的长度生长的图像。

图7示出了通过将三种类型的根据一个方面的肽注射至动物的皮肤中来用显微镜确定毛发的长度生长和生长周期的图像。

图8示出了通过将三种类型的根据一个方面的肽注射至动物的皮肤中三次来用显微镜确定毛发的长度生长和生长周期的图像。

具体实施方式

一个方面提供了肽，所述肽包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所组成的组中的任意一种氨基酸序列。该肽可衍生自促红细胞生成素蛋白质的序列。该肽可以结合至促红细胞生成素受体。例如，它可以结合至受体的靶位点(位点1)或靶位点(位点2)。

另一方面提供了用于预防和治疗脱发或促进毛发生长的药物组合物，所述组合物包含肽作为活性成分，所述肽包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所组成的组中的任意一种氨基酸序列。

本文所使用的术语“脱发”是指在应该存在头发的区域中没有头发的状态，或具有低头发密度、或细的弱化的头发的状态。一般来说，如果每天脱发的数量为约100根或更多，则认为存在高的脱发可能性。

根据示例性实施方式，脱发可为女性型秃发或男性型秃发。此外，脱发可为选自于由以下所组成的组中的一种或多种：斑秃、遗传性雄激素性脱发、休止期脱发、外伤性脱发、拔毛癖、压力性脱发、生长期落发、糠秕性脱发(alopecia pityroides)、梅毒性脱发、脂溢性脱发、症状性脱发、瘢痕性脱发或先天性脱发。

该肽可衍生自促红细胞生成素蛋白的序列，并且该肽可衍生自促红细胞生成素结合位点。

该肽对促红细胞生成素受体具有0.1μM至1nM的结合亲和力。具体而言，促红细胞生成素受体具有两个靶位点并与促红细胞生成素形成缀合物。在两个结合靶位点中，已知靶位点1形成强结合(KD＝～1nM)，且靶位点2形成弱结合(KD＝～1μM)。根据一个方面的肽可以通过与促红细胞生成素受体中的靶位点2形成弱键来调节细胞增殖的效果。

该肽可以形成α螺旋结构，并且还具有细胞保护活性。此外，该肽可促进造血干细胞、脂肪细胞、胰腺细胞、肌肉细胞、血管细胞、毛囊细胞或皮肤细胞的增殖或分化。

在示例性实施方式中，肽可以促进真皮乳头细胞或毛母细胞(matrix cell)的生长。此外，该肽可以促进外根鞘细胞或内根鞘细胞的生长。

在示例性实施方式中，该肽可以促进毛发生长相关细胞因子的表达。具体而言，该肽可以促进真皮乳头细胞中胰岛素样生长因子1(IGF1)的表达。由于真皮乳头细胞的增殖涉及生成头发的干细胞的增殖，因此可有促进毛发生长的效果。因此，如果分化标志物的表达受到刺激，可有促进毛发生长的作用以使毛发生长良好。

此外，在外根鞘细胞中，该肽可以促进角质形成细胞分化标志物K6、K16、K17或K75的表达。外根鞘细胞的分化涉及促进毛发生长的作用(即，使毛发增粗)，从而确保良好的毛发养护效果。因此，当分化标志物的表达受到刺激时，由于增粗的毛发，可有帮助使毛发生长良好的效果。

在示例性实施方式中，可按10ppm至10000ppm的量包含该肽。具体地说，含量可为20ppm至10000ppm、10ppm至8000ppm、30ppm至6000ppm、50ppm至5000ppm、70ppm至4000ppm、80ppm至3000ppm、100ppm至2500ppm、110ppm至2000ppm、150ppm至1800ppm、200ppm至1500ppm、300ppm至1400ppm、400ppm至1300ppm、500ppm至1250ppm、600ppm至1200ppm、700ppm至1200ppm、800ppm至1230ppm、900ppm至1100ppm或750ppm至1150ppm。优选地，可包括1000ppm。当肽按以上列出的含量存在时，可得到改善和治疗脱发或促进毛发生长的最佳效果。

根据示例性实施方式，该肽可具有毛发生长、促进毛发生长或毛发养护的效果。

本文中所使用的术语“毛发生长”是指毛发生长的现象。也就是说，它广泛地包括新毛发的生长。本文中使用的术语“毛发养护”或“毛发生长促进”是指使毛发生长变长的作用。也就是说，毛发养护或毛发生长促进是指通过使毛发增粗和加强来广泛地增加毛发的根部、周长、长度和强度的作用。

