CN115088819B - 一种泥鳅酶解去皮方法、裹涂泥鳅食品的制备方法及其应用 - Google Patents
一种泥鳅酶解去皮方法、裹涂泥鳅食品的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种泥鳅酶解去皮方法、裹涂泥鳅食品的制备方法及其应用，泥鳅酶解去皮方法包括，对泥鳅去粘液处理；将泥鳅进行酶解处理；过滤并回收酶解液；其中，所述进行酶解处理，采用蛋白酶进行酶解，料液比1:4，加酶量10～100u/g，pH为6～7，酶解温度25～70℃，酶解时间10～120min。本发明去除泥鳅表皮黑色素的同时保留营养物质，在利用泥鳅整鱼制备肉骨鱼肉糜，并以肉糜制备不同形式的裹涂食品，可供给骨质疏松者食用，使之比药品更易接受。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及到一种泥鳅酶解去皮方法、裹涂 泥鳅食品的制备方法及其应用。
背景技术
骨疾病已成为全球范围内致残的第二大因素，其治疗花费占全球国民生产 总值的3％。骨质疏松症是骨疾病中负担最重疾病，影响着全球三分之一的女 性和五分之一的男性的生活。骨质疏松症患者脊柱等骨折发生率高，导致行动 不便和相关并发症及早亡。
骨质疏松症可通过膳食、运动进行预防，利用药物进行治疗。但是化学药 物治疗过程中会产生药物副作用和经济负担，因而通过食品预防和治疗骨质疏 松是一种不错的选择。
泥鳅是一种具有功能性的药食同源水产品，中医理论认为泥鳅具有暖脾 胃、祛湿、利尿、止虚汗、补中益气的功效。现代研究表明泥鳅具有一定抗氧 化应激作用，理论上可以缓解氧化造成的骨病，申请人的研究也证明了泥鳅肉 具有强化骨质的作用。但泥鳅表皮含有较多的黑色素，使得加工形成的产品呈 深褐色泥浆状，影响产品外观和消费者食欲。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较 佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或 省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略 不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
本发明的其中一个目的是提供一种泥鳅酶解去皮方法，去除泥鳅表皮黑色 素的同时保留营养物质。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种泥鳅酶解去皮方 法，包括，
对泥鳅去粘液处理；
将泥鳅进行酶解处理；
过滤并回收酶解液；
其中，所述进行酶解处理，采用蛋白酶进行酶解，料液比1:4，加酶量10～100 u/g，pH为6～7，酶解温度25～70℃，酶解时间10～120min。
作为本发明泥鳅酶解去皮方法的一种优选方案，其中：所述蛋白酶包括木 瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种。
作为本发明泥鳅酶解去皮方法的一种优选方案，其中：所述回收酶解液， 将过滤后的酶解液煮沸灭酶，离心和/或过滤除去黑色素与杂质。
作为本发明泥鳅酶解去皮方法的一种优选方案，其中：所述对泥鳅去粘液 处理，水中加0.2％Na2CO3，溶解均匀，加入屠宰的新鲜泥鳅浸泡10～30min， 弃去污水。
本发明的另一个目的是提供一种裹涂泥鳅食品的制备方法，包括，
采用如上述所述的泥鳅酶解去皮方法得到的泥鳅以及回收的酶解液；
将泥鳅蒸制、绞碎，得到泥鳅肉碎；
将泥鳅肉碎与水按照2～5:5的质量比混合，经粗粉碎、细粉碎后，获得可 接受粒度半成品；其中，所述水为泥鳅酶解去皮方法得到的回收酶解液，不 足部分由水补齐；
