CN115298302A - 增强乙醇发酵的方法 - Google Patents

Abstract

提供形成乙醇发酵增强混合物的方法。该方法包括如下步骤：将干酵母与至少0.1体积％的Baclyte或香蕉提取物和酵母生长培养基水合以产生预发酵混合物；并且将预发酵混合物在20℃至40℃的温度下保持30分钟至8小时以形成增强混合物。还提供形成乙醇10增强混合物的另外的方法。该方法包括如下步骤：提供水合的活化酵母的溶液；用0.1体积％至25体积％BacLyte或香蕉提取物补充水合的活化酵母的溶液；并且将水合的活化酵母的溶液在20℃至40℃的温度下保持30分钟至8小时以形成增强混合物。还提供发酵方法。该方法包括如下的15步骤：制备乙醇增强混合物；将增强混合物添加到含有糖源的本体发酵混合物；并且将本体发酵混合物保持在2℃至40℃的温度以允许糖源发酵成乙醇。

Description

增强乙醇发酵的方法

技术领域

本发明涉及经由发酵由糖产生乙醇并且提供增强(提高)发酵过程的方法。

背景技术

乙醇作为酒精(醇)用于各种不同的饮料中，例如啤酒和苹果酒、葡萄酒和蒸馏酒精(白酒)如伏特加、杜松子酒、朗姆酒和威士忌。在所有那些饮料中，乙醇是经由使用酵母的发酵过程由天然糖源产生的。乙醇还具有作为生物燃料的另外的用途，其通常也经由发酵过程产生。

酵母是兼性厌氧菌；这意味着它可在有氧或无氧两种条件下存活和生长。氧的存在决定细胞的代谢归宿。就酵母细胞而言，其存活、生长和代谢在氧的存在下是最佳的，其中它将快速生长至高密度并将在其环境中的葡萄糖转化为二氧化碳和水。然而，在厌氧条件下，酵母生长缓慢得多并生长至较低的细胞密度，并且葡萄糖未完全代谢产生乙醇和二氧化碳。酵母的厌氧生长是发酵过程的基础。

随着发酵进行，发酵混合物内的乙醇浓度增加。该过程持续到直至如下时间点：在该时间点，高乙醇浓度开始变为毒性的并且开始杀死酵母细胞。商业酿造(酿酒)和蒸馏酵母菌株已经以吸引人的特征进行培育，例如最小化发酵的停滞期；加速的代谢活性，这改善乙醇的生产速率；以及增加的对酒精的耐受性，使得酵母细胞可在较高浓度的乙醇中存活，从而促进来自每次发酵的乙醇产量(产率)的增加。酿造和蒸馏酵母典型地耐受培养物中低于6％酒精体积分数(酒精度，ABV)的乙醇水平，当乙醇浓度超过该水平时，它们开始被杀死；但是一些商业酵母菌株已显示出能够耐受最高达15％ABV的乙醇水平。

发酵过程的速度取决于发酵混合物的环境条件，例如温度、发酵混合物的糖含量、酵母量以及随着过程持续的发酵混合物的酒精浓度。

啤酒和苹果酒发酵在一些方面不同于葡萄酒和蒸馏发酵二者，因为酿造者不希望啤酒和苹果酒含有最高的酒精水平。因此，一旦ABV达到约4-6％，对于啤酒和苹果酒发酵的发酵过程通常停止。对于啤酒和苹果酒酿造者来说，期望优化发酵过程的速度和效率以尽可能快地达到所需的ABV，而不是增加乙醇的总产量。然而，蒸馏酒者寻求优化发酵速度和效率，同时从每次发酵产生可能的最大量的乙醇；因为当从发酵中提取时，正是该乙醇形成其产品的基础。因此，改善来自每次发酵的总乙醇产量对于蒸馏酒者而言是非常具有商业吸引力的。

通常，商业发酵由两个单独的过程组成：初始的酵母增殖阶段，以及然后的其中产生酒精的全发酵阶段。需要增殖阶段来提供足够量的处于代谢活性状态的酵母细胞，以使原料能够有效发酵。增殖可作为发酵之外的单独过程进行；然后将得到的待发酵母添加到发酵混合物中，或者其可对于发酵原位发生；其中典型地将干酵母以所需的量添加至发酵，然后让其在停滞期(即发酵的前4至6小时)内代谢复苏。

在初始的酵母增殖阶段中，通常在合适的生长培养基和环境中培养酵母。该过程允许初始的小的代谢休眠细胞(典型地以干的形式)群复苏以变得具有代谢活性，然后进入复制期，该复制期将产生适用于随后的全发酵阶段的大得多的群。初始的酵母增殖阶段的条件应使得产生最大量的酵母，其在随后的全发酵阶段中提供最佳的发酵性能。为了实现这一点，酵母增殖阶段在有氧条件下进行，这促进形成酵母的细胞膜的不饱和脂肪酸和甾醇的产生。这些分子对于生长和发酵二者都是重要的，并且充当在酵母细胞内储存氧的手段。它们对于增加酵母细胞质量(生长)、改善营养物的总摄取、和决定随后在全发酵阶段中使用的酵母细胞的酒精耐受性也是必要的。氧还刺激对于酵母代谢和摄取麦芽糖所必需的分子的合成，麦芽糖是麦芽汁中的主要糖，其为用于制造啤酒、苹果酒和蒸馏酒精的原料。

在任何酵母增殖阶段中如下是重要的：首先将酵母在生长培养基中水合并培养，所述生长培养基支持其生长，并且当添加到随后的全发酵阶段时，对生长或风味既不是不利的也不是毒性的。在最佳的生长温度下，在合适的生长培养基中培养酵母，以使其增殖。合适的生长培养基典型地包括蛋白胨、酵母提取物、和右旋糖或葡萄糖。市场上有许多变种的商业生长培养基，其中这些成分的量略有不同，但它们通常被称为YPD培养基。YPD培养基含有葡萄糖或右旋糖作为糖源，包括酵母提取物和蛋白胨以提供生长所必需的氮和氨基酸。酵母提取物还提供维生素B复合物。已经可靠地发现YPD培养基在适当的条件下提供优异的酵母的增殖。