根据示例性实施方式，该肽可具有全部的毛发养护或毛发生长促进和毛发生长的作用。因此，根据一个方面的组合物，可存在使毛发新生的效果以及增加现有毛发的粗度和强化整体毛发的效果。

本文使用的术语“预防”是指通过给予根据一个方面的药物组合物来抑制脱发或延迟其发生的任何作用。

术语“改善”是指通过给予根据一个方面的药物组合物来至少降低与脱发异常状态相关参数(例如症状的程度)的任何作用。

本文使用的术语“治疗”是指通过给予根据一个方面的药物组合物而使脱发的症状或疾病得到减轻或有益地改变的任何作用。在这种情况下，该组合物可在疾病发作之前或之后与用于治疗的药物同时使用或与之分开使用，以预防或改善脱发。

此外，本文所使用的术语“活性成分”或“药物有效量”是指在本文提供的公开内容的实践中使用的组合物的任何量，所述量足以减轻、抑制进展或预防疾病、紊乱或病症或它们的一种或多种症状。

本文所使用的术语“给予”、“引入”和“植入”可互换使用，并可指通过如下方法和途径将根据示例性实施方式的组合物置于受试者体内，所述方法和途径使得根据示例性实施方式的组合物至少部分定位至期望的位点。根据一个方面的组合物可以通过任何合适的途径进行给予，以将所述组合物递送到活的个体中的期望的位点。

本文所使用的术语“药学上可接受的”涉及如下的组合物，所述组合物由于合理的收益/风险比而在适当的医学判断范围内适用于与受试者(例如人)的组织相接触，而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症。

除了活性成分之外，药物组合物还可包括药学上可接受的载体。在这种情况下，药学上可接受的载体为在制剂中常用的那些，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐/酯、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。此外，除了上述成分以外，还可包含有润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂。

根据期望的方法，药物组合物可以口服(口服制剂)或胃肠外(例如，作为静脉内、皮下、腹膜内或局部应用的吸入剂或注射剂)给予。例如，它可被皮下给予(即皮肤外用制剂)或口服给予(即口服制剂)，但不限于此。

作为待添加到上述各种制剂中的缓冲剂，优选使用pH 4-9和pH 5-9的等渗、无刺激性溶液。剂量根据患者的状况和体重、疾病程度、药物类型、给予途径和持续时间而不同，但是也可以由本领域技术人员适当地选择。

根据示例性实施方式，可通过以下方法注射该肽或药物组合物：在个体皮肤下直接注射的方法；或者将该肽或药物组合物注射至珠中，然后将所述珠注射至体内的方法。皮下注射方法可为使用注射器的注射类型或者使用纳米针的贴片注射(patch injection)类型。贴片注射类型可以避免在需要频繁注射的直接注射类型中出现的不便。

可以按药学有效量给予药物组合物。本文所使用的术语“药物有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可由以下来确定：患者的疾病类型、严重程度、药物活性、药物敏感性、给予时间、给予途径和排泄率、治疗持续时间、包括联合使用的药物在内的因素、以及医学领域众所周知的其它因素。本公开的示例性实施方式的其它药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合进行给予，并且还可与常规治疗剂序贯或同时给予。此外，可允许单次或多次给予。考虑到所有上述因素，重要的是给予能够以最小的量获得最佳效果而无副作用的量，这可由本领域技术人员容易地确定。

药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、状况、体重、活性成分在体内的吸收率、失活率和排泄率、疾病类型、以及联合使用的药物而有所不同，并且可通常处于每1kg每天0.1mg至500mg的范围内。给予可以按一天1次至5次范围内的分剂量每天或每隔一天进行。然而，由于剂量可根据给予途径、肥胖严重程度、性别、体重和年龄而增加或减少，因此剂量不以任何方式限制范围。

另一方面提供了用于预防或治疗脱发的方法，上述方法包括向有需要的个体给予药学有效量的组合物，在体外与细胞接触，或在体内给予至实验动物。关于肽和脱发的具体细节与上文所述相同。

根据示例性实施方式的组合物可包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所组成的组中的任意一种或多种肽，相对于组合物的总重量，所述肽的量为0.001wt％至80wt％。