将可接受粒度半成品与配料混合，油炸定型；
经裹粉、速冻后得到裹涂泥鳅食品。
作为本发明裹涂泥鳅食品的制备方法的一种优选方案，其中：所述配料包 括紫苏水、香料水和料酒；紫苏水的加入比例为10～18％，香料水加入比例为 4～6％，料酒加入比例为4～8％；
其中，所述紫苏水为干紫苏与水按1:40比例熬制而成；所述香料水为以香 叶、八角、桂皮、花椒、水按重量比1:4:4:4:100制备，温火煮沸20min。
作为本发明裹涂泥鳅食品的制备方法的一种优选方案，其中：所述油炸定 型，油炸时间为10～20s，油炸温度为160～190℃。
作为本发明裹涂泥鳅食品的制备方法的一种优选方案，其中：所述裹粉、 速冻，将油炸后泥鳅半成品裹面浆，而后裹欧式面包糠，后经过-35℃速冻。
本发明的另一个目的是提供如上述所述的制备方法得到的裹涂泥鳅食品 作为缓解骨质疏松的功能食品的应用。
本发明的另一个目的是提供如上述所述的制备方法得到的裹涂泥鳅食品 在制备抗氧化功能食品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明去除泥鳅表皮黑色素的同时保留营养物质，在利用泥鳅整鱼制备肉 骨鱼肉糜，并以肉糜制备不同形式的裹涂食品，可供给骨质疏松者食用，使之 比药品更易接受。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需 要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的 一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下， 还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例1中酶解时间的单因素试验结果；
图2为本发明实施例2中酶解温度的单因素试验结果；
图3为本发明实施例3中加酶量的单因素试验结果；
图4为本发明实施例4中正交实验各因素感官评分分析图；
图5为本发明实施例5中正交实验各因素原料保留率分析图；
图6为本发明实施例6中浓缩酶解液的抗氧化能力试验结果；
图7为本发明实施例7中酶解液蛋白粉相对分子量分布图；
图8为本发明实施例9中裹涂泥鳅食品对实验小鼠血清电解质含量的影响 图；
图9为本发明实施例9中小鼠股骨组织切片HE染色图；
图10为本发明实施例10中裹涂泥鳅食品对小鼠肝脏HSP70的影响图；
图11为本发明实施例10中裹涂泥鳅食品对小鼠肝脏TNF-α的影响图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书 实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明 还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不 违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例 的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少 一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施 例互相排斥的实施例。
如无特别说明，实施例中所采用的原料均为商业购买。
实施例1
(1)去粘液处理：水中加0.2％Na2CO3，溶解均匀，加入屠宰的新鲜泥鳅 浸泡20min，弃去污水；
(2)酶解去黑色素：将处理后的泥鳅进行蛋白酶水解，泥鳅酶解后，不 锈钢丝网滤出泥鳅并收集酶解液。