替代地，酵母的增殖可包括在本体(大量)发酵(bulk fermentation)过程中，其中简单地将干酵母添加到本体发酵混合物而不预先水合或培养。在这种情况下，存在初始时间段，在该初始时间段期间发生很少的发酵或不发生发酵，同时酵母在本体发酵混合物内原位增殖。该初始时间段称为停滞期(迟缓期，lag-phase)，并且典型地在酿造和蒸馏酵母的情况下持续约四到六个小时，然后酵母进入复制期。该停滞期的缩短对于啤酒和苹果酒酿造者以及蒸馏酒者而言都是期望的。

在一些发酵中，利用来自先前发酵或来自连续增殖源的酵母。在这些情况下，与干酵母的增殖相反，酵母已经被水合和活化，并且可有足够的量直接添加到本体发酵以立即开始发酵。因此，当使用这样的活的和活化的酵母源时，不需要水合和培养酵母或增殖阶段。取而代之地，将适量的活的、活化的酵母添加到本体发酵混合物，并且酵母几乎立即进入复制期。在这样的情况下，通常不使用对于酵母的生长培养基。

EP1945763描述了用于促进细菌的生长的提取物。该提取物是粗(粗制，crude)香蕉提取物，其特别地用于促进乳酸菌的生长。该提取物被定义为由芭蕉种(Musa spp)得到的提取物，该提取物通过如下产生：将至少一部分芭蕉果实、优选地香蕉在合适的稀释剂中在不添加另外的补充物(增补剂)的情况下共混，并且将提取物在121℃下在103kpa下高压灭菌15分钟；并且该提取物以0.01-10％的浓度存在于培养基中。本申请中对“香蕉提取物”的提及理解为是对EP1945763的提取物的提及。

EP2773744公开了用于促进细菌和酵母的生长的补充物。该补充物可用于促进酵母的生长。特别地，EP2773744公开了利用该补充物来提供增强的微生物(包括酵母)的产量的方法。该补充物可提供酵母和其它微生物的改善的产量。EP2773774中公开的补充物是根据其中公开的方法制备并且以名称BacLyte商业化的香蕉植物提取物。EP2772744在图11和12显示利用BacLyte补充的培养基改善酵母的生长。图11显示酵母在RPMI-1640培养基中的生长；RPMI-1640培养基是一种通常不支持酵母生长的培养基，因为它不含在YPD培养基中存在的氨基酸。该图显示酵母在用BacLyte补充和不用BacLyte补充的情况下在RPMI-1640中的生长，并且清楚地证明添加BacLyte补充物促进在这种否则为非支持性的培养基中的酵母生长。因此，从EP2772744明晰，在不存在YPD培养基的情况下，BacLyte补充物可提供改善的酵母的生长。图12显示酵母在具有和不具有BacLyte的10％糖蜜溶液中的生长。在没有BacLyte的情况下，酵母生长小，而在补充BacLyte的情况下，酵母生长高得多。

在EP2772744的图11和图12二者中，已经显示，在不存在YPD的情况下，BacLyte补充物可提供优异的酵母的增殖。EP2772744表明，BacLyte补充物允许使用替代的对于酵母生长的培养基以避免包括氨基酸的需要，氨基酸可干扰酵母的下游加工，参见[0043]和[0044]段。即，根据EP2772744的教导，BacLyte补充物允许使用除YPD以外的生长培养基。

发明内容

本发明的第一实施方式提供形成乙醇发酵增强混合物的方法，其包括如下步骤：

将干酵母与至少0.1％根据EP1945763的Baclyte或0.1％根据EP1945763的香蕉提取物和YPD培养基水合(用至少0.1％根据EP1945763的Baclyte或0.1％根据EP1945763的香蕉提取物和YPD培养基将干酵母水合)以产生预发酵混合物；并且

将预发酵混合物加热至25℃至40℃持续30分钟至8小时以形成增强混合物。

如上所述，BacLyte是一种已被发现促进包括酵母在内的多种微生物的生长的补充物。先前已经发现BacLyte补充物允许使用除YPD以外的培养基来生长酵母。根据本发明，已发现，对于酵母而言补充YPD培养基与BacLyte优于单独使用BacLyte或单独使用YPD。根据EP1945763的香蕉提取物已用于促进细菌生长。令人惊讶地，已经发现BacLyte或根据EP1945763的香蕉提取物与YPD的组合比从它们彼此单独使用所合理预期的更有利。特别地，BacLyte或根据EP1945763的香蕉提取物与YPD的组合导致在本发明的方法期间更大的酵母的增殖和以更快的速率增殖。进一步地，已经发现，从含有BacLyte或根据EP1945763的香蕉提取物和YPD培养基的预发酵混合物增殖的酵母，当用于随后的本体发酵时，具有改善的发酵效率和增加的酒精耐受性。这意味着使用根据本发明方法的发酵增强混合物的本体发酵阶段的发酵效率优于使用根据现有技术增殖的酵母的本体发酵阶段。

本发明的方法的第一实施方式可使用任何合适的酵母菌株。预期目前在商业发酵中使用的所有酵母能够用于本发明的方法。酵母可为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，例如由Fermentis生产的Safspirit HG-1或任何其它可商购的等同物。

根据本发明的方法的第一实施方式，将混合物保持在20℃-40℃的温度。如下可为有利的：取决于酵母的菌株，将混合物保持在32℃-38℃的温度或20℃-25℃的温度。可将混合物保持在约35℃的温度。