在示例性实施方式中，可以按10ppm至10000ppm的量包含所述肽。具体地说，含量可为20ppm至10000ppm、10ppm至8000ppm、30ppm至6000ppm、50ppm至5000ppm、70ppm至4000ppm、80ppm至3000ppm、100ppm至2500ppm、110ppm至2000ppm、150ppm至1800ppm、200ppm至1500ppm、300ppm至1400ppm、400ppm至1300ppm、500ppm至1250ppm、600ppm至1200ppm、700ppm至1200ppm、800ppm至1230ppm、900ppm至1100ppm或750ppm至1150ppm。优选地，含量可为约1000ppm。如果肽以上面列出的量存在，则可以得到改善和治疗脱发或促进毛发生长的最显著效果。此外，肽或组合物可以每天给予1次至6次。具体而言，在临床可接受的副作用的范围内，给予次数可为1次或2次以上。关于给予位点，给予可以在1个位点、或在2个以上的位点进行。优选地，可以给予1次至3次。

此外，组合物的剂量可为0.01mg至10,000mg、0.1mg至1000mg、1mg至100mg、0.01mg至1000mg、0.01mg至100mg、0.01mg至10mg或0.01mg至1mg。然而，剂量可以根据例如制剂方法、给予类型、患者的年龄、体重、性别、病理状况、食物、给予时间、给予途径、排泄率和反应敏感性等因素以不同的方式开出，并且本领域技术人员可以考虑到这些影响因素而适当的调整剂量。对于除人类以外的动物，可以应用与每千克的人类的剂量相同的剂量，或者例如通过按目标动物和人类的器官(例如心脏)的体积比(例如平均值)对上述剂量进行转换而获得的量。

可能的给予途径可包括口服、舌下、胃肠外(例如，皮下、肌内、动脉内、腹膜内、鞘内或静脉内)、直肠、局部(包括经皮)、吸入和注射或可植入装置或物质的插入。

根据示例性实施方式，肽或药物组合物可以通过如下方法进行注射：在个体的皮肤下直接注射；或者将肽或药物组合物注射到珠中，然后将所述珠注射到体内。皮下注射方法可为使用纳米针的贴片注射类型。贴片注射类型可以避免在需要频繁注射的直接注射类型中出现的不便。

根据示例性实施方式的受试者包括人和其它目标，例如哺乳动物，并具体包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、狗、马和猪。

根据示例性实施方式的药物组合物可包括药学上可接受的载体和/或添加剂。例如无菌水、生理盐水、常规缓冲剂(磷酸、柠檬酸和其它有机酸)、稳定剂、盐、抗氧化剂(抗坏血酸)、表面活性剂、助悬剂、等渗剂或防腐剂。对于局部给予，还包括与有机材料(如生物聚合物)和无机材料(如羟基磷灰石)的组合，特别是胶原基质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物、及它们的化学衍生物。在根据示例性实施方式的药物组合物被制备成适合注射的形式的情况下，肽可以溶解于药学上可接受的载体中或冷冻在溶解液中。

根据示例性实施方式的药物组合物可以适当地包括(如果根据给予类型或剂型而需要)助悬剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、镇痛剂、缓冲剂、还原剂和抗氧化剂。参考文献[Remington’s PharmaceuticalSciences，第19版，1995]详细描述了适用于本公开的药学上可接受的载体和剂型(包括上文所例示的那些)。根据示例性实施方式的药物组合物可以根据本公开所属领域的普通技术人员可以容易实施的方法使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制成单位剂型，或通过将其置于多剂量容器中而制备。在这种情况下，剂型可处于油或水性介质中的乳剂、溶液或悬浮液的形式，或者处于粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式。

另一方面提供了用于预防或改善脱发的功能性保健食品组合物，所述组合物包含肽作为活性成分，所述肽由选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所组成的组中的任意一种氨基酸序列组成。

关于肽和脱发的具体细节与上文所述相同。

对于食品组合物，除了作为必需组分以指定比例包含的活性成分外，对添加的其它组分没有特别限制。可以包含各种调味剂或天然碳水化合物作为额外成分，如常规饮料。上述天然碳水化合物的实例包括单糖(如葡萄糖和果糖)；二糖(例如麦芽糖和蔗糖)；以及多糖(例如传统的糖类，包括糊精和环糊精)和糖醇(如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇)。可以有利地使用天然调味剂(奇异果甜蛋白(thaumatin)、例如莱鲍迪甙A和甘草甜素(glycyrrhizin)的甜叶菊提取物)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜)作为上文所述调味剂以外的调味剂。天然碳水化合物的比例可以通过本领域技术人员的选择来适当地确定。