本实施例使用木瓜蛋白酶对泥鳅进行蛋白酶水解，在pH为6～7，固定料 液比1:4的条件下，对影响酶解的酶解时间进行单因素实验。固定酶解温度为 55℃、加酶量(酶与酶解底物的用量比)为40u/g，分别将泥鳅进行酶解10min、 20min、30min、40min、50min和60min后做感官评分鉴定及计算原料保留率 以确定最佳酶解时间范围。
原料保留率％＝酶解后样品质量(g)/酶解前样品质量(g)×100％。样品 水解前后称量时应将表面水分用滤纸吸干。
感官评价选用20位(10男、10女)受过专门培训的感官评价人员组成评 分组，采用百分制打分，感官评分标准如表1所示。
表1
试验结果如图1所示。由图1可以看出，随着酶解时间的增加，样品的感 官评分逐渐升高，在酶解为50min样品感官得分达到最高，证明去黑色素效果 最佳，但酶解40min与60min和50min评分相差不大；原料保留率随着酶解 时间的增加呈阶梯状递减趋势，40min与50min时原料保留率相差不大，综合 考虑两项指标，在保证一定原料保留率的基础上选取较高的感官评分，因此选 用40min作为最佳酶解时间。
实施例2
(1)去粘液处理：水中加0.2％Na2CO3，溶解均匀，加入屠宰的新鲜泥鳅 浸泡20min，弃去污水；
(2)酶解去黑色素：将处理后的泥鳅进行蛋白酶水解，泥鳅酶解后，不 锈钢丝网滤出泥鳅并收集酶解液。
本实施例使用木瓜蛋白酶对泥鳅进行蛋白酶水解，在pH为6～7，固定料 液比1:4的条件下，对影响酶解的酶解温度进行单因素实验。固定酶解时间为 40min、加酶量为40u/g，分别将泥鳅置于温度为40℃、45℃、50℃、55℃、 60℃和65℃的酶解温度下进行单因素实验，以实施例1中的感官得分和原料保 留率为指标确定最佳酶解温度范围。
试验结果如图2所示。由图2可以看出，在酶解温度为40℃和45℃时， 感官评分很低，原料保留率很高，说明此温度下样品基本未发生水解，50℃时 评分明显升高，原料保留率下降，样品开始水解，55℃评分达到最高，60℃和 65℃时评分均与之相差不大，但原料保留率却逐渐下降，因此，最终选取55℃ 作为最佳酶解温度。
实施例3
(1)去粘液处理：水中加0.2％Na2CO3，溶解均匀，加入屠宰的新鲜泥鳅 浸泡20min，弃去污水；
(2)酶解去黑色素：将处理后的泥鳅进行蛋白酶水解，泥鳅酶解后，不 锈钢丝网滤出泥鳅并收集酶解液。
本实施例使用木瓜蛋白酶对泥鳅进行蛋白酶水解，在pH为6～7，固定料 液比1:4的条件下，对影响酶解的加酶量进行单因素实验。固定酶解温度为55℃、酶解时间为40min，分别在加酶量为10u/g、20u/g、30u/g、40u/g、 50u/g和60u/g的条件下进行酶解实验，同样以实施例1中的感官评分和原料 保留率为指标确定最佳酶解加酶量的范围。
试验结果如图3所示。由图3可以看出，在加酶量为10u/g和20u/g时水 解程度很低，30u/g时水解程度升高，40u/g时达到最高评分，后趋于平缓，原料保留率也在40u/g后趋于平缓。综合两项指标，选取40u/g为最佳加酶量。
实施例4
通过实施例1～3的单因素实验得到各个酶解因素的范围：酶解时间35～45 min，酶解温度50～60℃和加酶量35～45u/g。对三个因素进行正交实验，以感 官评分为判断指标，正交实验感官评分结果如表2所示。
表2
为了方便分析，以表中的酶解时间、酶解温度及加酶量三个因素为横坐标， 各因素不同水平对应的感官评分为纵坐标作图，如图4所示。
如表2与图4所示，通过对实验结果进行分析，发现酶解温度对样品感官 得分的影响最大，加酶量次之，酶解时间与加酶量差距不大。感官评分随酶解 时间的增加有一定的升高趋势，但三个水平之间差距很小；酶解温度在55℃时 有了明显上升趋势，而在55℃和60℃相差不大；随加酶量的增多，感官评分 呈现上升趋势，但40u/g和45u/g两者感官评分相差很小。在此实验中，当酶 解温度为50℃时并未达到木瓜蛋白酶的最适温度，因此水解程度相对较低，而 一旦达到其最适水解温度，其水解能力便有了较大的提高。