在本发明方法的第一实施方式中，BacLyte或香蕉提取物的量可为0.1体积％至25体积％、0.1体积％至20体积％、或0.1体积％至15体积％。BacLyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量可为0.5体积％至1.0体积％。BacLyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量可为1.0％至4.0％、例如1.0％至2.0％、2.0％至3.0％、或3.0％至4.0％。BacLyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量可为2.5％。替代地，BacLyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量可为4体积％至12体积％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％。BacLyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量可为5％至10％。

任何合适的YPD培养基或支持酵母生长的其它培养基可用于本发明的方法中。合适的YPD培养基可包括约10％酵母提取物、20％蛋白胨和20％右旋糖，其余为水。支持酵母生长的其它培养基对本领域技术人员来说是即刻明晰的。一些支持酵母生长的培养基包括氨基酸，本发明的方法的第一实施方式适合在这样的培养基的情况下使用。支持酵母生长的其它培养基不包括氨基酸，本发明的方法的第一实施方式也适合在这样的培养基的情况下使用。

本发明还包括向树瘤混合物(wart mix)即滚动(rolling)酵母增殖混合物添加0.1％至15％的Baclyte或香蕉提取物，例如5％Baclyte或5％香蕉提取物。我们预期这提供相同的预料不到的技术效果，因为所得混合物将是Baclyte或香蕉提取物与包含酵母的富含营养物的培养基的组合。

可将预发酵混合物在温度下保持2至8小时、例如3.5至4.5小时、或5至8小时。可将预发酵混合物在温度下保持约4小时。预发酵混合物在温度下保持的时间长度可取决于在预发酵混合物中的酵母菌株的代谢速率。一些酵母在代谢上比其它酵母慢，并且将需要将发酵混合物在温度下保持更长的时间。代谢较慢的酵母菌株典型地将在温度下保持6至8小时。代谢较快的酵母典型地将在温度下保持2至6小时。

如下所述，申请人有数据表明，在本发明的预发酵混合物中增殖的酵母具有更高的酒精耐受性，允许在酒精毒性的作用导致细胞死亡之前使用酵母生产更大浓度的酒精。该效果是特别有利的，因为它可允许大得多的酒精生产的效率。认为，即使在预发酵混合物中增殖的酵母用于本体发酵而没有另外补充BacLyte或香蕉提取物的情况下，该效果也存在。

本发明的第二实施方式提供形成乙醇发酵增强混合物的方法，其包括如下步骤：

提供水合的活化酵母(活性酵母)的溶液；

用0.1体积％至25体积％的BacLyte或根据EP1945763的香蕉提取物补充水合的活化酵母的溶液；并且

将水合的活化酵母的溶液在20℃至40℃的温度下保持30分钟至8小时以形成增强混合物。

可用0.1％至25％的BacLyte或香蕉提取物或0.1％至20％的BacLyte或香蕉提取物或0.1％至15％的BacLyte或香蕉提取物补充所述混合物。

本发明的第二实施方式的水合的活化酵母的溶液可从任何合适的来源提供。例如，水合的活化酵母的溶液可从连续的增殖源或从先前的本体发酵源提供。合适的水合的活化酵母的来源对本领域技术人员来说将是即刻明晰的。

以与在前的实施方式相同的方式，本发明的替代实施方式是有利的，因为其可由于使酵母暴露于BacLyte或香蕉提取物一段时间而提供具有更大的酒精耐受性和更大的活性的酵母。于是该酵母可用作乙醇发酵增强混合物且向利用所述发酵增强混合物的任何随后的本体发酵提供改善的发酵特性。向随后的本体发酵阶段补充BacLyte或香蕉提取物不是必要的，然而如果优选的话，这可以进行。

本发明的方法的第二实施方式可使用任何合适的酵母菌株。预期目前在商业发酵中使用的所有酵母能够用在本发明的方法中。该酵母可为酿酒酵母，例如由Fermentis生产的Safspirit HG-1或任何其它可商购的等同物。该酵母可为在下面描述的四种研究中使用的酵母的任一种。

根据本发明的方法的第二实施方式，将混合物保持在20℃至40℃的温度。如下可为有利的：取决于酵母的菌株，将混合物保持在32℃至38℃的温度或20℃至25℃的温度。可将混合物保持在约35℃的温度。

根据本发明的方法的第二实施方式，用0.1体积％至15体积％的BacLyte或香蕉提取物补充水合的活化酵母的溶液。BacLyte或香蕉提取物的量可为0.5体积％至1.0体积％。BacLyte或香蕉提取物的量可为1.0％至4.0％、例如1.0％至2.0％、2.0％至3.0％、或3.0％至4.0％。BacLyte或香蕉提取物的量可为2.5％。替代地，BacLyte或香蕉提取物的量可为4体积％至12体积％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、或11％。BacLyte或香蕉提取物的量可为5％至10％。

与本发明的第一实施方式相反，本发明的第二实施方式不涉及干酵母的增殖，而是它使水合的活化酵母暴露于BacLyte或香蕉提取物30分钟至8小时的时间段。因此，不需要用支持酵母生长的培养基例如YPD来补充水合的活化酵母的溶液。然而，将这样的培养基添加到水合的活化酵母的溶液可为有利的。在这样的情况下，任何合适的YPD培养基或支持酵母生长的其它培养基可用于本发明的方法中。适用于本发明的方法的第一实施方式的任何培养基也将适用于本发明的方法的第二实施方式。

可将用BacLyte或香蕉提取物补充的水合的活化酵母的溶液在温度下保持2至6小时，例如3.5至4.5小时、或5至8小时。可将用BacLyte或香蕉提取物补充的水合的活化酵母的溶液在温度下保持约4小时。用BacLyte或香蕉提取物补充的水合的活化酵母的溶液在温度下保持的时间长度可取决于预发酵混合物中的酵母菌株的代谢速率。一些酵母在代谢上比其它酵母慢，并且将需要将发酵混合物在温度下保持更长的时间。代谢较慢的酵母菌株典型地将在温度下保持6至8小时。代谢较快的酵母典型地将在温度下保持2至6小时。