除了上述之外，食品组合物还可以包括各种营养物质、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和增稠剂(奶酪、巧克力)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和碳酸饮料中使用的碳酸化剂。这些组分可以单独使用或组合使用。添加剂的比例也可以由本领域技术人员适当地选择。

另一方面提供了用于预防或改善脱发的皮肤外用制剂组合物，所述组合物包含肽，该肽包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所组成的组中的任意一种氨基酸序列。

关于所述肽和脱发的具体细节与上文所述相同。

所述组合物具有促进毛发生长、毛发养护或毛发生长作用。因此，可以通过以下预防或改善脱发：促进毛发生长以使毛发生长，增加体内毛发相关角蛋白和细胞因子的活性，以及增加毛发相关细胞的表达，从而增强个体的整体毛发生长活性。

根据示例性实施方式，脱发的预防或改善可包括促进毛发生长或增加毛发粗度。

根据示例性实施方式，脱发可为女性型秃发或男性型秃发。此外，脱发可为选自于由以下所组成的组中的一种或多种：斑秃、遗传性雄激素性脱发、休止期脱发、外伤性脱发、拔毛癖、压力性脱发、生长期落发、糠秕性脱发、梅毒性脱发、脂溢性脱发、症状性脱发、瘢痕性脱发或先天性脱发。

皮肤外用制剂组合物是指除准药物外可应用于皮肤表面上的所有剂型的组合物。根据示例性实施方式，皮肤外用制剂组合物可为准药物或化妆品组合物。

根据示例性实施方式，皮肤外用制剂可为选自于由以下所组成的组中的一种或多种：生发剂、头皮诊治剂(scalp clinic agents)、头皮除垢剂(scalp scaling agent)、头皮按摩剂、头皮护理剂、清洁剂、香波、养护剂、护发素(hair conditioners)、头发洗剂(hair lotion)、凝胶、发膜(packs)、发乳(cream)、亮发素(essence)、发粉、喷雾剂、发油、皂、软膏、头发定型剂、染发剂、烫发剂(perm)、头皮养护剂、头皮洗剂(hair lotions)、头皮乳、头皮精华(scalp serum)、发用摩丝(hair mousse)、发胶、眉毛生长促进剂、睫毛生长促进剂、睫毛营养剂和宠物香波或宠物护毛素(pet conditioners)。

本文所使用的术语“准药物”是指与治疗组合物或药物组合物相比具有更低药学作用的组合物。本文所使用的术语“化妆品组合物”是指在人体中使用以清洁和护理人体，以增加更多魅力、提亮外观、或者维持或改善皮肤和毛发状况的组合物。

例如，如果以高的量包含一个方面的肽，则可将其归类为治疗性组合物，并且如果存在药学作用但低于治疗性组合物，则可将其归类为用于皮肤的准药物。如果药学作用温和并且旨在用于皮肤护理，则可将其归类为化妆品组合物。因此，上文所述的用于皮肤的准药物和化妆品组合物可以统称为皮肤外用制剂组合物。

根据示例性实施方式，含有一个方面的肽作为活性成分的毛发生长促进剂、头皮护理剂、凝胶、发膜、发乳、亮发素、发粉、喷雾剂、发油、皂或软膏可为皮肤外用制剂的准药物。

根据示例性实施方式，含有一个方面的肽的头皮诊治剂、头皮除垢剂、头皮按摩剂、头皮护理剂、清洁剂、香波、养护剂、护发素、头发洗剂、凝胶、发膜、发乳、亮发素、发粉、喷雾剂、发油、皂、软膏、头发定型剂、染发剂、烫发剂、头皮养护剂、头皮洗剂、头皮乳、头皮精华、发用摩丝、发胶、眉毛生长促进剂、睫毛生长促进剂、睫毛营养剂或宠物香波或宠物护毛素可为化妆品组合物。

当为了预防或改善脱发的目的而将肽添加至准药物组合物中时，包含上述序列号的肽可以原样添加或与其它准药物组分组合使用，并且可以根据常规方法适当使用。活性成分的混合量可根据使用目的(预防性、保健或治疗性处理)适当确定。