实施例5
通过实施例1～3的单因素实验得到各个酶解因素的范围：酶解时间35～45 min，酶解温度50～60℃和加酶量35～45u/g。对三个因素进行正交实验，以原 料保留率为判断指标，正交实验原料保留率结果如表3所示。
表3
以表中的酶解时间、酶解温度及加酶量三个因素为横坐标，各因素不同水 平对应的原料保留率为纵坐标作图，如图5所示。
如表3和图5所示，通过对正交实验原料保留率结果的分析，酶解温度对 原料保留率影响最大，其次为加酶量，酶解时间与加酶量相差不大，排在最后。 随着水解程度的提高，原料保留率下降，两者呈一定负相关。从酶解时间上看， 35min和40min结果相差很小，但在45min后，原料保留率会有一定水平的 降低，结合该因素三个水平的感官评分，认为其在40min时具有相对较高的感 官评分和原料保留率。从酶解温度来看，原料保留率随温度的升高下降趋势较 快，结合感官评分，选择55℃为最佳酶解温度。加酶量的增加也导致了原料保 留率的逐级降低，结合感官评分，选择40u/g位最适加酶量。
因此，通过单因素与正交实验，结合感官评分与原料保留率两项指标，最 终确定最佳的泥鳅酶解去皮工艺为：在55℃的温度下，加入40u/g的木瓜蛋 白酶进行40min水解。在此期间，大部分皮都溶解于酶解液中，形成胶原肽溶 液。煮沸灭酶，离心除去和色素与杂质，浓缩至原体积1/5左右，冻干成粉。
实施例6
(1)去粘液处理：水中加0.2％Na2CO3，溶解均匀，加入屠宰的新鲜泥鳅 浸泡20min，弃去污水；
(2)酶解去黑色素：将处理后的泥鳅进行蛋白酶水解，在pH为6～7，料 液比1:4，55℃的温度下，加入40u/g的木瓜蛋白酶进行40min水解；不锈钢 丝网滤出泥鳅备用，酶解液于5000r/min下离心30min，除去残渣与黑色素。
酶解液的抗氧化性研究：酶解液清除·OH能力的测定。本实验采用利用 Fenton反应的羟自由基测试盒测定，操作按照说明书。超氧阴离子自由基O2.- 清除能力，操作按照说明书。
酶解液的抗氧化能力测试结果如图6所示，可以看出，酶解液具有一定抗 氧化活力。将其添加回泥鳅产品，可增加泥鳅产品的生理功能。
实施例7
(1)去粘液处理：水中加0.2％Na2CO3，溶解均匀，加入屠宰的新鲜泥鳅 浸泡20min，弃去污水；
(2)酶解去黑色素：将处理后的泥鳅进行蛋白酶水解，在pH为6～7，料 液比1:4，55℃的温度下，加入40u/g的木瓜蛋白酶进行40min水解；不锈钢 丝网滤出泥鳅备用，酶解液于5000r/min下离心30min，除去残渣与黑色素；
(3)将酶解液真空浓缩至体积为原来的1/5，后将酶解液预冻后用冻干机 冻干，获得酶解液蛋白粉。
酶解液蛋白粉氨基酸组成分析：酶解液冻干，之后称量100mg冻干蛋白 粉加入8mL的6mol/L HCl于样品管，充3min氮气后密封，置于恒温箱120℃ 下精确水解22h取出，冷却后将其全转移至容量瓶中，加入4.8mL 10mol/L NaOH中和，用蒸馏水定容25mL，双层滤纸过滤取1mL离心(10,000rpm， 10min)，吸取400uL上样于氨基酸自动分析仪。
酶解液蛋白粉氨基酸组成如表4所示，通过对比发现，酶解液中的蛋白氨 基酸组成接近猪皮胶原蛋白。
表4
酶解液蛋白粉相对分子量分析：采用Waters 600高效液相色谱仪(其配 置2487紫外检测仪以及Empower工作站GPC分析软件)测定酶解液蛋白粉 的相对分子量分布，色谱柱为TSK gel 2,000SWXL 300mm×7.8nm。使用蒸馏 水配成1％胶原蛋白粉溶液，吸取2m L用流动相乙腈/水/三氟乙酸 (45/55/0.1)定容至10mL，用微孔过滤膜对其进行过滤，最后进样，柱温设定为30℃，流速设定为0.5mL/min，波长220nm下检测。