根据本发明的方法制备的包括BacLyte或香蕉提取物的增强混合物对于增强发酵是特别有用的。然而，增强混合物可用于需要酵母的活性的任何过程，包括酵母发酵、厌氧消化和烘烤过程。

本发明还提供：

发酵方法，其包括如下步骤：

i)制备根据本发明的增强混合物；

ii)将增强混合物添加到含有糖源的本体发酵混合物；并且

iii)将本体发酵混合物保持在2℃至40℃的温度以允许糖源发酵成乙醇。

已发现根据本发明的方法的发酵提供比使用根据现有技术增殖的酵母发酵更高的乙醇产量。特别地，本发明的增强混合物中所含的酵母被认为具有更高的酒精耐受性，从而作为在发酵中酵母细胞的改善的存活性的结果而允许发酵在发酵过程结束时产生更高浓度的酒精。此外，已发现发酵以更快的速率发生。认为，这是由于增强混合物中的酵母作为在添加到本体发酵混合物之前其暴露于BacLyte或香蕉提取物的结果而为更加代谢活性的。如将容易理解的，以提供更快的速率的发酵并提供更高的最大酒精产量的发酵方法相对于现有技术是显著有益的。

本发明的发酵方法是特别有利的，因为它不需要用BacLyte或香蕉提取物补充本体发酵混合物，这先前在现有技术中被认为是必要的。取而代之地，已发现用BacLyte或香蕉提取物补充的优点通过补充增强混合物发生，而不论本体发酵混合物是否还被补充。这是有利的，因为BacLyte或香蕉提取物与发酵混合物的其它组分相比相对昂贵，并且目前不以适用于本体发酵中的体积生产。

本发明的糖源可为任何合适的来源，包括，但不限于，糖蜜、土豆淀粉、谷物来源和甘蔗来源。预期，本发明将以基本上任何促进发酵的糖源来工作。合适的淀粉和糖基乙醇原料的其它实例包括，但不限于，龙舌兰、稻米和玉米。本发明的糖源还可为在纤维素乙醇原料中通过其它微生物将木质纤维素分解成更多基础糖，如在厌氧消化过程中使用的。

此外，已发现，与不包括BacLyte的发酵混合物相比，将BacLyte直接添加到本体发酵混合物导致相对高水平的乙酸乙酯和乙酸异戊酯。乙酸异戊酯具有强烈的香蕉类气味和特征性的香蕉类风味。这不是出乎预料的，因为BacLyte是香蕉提取物的水溶液，并且认为，BacLyte可在发酵混合物中产生乙酸异戊酯方面起作用。乙酸乙酯具有水果气味以及白兰地香型，且具有令人愉悦的味道，尽管被稀释。虽然这两种化合物本身都不会令人不快，但如果意图将来自发酵混合物的酒精用于特定饮料，则强烈风味的化合物的存在可为不利的，因为那些风味也将存在于最终的饮料中。类似地，将香蕉提取物添加到本体发酵混合物也产生具有一定程度香蕉风味的液体。例如，用BacLyte补充本体伏特加发酵混合物可产生香蕉风味的伏特加，这通常不是优选的。通过在单独的预发酵混合物中使用BacLyte或香蕉提取物，避免该问题，因为在本体发酵混合物发酵后，发现仅存在低水平的乙酸乙酯和乙酸异戊酯。因此，在根据本发明的发酵方法的实施方式中，除了存在于增强混合物中的BacLyte或香蕉提取物之外，不另外用BacLyte或香蕉提取物补充本体发酵混合物。

附图

图1为显示对照发酵混合物中随时间的平均累积重量损失的图；

图2为显示包括水合的酵母增强混合物的发酵混合物中随时间的平均累积重量损失的图；

图3为显示包括含BacLyte的水合的酵母增强混合物的发酵混合物中随时间的平均累积重量损失的图；

图4为显示包括含YPD的水合的酵母增强混合物的发酵混合物中随时间的平均累积重量损失的图；

图5为显示包括含YPD和BacLyte的水合的酵母增强混合物的发酵混合物中随时间的平均累积重量损失的图；

图6为显示对于图1-5的样品的理论平均酒精产量的图；

图7为显示对于四种不同的本体发酵混合物的预期的随时间的乙醇浓度的增加的图；

图8为显示对于下面描述的第二研究的谷物试验的随时间的比重的图；

图9为显示对于下面描述的第二研究的甘蔗试验的随时间的比重的图；

图10为显示对于下面描述的第四研究的试验的随时间的比重的图；和

图11为显示对于下面描述的第四研究的试验的随时间的酒精体积分数(酒精度)的图。

第一研究

对于使用BacLyte形成增强混合物的第一研究的结果示于图1至7中。具体地，进行了以下研究：

增强混合物的制备

使用酿酒酵母蒸馏酒者的酵母(由Fermetis生产的Safsprit HG-1)一式三份地制备四种增强混合物样品。使各样品经受不同的水合方案，连同其中酵母未进行水合的对照样品一起。各样品的水合方案如下：

样品	组分
		对照(C)	仅干酵母
水(W)	干酵母与蒸馏水
		水与BacLyte(WB)	干酵母、蒸馏水、5体积％BacLyte
水与YPD(WY)	干酵母、YPD
		水、YPD、与BacLyte(WYB)	干酵母、YPD、和5体积％BacLyte

表1

使各样品水合4小时并保持在35℃的温度。各样品含有0.5g的Safsprit HG-1酵母。然后将得到的增强混合物用于含糖的发酵混合物的发酵。在含有YPD的样品中，样品由10％酵母提取物、20％蛋白胨、20％右旋糖(按体积计)组成，不包括任何BacLyte组分。