根据示例性实施方式，可按10ppm至10000ppm的量包含该肽。具体而言，含量可为20ppm至10000ppm、10ppm至8000ppm、30ppm至6000ppm、50ppm至5000ppm、70ppm至4000ppm、80ppm至3000ppm、100ppm至2500ppm、110ppm至2000ppm、150ppm至1800ppm、200ppm至1500ppm、300ppm至1400ppm、400ppm至1300ppm、500ppm至1250ppm、600ppm至1200ppm、700ppm至1200ppm、800ppm至1230ppm、900ppm至1100ppm、或750ppm至1150ppm。优选地，含量可为约1000ppm。如果该肽按以上列出的含量存在，则可得到改善和治疗脱发或促进毛发生长的最优异效果。

实施例

在下文中，将呈现优选的实施例以帮助理解本公开。然而，以下的实施例仅是为了更容易地理解本公开而提供，且本公开的内容不受以下实施例的限制。

实施例

实施例1.用于脱发治疗的肽的合成

根据常规已知的固相肽合成技术(Peptron，Daejeon，韩国)，以单体形式合成了根据一个方面的促红细胞生成素衍生肽。具体而言，合成了能够结合至天然促红细胞生成素受体的靶位点(位点2)的序列中的重要氨基酸序列(Arg103、Ser104、Leu105、Leu108和Arg110)的促红细胞生成素衍生肽，并利用液相色谱术/质量选择检测器(HP1100系列)对所合成的肽的浓度进行测量。通过高效液相色谱术(SHIMADZU prominence HPLC)分析进行纯度测量(>95％纯度)。

实施例2.制备毛发细胞模型的方法

2.1生长期阶段毛囊的分离

为了测试实施例1的肽对毛发的影响，本发明人制备了毛发细胞模型。具体而言，从植发患者获得健康、正常的成年人的头皮组织，来分离生长期阶段的毛囊。

具体而言，制备毛囊细胞分离培养基，以从生长期阶段的毛囊分离真皮乳头细胞和外根鞘细胞。通过将20％FBS(Hyclone)添加到含有DMEM/低葡萄糖(Hyclone)的基础培养基来制备毛囊细胞分离培养基。

结果，可以从成年人头皮组织中分离生长期阶段的毛囊。

2.2从分离的毛囊器官分离毛囊构成细胞

使用实施例2.1中分离的毛囊细胞，分离作为毛囊器官的外根鞘细胞和真皮乳头细胞。具体而言，使用毛囊器官培养基培养生长期阶段的毛囊细胞。

在加入1000μL毛囊器官培养基后，生长期阶段的毛囊细胞培养在培养箱中在37℃、满足5％CO₂/95％空气的条件下进行。每培养4天更换一次培养基，并且第二传代主要用于实验。

具体而言，使用William E培养基(Gibco)作为毛囊器官培养基的基础培养基，添加100u/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、10μg/mL胰岛素和10ng/mL氢化可的松。

结果，可以从生长期阶段的毛囊细胞中分离出作为毛囊器官的外根鞘细胞和真皮乳头细胞。

2.3毛囊构成细胞的培养

为了制备用于测试该肽对脱发治疗的效果的细胞模型，对实施例2.2中分离的毛囊器官进行培养。

具体而言，将每孔两个毛囊置于毛囊器官培养基中，并在37℃、满足5％CO₂/95％空气的条件下进行培养。每3天更换一次培养基。

对于毛囊器官培养基，对毛囊器官使用各自不同的培养基。外根鞘细胞在EpiLife培养基(Cascade Biologics)中培养，并且真皮乳头细胞在添加有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和20％FBS的基于DMEM(Hyclone)的基础培养基中培养。EpiLife培养基是含有60μM氯化钙的无菌液体培养基。

结果，获得了15种分离的真皮乳头细胞(DP细胞分离)和30种外根鞘细胞(ORS细胞分离)。

真皮乳头细胞(DP细胞)是一组皮肤间充质细胞，它不仅调节毛囊的发育和生长，而且还已知作为多能干细胞的储存库，并因此对脱发治疗而言重要。

此外，外根鞘细胞(ORS细胞)是围绕毛发纤维和内根鞘的细胞。外根鞘细胞由皮肤表面的基底细胞、棘细胞和颗粒层组成。它还可能包括实施毛囊特定功能的细胞，代表了适合皮肤置换的角质形成细胞的替代性来源。