酶解液蛋白粉相对分子量分布如图7所示。酶解液蛋白的分子量分析发现， 其主要分子量分布在1000Da以下，属于小肽，可能具有一些如抗氧化等生物 活性。
酶解液蛋白粉的理化卫生指标分析：酶解液蛋白粉中水分的测定采用国标 GB5009.3-2016方法；酶解液蛋白粉中灰分的测定采用国标GB 5009.4-2016方 法；酶解液蛋白粉中蛋白质的测定采用国标GB 5009.5-2016方法；酶解液蛋白 粉中脂肪的测定采用国标GB 5009.6-2016方法；酶解液蛋白粉中总砷及无机砷 测定采用国标GB 5009.11-2014方法；酶解液蛋白粉中铅的测定采用国标GB 5009.12-2016方法；酶解液蛋白粉中总汞和无机汞的测定采用国标GB 5009.17-2014方法。
理化卫生指标测试结果如表5所示。结果表明，酶解液中蛋白经过浓缩和 干燥后，都符合国家标准的要求。
表5
实施例8
一种裹涂泥鳅食品的制备步骤：
(1)去粘液处理：水中加0.2％Na2CO3，溶解均匀，加入屠宰的新鲜泥鳅 浸泡20min，弃去污水。
(2)酶解去黑色素：将处理后的泥鳅进行蛋白酶水解，在pH为6～7，料 液比1:4，55℃的温度下，加入40u/g的木瓜蛋白酶进行40min水解，不锈钢 丝网滤出泥鳅备用；酶解液于5000r/min下离心30min，除去残渣与黑色素， 回收酶解液。
(3)去头、去内脏、清洗：待泥鳅冷却后人工去头去内脏，之后流水冲 洗；工人需要戴手套。
(4)蒸制：预处理后的泥鳅置于蒸汽蒸煮隧道内，100℃蒸制5min，中 心温度保持在90℃以上至少3min。
(5)绞碎：蒸制后泥鳅入绞肉机，经过3mm隔板绞碎。
(6)调配、磨制：按泥鳅与水质量比例为4:5的比例加水，这里的水包括 步骤(2)中去掉黑色素的酶解液，不足部分用水补齐；经粗粉碎一次，细粉 碎三次后，获得可接受粒度半成品。
(7)配料：向步骤(6)得到的可接受粒度半成品中加入配料，配料为紫 苏水、香料水和料酒；其中，紫苏水为干紫苏与水按1:40比例熬制而成；香料 水为以香叶、八角、桂皮、花椒、水按重量比1:4:4:4:100制备，温火煮沸20min； 紫苏水的加入比例为15％，香料水加入5％，料酒加入6％；另外加入适量食盐， 胡椒粉等调味；另外加入变性淀粉8％，大豆分离蛋白15％；得到糜装泥鳅肉。
(8)成型：上述调味完成的糜装泥鳅肉由定量设备挤出在钢丝网带上， 经过油炸机预定型，油炸时间为15s，温度为175℃。
(9)裹粉：预油炸后饼状泥鳅半成品在上浆剂裹面浆，而后裹欧式面包 糠。
(10)速冻：裹涂面包糠后产品，经过-35℃速冻，得到裹涂泥鳅食品。
采用上述方案后制成的裹涂泥鳅食品，经过油炸或者微波炉加热熟成之后 可以食用。
实施例9
将实施例8得到的裹涂泥鳅食品进行缓解骨质疏松实验。具体试验条件及 方法如下：
1.实验动物
本实验中所有实验动物均为雄性ICR小鼠，9～11周龄，体重约37±2g。
2.实验方法
2.1动物饲养及分组
实验小鼠于温度条件为22-25℃，12h昼夜循环光照条件下暂养一周。实 验开始前将小鼠随机分为四组(空白对照组、模型组、低剂量灌胃组、高剂量 灌胃组)。除空白组小鼠外其余三组均每日颈背部皮下注射5％D-半乳糖溶液， 按小鼠体重注射剂量为500mg/kg，空白组注射相同剂量的生理盐水。将裹涂产品剥去裹涂层只留成型后的肉泥，低剂量组每日灌胃100mg/kg，高剂量组 每日灌胃500mg/kg。为方便灌胃操作，将全泥鳅肉泥冷冻干燥后按剂量要求 比例添加生理盐水并充分混合使用。
2.2采样