发酵混合物的制备

使用Maris Piper土豆作为发酵混合物的基础糖源。将土豆充分冲洗和擦洗以从其表面除去任何污垢或碎屑。然后将它们切碎，然后用搅拌机压碎。以每升水1kg土豆的比率产生土豆和水的混合物。将混合物均化并倒入2升瓶中。

为了使各瓶中的淀粉成胶状，将各瓶在115℃下加热14分钟。然后根据接受的剂量说明添加外源酶。具体而言，以每升1g添加蒸馏酒者的高温α-淀粉酶，在85℃下搅拌到各瓶中，然后将该瓶在85℃至90℃保持1小时。在冷却至60℃后，然后将蒸馏酒者的葡糖淀粉酶以每升1.4g添加到各样品，然后将该瓶在该温度下保持1小时。然后将该瓶冷却至30℃以形成发酵混合物。

发酵

在30℃下将增强混合物添加到瓶中，并且将该瓶保持在该温度。通过记录各瓶的重量变化和通过记录在发酵期间各发酵混合物的比重来监测发酵。

随后的处理

在发酵完成后，利用实验室筛组从各发酵混合物移除固体物质，该筛组包含分别具有1400μm和710μm的孔的丝网筛层。从各发酵混合物获得1升液体。此时，将来自一式三份的各样品的液体合并以产生3升液体，对于各不同的样品一份。

然后将各液体在5升铜蒸馏器中蒸馏以生产低度酒。监测由液体的蒸馏产生的低度酒的酒精含量，并且继续蒸馏，直到低度酒的酒精产生达到1％ABV。

随后，然后将低度酒在2升铜蒸馏器中蒸馏。收集前10ml作为酒头(初馏物)。使用Anton-Paar DMA 100手持式密度计测量各酒头的酒精含量。收集馏出物的接下来的部分作为酒心。在整个蒸馏过程中监测酒精的百分比，并收集酒心，直到与相应的酒头的ABV相比存在ABV的12.5％下降。丢弃残留液体。

结果

各预发酵样品的平均累积重量损失示于图1至5中。各样品的每小时的重量损失如下：

时间(小时)	C	W	WB	WY	WYB
						0-2	0.198±0.121	0.121±0.078	0.309±0.128	0.503±0.084	0.764±0.135
2-3	0.114±0.045	0.073±0.035	0.138±0.035	0.753±0.101	0.778±0.017
						3-19	2.662±0.005	2.906±0.236	2.595±0.236	3.548±1.073	5.115±1.585
19-21	0.010±0.005	0.014±0.005	0.016±0.003	0.033±0.001	0.017±0.004
						21-23	0.016±0.007	0.017±0.004	0.013±0.004	0.015±0.006	0.019±0.008
24-44	0.030±0.003	0.044±0.006	0.040±0.006	0.032±0.010	0.023±0.004

表2

发现，与C和W样品相比，在前两个小时WY和WYB样品的重量损失率的差异是统计学显著的(具有统计学意义)(p<0.05)。此外，在前两个小时，WYB样品的重量损失显著高于WB和WY样品的重量损失率。在发酵的第三个小时的重量损失在C、W和WB样品中减少，但在WY和WYB样品中增加。在第三个小时的重量损失在WY和WB样品中显著高于C、W和WB样品。在3-19小时的时间段内，在所有样品中重量损失显著增加。再次地，在WYB样品中发生最高的重量损失，并且该重量损失显著高于任何其它样品。在19小时后，每小时的重量损失率明显减少。这种减少的每小时的重量损失在随后的时间段中持续。

由测量的重量损失，可由累积重量损失计算对于各样品的理论乙醇产量值。特别地，考虑到相应组分的分子量，通过发酵途径部分氧化葡萄糖的理论方程表明，每kg的葡萄糖，存在0.489kg的CO₂和0.511kg的葡萄糖的理论产量(Daoud&Searle，1990)。使用这些产量值，可由累积重量损失计算乙醇和CO₂产生。该计算的结果示于图6中并列于表3中：

样品	平均乙醇产量
		C	37.8g
W	40.5g
		WB	40.2g
WY	38.1g
		WYB	51.6g

表3

WB和WY样品未显示出比W样品多的乙醇产量并且显示出几乎没有比C样品多的乙醇产量。令人惊讶地，WYB样品产生比任何其它样品显著更多的乙醇，这显示出在预发酵中使用YPD培养基和BacLyte的组合相对于单独使用任一种是有利的。

在随后的处理期间产生的低度酒的体积和低度酒的酒精体积分数(酒精度)列于表4中：

样品	体积(ml)	酒精体积分数(％)
			C	950	13.9％
W	920	13.0％
			WB	995	13.4％
WY	905	13.9％
			WYB	910	14.9％

表4

与任何其它样品相比，WYB样品产生显著更高的酒精体积分数的低度酒。注意，WB和WY样品产生具有不高于对照样品的酒精体积分数的低度酒。

在随后的处理期间产生的酒心的体积和酒心的酒精体积分数列于表5中：

样品	体积(ml)	酒精体积分数(％)	酒精体积(ml)
				C	81	58.3％	47.2
W	102	54.9％	56.0
				WB	77	59.9％	46.1
WY	79	59.9％	47.3
				WYB	95	59.8％	56.8

表5

认为，表5中的对于W样品的结果是异常的。这是因为该样品的产生的液体体积和酒精体积分数与WB、WY或C样品的任一种都不相符。此外，与所有其它样品相比，W低度酒样品的酒精体积分数显著低于60％，并且低度酒的体积与W、WY和WYB样品类似且显著低于C或WB样品的任一者。因此，人们不会合理地预料到表5中的对于W的这样的高体积。另外，与所有其它样品相比，W样品中的酒精的量与以上表3中列出的理论酒精产量不相符。这表明，在从W样品产生酒心中可存在方法学问题，并且表5中显示的W样品的结果不正确。