实验例

实验例1.细胞实验中的肽对脱发治疗的效果的确定

1.1毛囊器官中按照浓度的肽处理

使用实施例1的肽，对在实施例2中的细胞模型中的治疗或预防脱发的效果进行确定。分别用1pM、100pM和1000pM的各个不同浓度的肽处理细胞模型。用Scr肽进行处理作为阴性对照组。实验中使用的所有肽的纯度为95％或更高。

1.2使用MTT测定的细胞活力测定

将实施例2中的真皮乳头细胞和外根鞘细胞分别培养在96孔板中，然后在无血清培养基中按类型和浓度用肽进行处理。接下来，在3天后，将细胞在MTT溶液处理后在570nm下进行测量。同时，还通过进行MTT分析来比较未经处理的阴性对照组和经10U促红细胞生成素处理的对照组。

与1000pM肽相比，10U具有与EPOR相似的结合程度。

1.3使用实时PCR的细胞活力测量

为了检测对真皮乳头细胞增殖至关重要的细胞因子的基因表达水平，将实施例2中的真皮乳头细胞和外根鞘细胞用各个肽进行处理，然后在24小时后分离总RNA。接着，由分离的总RNA合成cDNA，并使用待分析基因的引物使合成的cDNA经受PCR。

1.4确定毛囊在孵育时间内的生长

按浓度用本公开的肽处理实施例2中的人毛囊细胞，然后培养3天、6天和9天。培养后，用显微镜对生长的毛囊细胞拍照用于比较。对生长的毛发的长度进行测量并用mm表示。同时，在未经处理的阴性对照组和经10U促红细胞生成素处理的对照组中，对生长的毛发的长度进行测量并比较。与1000pM肽相比，10U具有与EPOR相似的结合程度。

1.5肽在细胞模型中的作用的确定

结果，如图1所示，与阴性对照组相比，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的所有肽显示出高度的细胞分化。此外，与用促红细胞生成素处理的对照组相比，发现本公开的三种类型的肽即使以引起对受体较少结合的量进行处理时也显示出优异的效果。在这种情况下，由于与1000pM肽相比，10U具有与EPOR相似的结合程度，并且由于未使用促红细胞生成素而没有特定的副作用，因此一个方面的肽可以按比促红细胞生成素更小的量使用而显示出脱发治疗效果。

此外，如图2所示，当将SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的所有肽与阴性对照组进行比较时，毛发生长得到促进。此外，与用促红细胞生成素处理的对照组相比，由于未使用促红细胞生成素，因此没有特定的副作用。同时，以比促红细胞生成素少的量得到脱发治疗效果。

接下来，如图3所示，作为确定对真皮乳头细胞增殖而言重要的细胞因子的基因表达水平的结果，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的肽增加了毛发生长相关因子、角质形成细胞和细胞因子的基因表达水平。

此外，如图4所示，作为确定对外根鞘细胞分化而言重要的细胞因子的基因表达水平的结果，发现参与外根鞘细胞分化的所有细胞因子均增加。结果显示增粗毛发的效果，从而对毛发生长具有有利的效果。

特别的是，与用促红细胞生成素处理的对照组相比，由于没有使用促红细胞生成素，因此没有特定的副作用。并且同时，尽管用比促红细胞生成素更小的量，表达的增加程度更优。

由于真皮乳头细胞增殖意味着最终产生毛发的干细胞增殖，这表明毛发生长效果显著，而且实验结果指示IGF是参与增殖的细胞因子。确定了该作用比EPO的作用更为显著。

实验例2.动物实验中的肽对脱发治疗的效果的确定

2.1在实验动物中按浓度的肽处理

使用实施例1中的肽，在实验动物中确定治疗或预防脱发的效果。具体而言，为了提高动物实验中的精确度，使用了两种方法进行动物实验，所述方法通过以下进行：将肽注射到珠中后将珠皮下注射到实验动物中；或者通过重复注射所述肽。实验动物根据注射方法分为珠-肽注射模型实验组和肽注射模型实验组。两个实验组中的实验动物分别用1000pM的肽进行处理。