动物实验进行42d后将所有小鼠禁食不禁水，在一个相对封闭空间内用棉 花沾取乙醚对小鼠进行深度麻醉后眼球取血，血液放入无菌的离心管中于4℃ 静置过夜待血清析出。静置后的血液在3000r/min，离心15min，取上清液置 于-80℃保存，用于血清抗氧化指标及生化指标检测，测血磷、血钙。
取小鼠完整右侧股骨，将肌肉粘膜剔除干净后用生理盐水清洗浸泡4h， 于滤纸吸干后备用。
2.3股骨性能的测定
股骨长度及骨径：螺旋测微器测量股骨长度及骨径，股骨长度为股骨的近 侧端到远侧端距离，骨径是骨干中点处。
骨强度：利用质构仪的三点弯曲试验测定股骨中端最大承载量。
骨干重：骨强度测试后的股骨于105℃烘干至恒重后精确称量。
骨灰分：将股骨置于酸洗坩埚中，先在电炉上进行碳化，待不产生黑烟后 将其移入马弗炉中550℃灰化至恒重，精确称重。
股骨指数＝骨干重/骨长度
股骨钙含量：在灰分中加入浓盐酸煮沸10min消化，定容至100ml，以铬 黑T作为指示剂，采用EDTA滴定法测定股骨中钙含量。
2.4组织形态学切片的制作
取小鼠左侧股骨，于EDTA脱钙液中脱钙4周。四周后取脱钙后的样品进 行包埋，切成4μm厚切片，经过烘片、脱蜡、梯度酒精至水冲洗后H-E染色， 显微镜下镜检。
3.实验结果
3.1实验各组小鼠血清电解质含量
产品对实验小鼠血清电解质含量的影响如图8所示。
血清中磷的含量如图8(a)所示，空白组、模型组与低剂量组之间均无显 著差异性，高剂量组与空白组相比却显著降低。图8(b)中显示，血清中钙含 量随着灌胃剂量的增加呈现上升趋势，与空白组相比，低剂量组与高剂量组均呈现显著的增加，模型组与空白组无显著性差异。图8(c)中血清中镁含量的 变化四组之间均无显著差异性。本实验表明，裹涂泥鳅食品提高了小鼠血钙含 量，降低了血磷含量，对增强机体骨质有一定的作用。
3.2泥鳅产品对小鼠股骨性能的影响
为了探究裹涂泥鳅食品的食用对骨质是否有影响，需要对小鼠股骨性能进 行分析。裹涂泥鳅食品对小鼠股骨参数的影响如表6所示。
表6
如表6所示，在对各组小鼠股骨参数进行差异性比较以后发现，小鼠股骨 长度和骨径等较宏观指标四组小鼠差异并不显著。而在股骨灰分、干重、指数、 强度和钙含量等指标中，空白组、模型组和灌胃较低剂量的实验组各自差异也 不显著，但灌胃较高剂量的实验组与其他三组相比出现了差异性升高。本实验 中，灌胃较高剂量的实验组在各项指标中显示出，食用泥鳅产品在一定程度上可以增强股骨性能。可能由于灌胃时间较短或泥鳅产品作为一种食品保健品并 不能起到很强的增强骨性能的作用，所以在股骨长度和股骨径两项较为宏观指 标上没有显著的变化，在其他指标方面虽有一定显著性但对比之下增强骨性能 效果并非特别明显。
3.3泥鳅产品对实验小鼠股骨组织形态学的影响
骨小梁是骨内的一种结构，与骨的生成有关，骨小梁变细退化会导致骨质 疏松，因此，骨小梁是衡量骨质的一个重要指标。随着年龄的增长，骨小梁必 然会退化变细，使骨出现生理性退行性病变，发生原发性骨质疏松症。衰老模 型是一种对衰老的模拟过程，D-半乳糖的注射会在一定程度上对骨小梁产生影响，对于灌胃了裹涂泥鳅食品是否能在此方面有一定缓解作用，需要对小鼠股 骨的组织学切片中骨小梁进行观察。
小鼠股骨组织切片HE染色图如图9所示，其中，图9A为空白组小鼠股 骨组织结构；图9B为模型组小鼠股骨组织结构；图9C为低剂量组小鼠股骨组 织结构；图9D为高剂量组小鼠股骨组织结构。
由图9可以看出。四组小鼠股骨切片整体差异不大。显微镜下可见，空白 组小鼠骨小梁分布广泛，厚度较大，互相联结成网状，而模型组与空白组相比， 骨小梁部分明显稀疏，较细，联结中断点较多。随着裹涂泥鳅食品灌胃剂量的 增大，图中可以看出，低剂量组骨小梁分布开始增多，变厚，但仍有中断点，高剂量组已联结成网状结构。D-半乳糖的衰老模型在模型组股骨切片上已开始 出现衰老变化，灌胃实验组虽然不能使其恢复正常组水平，但在一定程度上缓 解了骨质疏松症状。