如果W样品被接受为异常的，则WYB样品的酒心具有比其它样品大超过20％的酒精体积。最令人惊讶地，WYB样品的酒心具有比WY或WB样品的任一者大20％的酒精体积，这是从现有技术的公开内容预料不到的。

随后，使用采用火焰离子化检测器的气相色谱法(GC-FID)对于较高的酒精含量分析酒心各自的内容物。该分析的结果列于表6中。该表以ng/μl为单位显示各酒心的内容物：

组分	C	W	WB	WY	WYB
						乙醛	235.89	290.13	440.21	232.50	167.81
乙酸乙酯	1176.68	827.29	1814.29	1940.09	4235.89
						乙酸异戊酯	4305.99	3983.07	5883.56	6019.06	5915.97
正丁醇	196.97	172.68	185.78	193.34	159.31
						戊醇	5361.71	5715.15	6248.46	6127.21	5926.81
糠醛	665.16	930.98	441.22	535.93	538.65
						正丙醇	N/D	N/D	N/D	3099.78	385.327

表6

最重要地，在WYB样品中乙酸乙酯的量是任何其它样品的超过两倍，且为W样品的四倍。

在图7中，列出本发明的发酵的方法的理论效果。特别地，显示对于四种单独的本体发酵混合物的随时间的理论乙醇浓度。四种本体发酵混合物如下：

i)包括未预发酵以形成增强混合物的酵母的混合物；

ii)包括其中酵母已仅与YPD培养基水合的增强混合物的混合物；

iii)包括其中酵母已仅与BacLyte水合的增强混合物的混合物；

iv)根据本发明，包括其中酵母已与BacLyte和YPD培养基水合的增强混合物的混合物。

对于来自本体发酵的乙醇产量的限制的原因之一是酒精对酵母的毒性。在常规发酵中，当本体发酵混合物的酒精含量达到8.5％时，本体发酵混合物对酵母变得毒性并且发酵停止。因此，如图9中所示，其中酵母未暴露于BacLyte的本体发酵混合物的最大乙醇产量可能为8.5％。

BacLyte看来具有对酵母的应激反应起作用的作用模式。特别地，BacLyte看来允许酵母耐受最高达10％的较高酒精浓度。这显示在图7的本体发酵混合物的最大乙醇浓度上。因此，预期在预发酵混合物中使用BacLyte提高本体发酵的效率。

通过将混合物i)与混合物ii)、iii)和iv)进行比较，也显示使用预培养的效果。特别地，在混合物i)中，当酵母在本体发酵混合物内增殖时，存在约6小时的初始时滞。如果根据本发明使用增强混合物，则消除该时滞，因为酵母已经增殖。

另外，预期，与不使用BacLyte的本体发酵混合物的发酵相比，酵母与BacLyte的预培育导致本体发酵混合物的发酵速率增加。这是因为在BacLyte的存在下酵母的代谢活性增加。这可通过将混合物iii)和iv)的发酵速率与混合物i)和ii)的发酵速率比较看出。

总之，预期，与传统发酵方法或使用增强混合物的现有技术发酵方法相比，使用根据本发明制备的增强混合物的根据本发明的发酵以更快的速率提供更高的乙醇产量。

特别地，如以上表3的数据所示，发现使用根据本发明的增强混合物的本体发酵混合物的理论乙醇产量比使用根据现有技术的水合酵母的本体发酵混合物的理论乙醇产量高25％。根据现有技术的水合酵母包括在单独的水中水合的酵母、仅与BacLyte和水进行水合的酵母以及仅与YPD培养基水合的酵母。

第二研究

对于使用BacLyte和香蕉提取物形成增强混合物以及替代的糖源的第二研究的结果示于图8和9中。具体地，进行了以下第二研究：

根据在Hornig,J(2019)“A study into the efficacy of hydration regimes&novel nutrient-rich media on yeast propagation,fermentative activity anddistillate composition in potato-based Spirit”MSc dissertation[2018-2019]TheSchool of Engineering and Physical Sciences(“Hornig等)中列出的水合方案将酵母水合。第二研究是使用与Hornig等中使用的土豆原料不同的糖源进行的，其中这些测试研究“Propagreater”和香蕉提取物在谷物和甘蔗发酵中的效果。

材料：

·Yeast Pinnacle MG+(新鲜碎屑)；

·“Propagreater”：补充物，其由25％Baclyte和酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培养基的5x浓缩物组成；

·香蕉提取物；

·酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培养基溶液；

·原料：

ο谷物(黑麦、小麦和大麦)或，

ο甘蔗。

将酵母在35℃下以1:50(v/v)的酵母:水的比率水合6小时。使用的酵母是适应发酵温度的新鲜Pinnacle MG+，以2g/L的投放率(加酵母率，pitching rate)。

如下进行六个试验：

试验1 直接酵母投放

试验2 在水中培育6小时

试验3 在1x YPD培养基中培育6小时

试验4 在香蕉上清液5％和YPD的1x浓缩物中培育6小时

试验5 在“Propagreater”补充物(25％Baclyte和YPD的5x浓缩物)(用4份水稀释以使其为1x YPD加5％Baclyte)中培育6小时

试验6 在水和香蕉上清液5％中培育6小时

谷物发酵

进行组1的发酵，使用精细研磨的70％黑麦、20％小麦和10％发芽大麦的基料，在62℃下用外源淀粉酶、葡糖淀粉酶和纤维素酶糖化1小时，冷却至25℃，然后将酵母投放到发酵中。pH 5.2。该组的结果示于图1中。

比较各试验，我们可看到试验5(用“Propagreater”水合)与用干酵母或用水进行水合的酵母对照物投放相比具有短得多的停滞期和总体发酵曲线。类似地，试验3和4显示出明显的但远远不那么迅速的重力下降，这表明在水合阶段中在使用或不使用香蕉提取物的情况下用YPD预处理的正面影响。用香蕉提取物预处理酵母(试验6)也显示出正面效果，但显著低于单独的YPD或其与YPD组合使用时。