将Bio-rad Bead产品(#153-7302)用于珠-肽注射模型的实验组。具体地，将珠上的杂质去除并清洗，然后将各个肽和珠结合并在37℃下孵育。接下来，使用针头将最终结合的珠-肽注射到实验动物的皮下脂肪层中。另外，对于肽注射模型的实验组，使用注射将实施例1中的肽注射到实验动物的皮下脂肪层中。

2.2H和E染色分析方法

完成动物实验后，在肽的注射区域周围切下皮肤组织。将组织在固定剂中固定，并在将所述组织以冷冻切片形式处理后冷冻保存。通过使用切片机将冷冻组织切成厚10μm的片，进行苏木精和伊红染色。

2.3确定肽在实验动物中的作用

结果，如图5和图6所示，两种方法中，一个方面的肽均有效地引起毛发生长。

特别的是，如图7和图8所示，观察到MLPH具有比任何其它肽更优的效果。当将根据一个方面的肽注射到实验动物中时，在珠注射方法和肽注射方法两者中均观察到有效的毛发生长促进作用。特别是，在动物实验的情况中，发现一个方面的肽具有比促红细胞生成素更显著的毛发生长作用。

上述结果表明，一个方面的肽可有效地作为用于脱发治疗的组合物而发挥功能。

<110> 大邱庆北科学技术院

<120> 用于预防或治疗脱发的肽及其用途

<130> PN131497

<160> 4

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLP氨基酸肽

<400> 1

Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu

1 5 10 15

Leu Arg Ala

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLP-C氨基酸肽

<400> 2

Arg His Val Lys Lys Arg Val Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Thr Leu

1 5 10 15

Leu Arg Ala

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLP-H氨基酸肽

<400> 3

Leu His Val Leu Lys Ala Val Ser Gly Leu Leu Thr Leu Thr Met Ile

1 5 10 15

Arg Arg Ala

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Scr氨基酸肽（阴性对照）

<400> 4

Met Glu Leu Ser Gly Arg Thr Leu Gly Leu Ile Leu Lys Leu Arg Gln

1 5 10 15

Ser Ala Thr

Claims (13)

1.一种用于预防和治疗脱发或促进毛发生长的药物组合物，所述组合物包含肽作为活性成分，所述肽包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所组成的组中的任意一种氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述肽促进真皮乳头(DP)细胞或毛母细胞的生长。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述肽促进外根鞘(ORS)细胞的生长。

4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述肽促进毛发生长相关细胞因子的表达。

5.如权利要求1所述的组合物，其中，以10ppm至10000ppm的量包含所述肽。

6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述肽具有毛发生长、促进毛发生长或毛发养护的作用。

7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述脱发为选自于由以下所组成的组中的一种或多种：斑秃、遗传性雄激素性脱发、休止期脱发、外伤性脱发、拔毛癖、压力性脱发、生长期落发、糠秕性脱发、梅毒性脱发、脂溢性脱发、症状性脱发、瘢痕性脱发或先天性脱发。

8.一种用于预防或改善脱发的皮肤外用制剂组合物，所述组合物包含肽，所述肽包含选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所组成的组中的任意一种氨基酸序列。

9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述预防或改善脱发为促进毛发生长或使毛发增粗。

10.如权利要求8所述的组合物，其中，所述皮肤外用制剂组合物是准药物或化妆品组合物。

11.如权利要求8所述的组合物，其中，所述皮肤外用制剂组合物是选自于由如下所组成的组中的中的一种或多种：生发剂、头皮诊治剂、头皮除垢剂、头皮按摩剂、头皮护理剂、清洁剂、香波、养护剂、护发素、头发洗剂、凝胶、发膜、发乳、亮发素、发粉、喷雾剂、发油、皂、软膏、头发定型剂、染发剂、烫发剂、头皮养护剂、头皮洗剂、头皮乳、头皮精华、发用摩丝、发胶、眉毛生长促进剂、睫毛生长促进剂、睫毛营养剂和宠物香波或宠物护毛素。

12.如权利要求8所述的组合物，其中，以10ppm至10000ppm的量包含所述肽。

13.如权利要求8所述的组合物，其中，所述脱发为选自于由以下所组成的组中的一种或多种：斑秃、遗传性雄激素性脱发、休止期脱发、外伤性脱发、拔毛癖、压力性脱发、生长期落发、糠秕性脱发、梅毒性脱发、脂溢性脱发、症状性脱发、瘢痕性脱发或先天性脱发。

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