泥鳅产品具备一定抗氧化能力，可能通过蛋白肽以及泥鳅本身存在的抗氧 化多糖等物质提高产品的抗氧化活性，通过经典的Wnt/β-catenin途径抑制 Wnt10蛋白(Wnt10)、β-连锁蛋白(β-catenin)、成骨转录因子Runx2、Osterix的 mRNA的相对表达量，减弱成骨细胞骨代偿性增生；并经OPG/RANKL/NF- κB途径下调成骨细胞转录核因子κB受体活化因子配体/骨保护素(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand/Osteoprotegerin，RANKL/OPG)的比值， 降低肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumornecrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)、核因子κB(Nuclear factorκB，NF-κB)和核转录因子T 细胞活化因子(Nuclear factor of activated T-cell，NFATC1)的mRNA的相对表 达量，抑制破骨细胞骨骨吸收亢奋。
实施例10
将实施例8得到的裹涂泥鳅食品进行抗氧化应激性能实验。具体试验条件 及方法如下：
1.实验方法
1.1肝脏中RNA的提取与质量检测
依照实施例8中的动物实验方法进行实验。取出-80℃保存的肝脏50～100 mg，在研钵中倒入适量液氮，在液氮中充分研磨肝脏，进行肝脏研磨后进行后 续的组织匀浆、两相分离、RNA沉淀、RNA的清洗、RNA的溶解等相关步骤。
RNA的质量检测：使用变性琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收测定法来检测 RNA的浓度与纯度。
1.2逆转录反应
逆转录操作过程按照试剂盒操作说明进行( reagent Kit,TAKALA)。先进行除去基因组中DNA的反应后，按试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA。反应制得的cDNA置于冰上待用或将其保存于-20℃。
1.3定量PCR反应
检测小鼠HSP70和TNF-α表达量引物如表7所示，CYC、HSP70和TNF-α 的cDNA引物序列均来自于Genbank。
表7
进行Realtime PCR反应，首先将cDNA所有样品分别配制相关反应体系， 按具体要求加样后将载有样品的384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行反应， 具体的操作步骤及相关程序的设定参照苗春云文献。
3.试验结果
3.1裹涂泥鳅食品对小鼠肝脏HSP70的影响
试验结果如图10所示，模型组小鼠肝脏中HSP70的表达量与空白组相比 有了显著的升高，而灌胃裹涂泥鳅食品的实验组HSP70表达量均表现出显著低 于模型组的趋势且与空白组无显著差异性。说明D-半乳糖的注射作为一种外 源氧化刺激引起了HSP70表达量的增加，而灌胃了裹涂泥鳅食品的实验组 HSP70表达量降低到与空白组差异不显著，说明可能是泥鳅样品有一定的抗氧化功能，缓解了外源氧化刺激，没有激起机体HSP70的过多表达。
刘小转等研究了四氯化碳诱导的急性肝损伤小鼠肝脏HSP70、IL-6和TNF- α蛋白的表达变化，其中HSP70在肝损伤早期出现升高的趋势，有可能与其能 够提高机体应激能力有关，其表达量的增多用以维持细胞自身的稳定性，但在 肝严重损伤后，HSP70表达量降低。本实验中，模型组小鼠上述结果能够证明 出现了一定的肝脏损伤，但从切片看来，损伤并未达到严重的程度，因此， HSP70表达量升高，与研究结果一致。