总体而言，该数据展示出，“Propagreater”在减少发酵的停滞期方面具有显著影响，并且比重的显著加速的下降表明加速的酒精产生。所述数据还表明YPD和香蕉提取物的组合的类似效用，尽管在酵母的性能或酒精合成速率方面具有明显不那么显著的改善(如通过降低比重所显示的)。在这种谷物发酵中，预处理中香蕉的存在导致比重的进一步下降，这表明最终发酵物中的较高酒精水平。

使用已知的计算将比重转换为百分比酒精体积分数：

·从最终重力减去原始重力。

·将该数字乘以131.25。

·所得的数字为你的酒精百分比，或ABV％

我们能够计算出对于“Propagreater”的最终％ABV的理论值为6.43％，对于YPD加5％香蕉提取物为6.56％，相对于6.04％的干酵母和用水进行水合的对照物的值。这产生来自这些发酵的酒精产量的理论改善，对于用“Propagreater”预处理为6.4％，且对于用YPD加香蕉提取物预处理为8.6％。

甘蔗发酵：

进行这些发酵，以甘蔗蒸煮酵母营养物的基料且用柠檬酸进行ph校正(pH 5.2)，在投放酵母前冷却至25℃。根据以上列出的对于谷物发酵的方法进行六个试验。唯一的区别是用于发酵的糖源是甘蔗源，而不是谷物源。试验的结果示于图8中。

比较各试验，可看出试验4(用YPD和香蕉提取物水合)和试验5(用“Propagreater”水合)展示出比干酵母(试验1)和用水进行水合(试验2)的对照物远远更快速减少的比重。试验1、2和3显示出比试验4、5和6(它们全部是观察用Baclyte(在“Propagreater”配制物中)或香蕉提取物预处理的酵母)长的停滞期。这清楚地展示出如下的效果：在预处理中Baclyte或香蕉提取物的存在导致增加的酵母的代谢活性。

这些测试证明“Propagreater”和香蕉提取物加YPD跨越(对于)多种原料改善发酵效率和产量的效用。除了图1和6中说明的和以上描述的土豆发酵之外，对于谷物源和甘蔗源二者都产生改善效果。

用“Propagreater”预处理在缩短停滞期和加速发酵方面产生有益效果。“Propagreater”在改善发酵速度方面展示出最高的性能，并且在水合阶段中较粗的香蕉提取物的存在也导致更大的比重降低。由最终比重计算酒精产量展示出YPD加香蕉提取物或“Propagreater”(YPD加Baclyte)的效果，在总产量方面具有正面效果。

第三研究

进行对于使用BacLyte和香蕉提取物形成增强混合物的第三研究。

根据在Hornig,J(2019)“A study into the efficacy of hydration regimes&novel nutrient-rich media on yeast propagation,fermentative activity anddistillate composition in potato-based Spirit”MSc dissertation[2018-2019]TheSchool of Engineering and Physical Sciences(“Hornig等)中列出的水合方案将酵母水合。

材料：

·HG-1酵母

·“Propagreater”：补充物，其由25％Baclyte和酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培养基的5x浓缩物组成；

·香蕉提取物；

·酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培养基溶液；

·原料：土豆泥

如下进行六个试验：

表7

各试验在50ml锥形培育容器中在水浴中在30度下培育6小时。在该培育时间段之后，将添加物与750ml的经酶处理且快速冷却的土豆泥一起投放到1000ml锥形发酵器中。然后对于密度、pH、酒精对这些进行测试，并且用单向呼吸器密封，该单向呼吸器用抗菌溶液密封。从投放开始，之后每6小时对试验进行测试以测定发酵的速率和生长直至完成。在完成时，将各发酵物在2度下储存以停止任何更多的苹果乳酸发酵或酯化，之后在97毫巴下进行真空蒸馏以蒸馏所有乙醇内容物，从而比较不同试验的LPA产量。

第三研究的结果如下：

	最终重力：	最终ABV：	mLPA：	最终pH：
					对照	1.0026	7.14％	53.55	4.09
试验1	1.0027	7.13％	53.48	4.22
					试验2	1.0017	7.52％	56.40	4.24
试验3	1.0014	7.56％	56.70	4.20
					试验4	1.0011	7.60％	57.00	4.14
试验5	1.0020	7.48％	56.10	4.12

表8

随时间的试验的比重如下：

时间	0小时	6小时	12小时	18小时	24小时	30小时	36小时	38.1小时
									对照物	1.053	1.0498	1.0428	1.0326	1.0281	1.0167	1.0056	1.0026
试验1	1.053	1.0422	1.0356	1.0281	1.0267	1.0155	1.0082	1.0027
									试验2	1.053	1.0392	1.0349	1.0273	1.0229	1.0122	1.0069	1.0017
试验3	1.053	1.0382	1.0331	1.0277	1.0237	1.0127	1.0049	1.0014
									试验4	1.053	1.0378	1.0328	1.0269	1.0225	1.0094	1.0032	1.0011
试验5	1.053	1.0399	1.0347	1.0279	1.0233	1.0157	1.0057	1.0020

表9随时间的试验的发酵ABV如下：

表10

如可看出的，在本发明中的发酵增强混合物的使用是显著有利的：与仅使用YPD作为增强剂的乙醇增强混合物(试验1)相比，其更快地产生更高的ABV。

第四研究

对于使用BacLyte和香蕉提取物形成增强混合物以及糖蜜糖源的第四研究的结果示于图10和11中。具体地，进行以下第二研究。

使用以下参数进行四个试验

表11

具体地，将以上列出的样品各自在100ml锥形瓶中在30度下培育6小时，然后将其在30度下投放到以上表11中列出的饲料级糖蜜、柠檬酸、水、糖和消泡剂的特定糖蜜共混物中，之后用无菌密封物密封以进行发酵。随后每6小时对于SG、Brix、pH、ABV和内部温度对这些进行检查。一旦完成发酵，使用Buchi R300 Rotovapor在97毫巴和50度下对这些进行蒸馏以提取乙醇，从而计算LPA产量。

试验的结果列于下面表12和13中并且示于图10和11中。

比重：

表12

发酵ABV：

表13

如可看出的，在本发明中的发酵增强混合物的使用是显著有利的：以糖蜜作为糖源，其产生比对照更高的ABV。这也验证了本发明的增强混合物在以糖蜜作为糖源的情况下的效果。“Propagreater”混合物(试验2)产生最高的酒精ABV，并且反直觉地，发现试验3的5％的香蕉提取物比试验1的20％的香蕉提取物更有效。因此，根据本发明，可优选包括10％或更少的香蕉提取物的量。

香蕉提取物的制备

以上讨论的以及本发明权利要求中的香蕉提取物通常可如下制备：

i)将在-84℃下储存的去皮香蕉从冷冻箱取出。将香蕉存放在冷冻袋中，并且通过使香蕉从坚硬桌面掉落约1英尺而温和地将香蕉打破。香蕉由于其温度而容易地打破。

ii)对于每100ml使用的水，取出250克香蕉块，并且在实验室工作台上放置到吸水纸巾上。

iii)可将香蕉保持在室温下25-40分钟，直到变软。

iv)在已经用蒸馏水清洗并充分冲洗的搅拌机中，添加经称重的香蕉果肉和水，使得搅拌机的一半至四分之三被填充。

v)以最高速度共混香蕉果肉/水混合物90秒。

vi)在共混后，将共混的香蕉泥倒入离心机容器中并且在20℃的温度下以至少3900rpm的速度或以更高的速度(如果离心机允许的话)旋转30分钟，然后以最低的速率减速以确保温和的制动。

viii)将上清液收集到大的Corning可高压灭菌的1L玻璃瓶中，在瓶中不超过600ml。

ix)在标准高压灭菌温度(121℃，25分钟，20磅压力)下高压灭菌以达到无菌状态。

x)允许上清液冷却30-45分钟，然后将上清液倒入新的、无菌的50ml聚丙烯管中，并且根据与共混水果的初始加工相同的参数进行一轮离心。

xi)将40ml上清液收集到无菌的50ml聚丙烯管中并且丢弃任何颗粒状固体碎屑。

如上所讨论的，该方法根据本发明并根据EP1945763B1产生香蕉提取物。在别处专利中或在EP1945763B1中公开的任何其它合适的用于制备EP1945763B1的香蕉提取物的方法可用作本发明的方法的替代方案。

Claims (24)

1.形成乙醇发酵增强混合物的方法，其包括如下步骤：

将干酵母与至少0.1体积％的Baclyte或0.1体积％的香蕉提取物和酵母生长培养基水合以产生预发酵混合物；并且

将预发酵混合物在20℃至40℃的温度下保持30分钟至8小时以形成增强混合物。

2.根据权利要求1的方法，其中该方法包括如下步骤：将干酵母与至少0.1％的Baclyte水合。

3.根据权利要求1的方法，其中该方法包括如下步骤：将干酵母与至少0.1％的香蕉提取物水合。

4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中酵母生长培养基为YPD培养基。

5.根据权利要求4的方法，其中YPD培养基包括10％酵母提取物、20％蛋白胨和20％右旋糖，其余为水。

6.根据任一前述权利要求的方法，其中酵母是酿酒酵母。

7.根据任一前述权利要求的方法，其中将混合物保持在32℃至38℃的温度。

8.根据任一前述权利要求的方法，其中Baclyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量为0.1体积％至25体积％。

9.根据权利要求8的方法，其中Baclyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量为0.5体积％至1.0体积％。

10.根据权利要求9的方法，其中Baclyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量为2体积％至10体积％。

11.根据权利要求10的方法，其中Baclyte或香蕉提取物在预发酵混合物中的量为5体积％。

12.根据任一前述权利要求的方法，其中将预发酵混合物在温度下保持2至8小时。

13.根据权利要求12的方法，其中将预发酵混合物在温度下保持3.5至4.5小时。

14.形成乙醇发酵增强混合物的方法，其包括如下步骤：

提供水合的活化酵母的溶液；

用0.1体积％至25体积％的BacLyte或0.1体积％至25体积％的香蕉提取物补充水合的活化酵母的溶液；并且

将水合的活化酵母的溶液在20℃至40℃的温度下保持30分钟至8小时以形成增强混合物。

15.根据权利要求14的方法，其中酵母是酿酒酵母。

16.根据权利要求14或权利要求15的方法，其中将水合的活化酵母的溶液保持在32℃至38℃的温度。

17.根据权利要求14-16任一项的方法，其中用0.5体积％-1.0体积％的BacLyte补充水合的活化酵母的溶液。

18.根据权利要求14-16任一项的方法，其中用2体积％-10体积％的BacLyte补充水合的活化酵母的溶液。

19.根据权利要求17的方法，其中BacLyte在水合的活化酵母的溶液中的量为5体积％。

20.根据任一前述权利要求的方法，其中将水合的活化酵母的溶液在温度下保持2至8小时。

21.根据权利要求20的方法，其中将水合的活化酵母的溶液在温度下保持3.5至4.5小时。

22.发酵方法，其包括如下步骤：

iv)制备根据任一前述权利要求的增强混合物；

v)将增强混合物添加到含有糖源的本体发酵混合物；并且

vi)将本体发酵混合物保持在2℃至40℃的温度以允许糖源发酵成乙醇。

23.根据权利要求20的发酵方法，其中本体发酵混合物不另外用除了存在于增强混合物中的BacLyte之外的BacLyte补充。

24.根据权利要求20或权利要求21的方法，其中糖源是土豆、糖蜜、谷物、甘蔗或任何其它合适的发酵原料。

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