3.2裹涂泥鳅食品对小鼠肝脏TNF-α的影响
试验结果如图11所示，与空白对照组相比，模型组小鼠TNF-α表达量显 著升高，低剂量和高剂量组比模型组均显著降低，且与模型组无显著差异性。 模型组TNF-α的显著升高证明D-半乳糖的注射导致了大量活性氧自由基的积 累，从而激发了TNF-α的过量表达，证明造模成功。而实验组的结果证明灌胃 的裹涂泥鳅食品消除了部分活性氧自由基，保持了机体氧化系统的平衡，从而 维持了TNF-α的稳定表达。马莹娟通过注射D-半乳糖造衰老模型，实验组给予柿叶黄酮灌胃，实验结束后检测了小鼠脑组织匀浆中TNF-α的表达量，发现 模型组小鼠表达量显著升高，而实验组小鼠TNF-α表达量较模型组显著降低， 从而证明了柿叶黄酮类化合物具有一定的抗氧化活性，这与本实验结果一致。
采用本发明方案制成的可缓解骨质疏松的裹涂泥鳅食品，经过油炸或者微 波炉加热熟成之后可以食用。以500mg/kg的剂量饲喂本产品6周后，骨质疏 松症小鼠的骨小梁数显著升高。本发明去除泥鳅表皮黑色素的同时保留营养物 质，在利用泥鳅整鱼制备肉骨鱼肉糜，并以肉糜制备不同形式的裹涂食品，可 供给骨质疏松者食用，使之比药品更易接受。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可 以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精 神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种裹涂泥鳅食品的制备方法，其特征在于：包括，
对泥鳅去粘液处理；
将泥鳅进行酶解处理；其中，所述进行酶解处理，采用木瓜蛋白酶进行酶解，料液比1:4，加酶量40 u/g，pH为6~7，酶解温度55℃，酶解时间40 min；
过滤并回收酶解液；
采用所述酶解处理得到的泥鳅以及回收的酶解液；
将泥鳅蒸制、绞碎，得到泥鳅肉碎；
将泥鳅肉碎与水按照2~5:5的质量比混合，经粗粉碎、细粉碎后，获得可接受粒度半成品；其中，所述水为泥鳅酶解去皮方法回收的酶解液，不足部分由水补齐；
将可接受粒度半成品与配料混合，油炸定型；
经裹粉、速冻后得到裹涂泥鳅食品。
2.如权利要求1所述的裹涂泥鳅食品的制备方法，其特征在于：所述回收酶解液，将过滤后的酶解液煮沸灭酶，离心和/或过滤除去黑色素与杂质。
3.如权利要求1所述的裹涂泥鳅食品的制备方法，其特征在于：所述对泥鳅去粘液处理，水中加0.2%Na2CO3，溶解均匀，加入屠宰的新鲜泥鳅浸泡10~30min，弃去污水。
4.如权利要求1所述的裹涂泥鳅食品的制备方法，其特征在于：所述配料包括紫苏水、香料水和料酒；紫苏水的加入比例为10~18%，香料水加入比例为4~6%，料酒加入比例为4~8%；
其中，所述紫苏水为干紫苏与水按1:40比例熬制而成；所述香料水为以香叶、八角、桂皮、花椒、水按重量比1:4:4:4:100制备，温火煮沸20 min。
5.如权利要求4所述的裹涂泥鳅食品的制备方法，其特征在于：所述油炸定型，油炸时间为10~20s，油炸温度为160~190℃。
6.如权利要求5所述的裹涂泥鳅食品的制备方法，其特征在于：所述裹粉、速冻，将油炸后泥鳅半成品裹面浆，而后裹欧式面包糠，后经过-35℃速冻。
7.如权利要求1~6中任一项所述的制备方法得到的裹涂泥鳅食品在制备缓解骨质疏松的功能食品中的应用。
8.如权利要求1~6中任一项所述的制备方法得到的裹涂泥鳅食品在制备抗氧化功能食品中的应用。
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