CN115073579A - 一种利用低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法，将羽毛加入低共熔溶剂中，加热搅拌溶解后，依次透析、过滤、冷冻干燥分离得到角蛋白，所述低共熔溶剂包括氢键供体和氢键受体，所述氢键供体为磷酸单用或与氯化锌复配，所述氢键受体为氯化胆碱或尿素；利用本发明所述低共熔溶剂降解羽毛，能够在短时间内达到较高的羽毛溶解率以及较高的角蛋白收率。
Description
技术领域
本发明涉及角蛋白制备技术领域，尤其涉及一种利用低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法。
背景技术
羽毛中含有大量的角蛋白，这类角蛋白具有广泛的应用。家禽业每年产生的大量废弃羽毛，这不仅导致角蛋白资源的巨大浪费而且造成环境污染。因此开发的羽毛降解工艺具有重要意义。和目前现有的羽毛降解工艺相比，低共熔溶剂(DES)被认为是环保且廉价的溶剂，可以用来降解富含蛋白质的羽毛。
全世界家禽业每年的废弃羽毛产量达数百万吨，这些羽毛除了少量作为保暖衣填料和动物饲料外，大部分被当作废弃物进行处理，造成资源浪费和环境污染。β-角蛋白占羽毛角蛋白含量91％左右，是一种非常有价值的蛋白质。这种蛋白质在食品、农业、纺织、复合材料、医疗保健和化妆品工业等领域都具有广泛的应用。因此开发从羽毛中提取角蛋白的绿色工艺具有很高的商业价值。
如图16所示，由于羽毛角蛋白二级结构中的α-螺旋(图a)和β-折叠(图b)紧密堆积及其分子间和分子内存在二硫键、氢键和范德华力，使羽毛角蛋白难以被降解。目前已有的降解羽毛的方法都存在许多明显的弊端：酸碱处理法提取的角蛋白收率较低，所使用的强酸强碱还会对环境造成很大的污染。氧化还原法所用的过氧化物，硫醇等有毒有害，难以处理。采用加温或加压的方法降解羽毛，反应条件苛刻，处理过程存在安全隐患。有一些论文报道了离子液体可以有效地降解羽毛角蛋白，然而离子液体十分昂贵，合成过程也过于复杂，不具有良好的经济效益。
低共熔溶剂作为一种新颖的环境友好型溶剂受到了很大关注。它是由一定化学计量比的氢键受体和氢键供体组合而成的两组分或三组分低共熔混合物，其组分间的强氢键相互作用使得凝固点显著低于各个组分纯物质的熔点。此外，DES还具有其他优点包括良好的生物相容性，环保，纯洁和低价格。
专利号为CN108467427 B的发明专利公开了一种利用胆碱盐和有机酸制备的低共熔溶剂溶解羊毛制备角蛋白的方法，包括以下步骤：将羊毛加入胆碱类低共熔溶剂中，在80-130℃下溶解0.5-3h，透析、过滤，滤液中含有所述角蛋白，所述胆碱盐和有机酸的摩尔比为1:1-2，所述方法虽然达到了对环境无毒无害的作用，但其溶解率较低。
发明内容
有鉴于此，为了能够在短时间内达到较高羽毛溶解率以及较高的角蛋白收率，本发明提供了一种利用低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法。
所述制备方法的具体过程为：将羽毛加入低共熔溶剂中，加热搅拌溶解后，依次透析、过滤、冷冻干燥分离得到角蛋白。
进一步的，所述低共熔溶剂包括氢键受体和氢键供体，所述氢键供体为磷酸[P]单用或与氯化锌[ZnCl2]复配，所述氢键受体为氯化胆碱[ChCl]或尿素[urea]。
本发明的实施例中介绍了不同组分以及不同配比的低共熔溶剂，当低共熔溶剂为二元时，磷酸与尿素、磷酸与氯化胆碱的比例均为3～5:1，优选5:1；所述低共熔溶剂为三元低共熔溶剂时，氯化胆碱、磷酸、氯化锌或尿素、磷酸、氯化锌的比例为1:5:1～1:5:3，优选1:5:2。
本发明技术团队在实验中意外发现通过将磷酸作为氢键供体，氯化胆碱或尿素作为氢键受体组成的低共熔溶剂应用在降解羽毛中，所需的降解时间只需要几分钟即可降解完成，实施例中分别对不同时间进行了平行实验，如5、10、15、20、25、30、40、55、75、100min，结果发现反应时间在5～25min内即可得到较高收率的角蛋白，这非常适合在工业上进行扩大化生产。
另外，本发明还分别在80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、145℃下考察了反应温度对于角蛋白收率的影响，并且通过大量的实验发现，相比于二元DES，同样在100℃条件下，三元DES用更短的时间达到了更高的角蛋白收率。这是因为氯离子的加入为反应体系提供了更多的用于氢键剪切的基团，从而在温度较低的反应环境中达到更高的羽毛溶解速率,提高角蛋白的收率。
进一步的，所述反应温度为100℃～150℃，优选110℃。
此外，考虑到DES用量是否对降解反应有影响，本发明实施例分别介绍了加入15g、20g、25g、30g、35g时，对于角蛋白收率的影响。
具体的，所述低共熔溶剂与羽毛的质量比为75～175:1，优选为125～150:1。
由于DES溶解过量的羽毛后，体系会变得非常黏稠不利于反应的进一步进行，最终降低角蛋白收率，因此，想到将羽毛加入低共熔溶剂之后还加入水进行稀释，观察对角蛋白收率的影响，具体的，所述水的体积和羽毛质量比为5:1～20:1，优选5:1～10:1。
进一步的，所述透析的过程为：MD77-1000的透析袋透析两天，所述冷冻干燥的时间为24-48h，冷冻干燥后获得再生角蛋白。
进一步的，本发明所述羽毛可选为鸽毛或家禽毛。
在本发明中，通过使用磷酸和尿素、氯化胆碱和磷酸合成的二元DES降解羽毛，以及氯化锌、磷酸与氯化胆碱或尿素组成的三元DES降解羽毛，讨论了不同温度和时间、不同比例的条件下对羽毛降解效果的影响，探究了一定质量下的DES对羽毛的降解率，并与氯化胆碱-尿素作为参考溶剂进行降解处理相比较。比较不同二元及三元DES的催化活性，从理论角度揭示所述DES具有良好的降解效果。
有益效果：
本发明所述二元或三元低共熔溶剂绿色环保且廉价，且利用所述低共熔溶剂降解羽毛具有较好降解效果，能够在短时间内达到较高羽毛溶解率以及较高的角蛋白收率。
附图说明
图1：[ChCl][P]的红外光谱图
图2：[urea][P]的红外光谱图
图3：不同配体及比例的二元DES对角蛋白收率的影响
图4：100℃下二元DES对角蛋白收率的影响折线图
图5：110℃下二元DES对角蛋白收率的影响折线图
图6：120℃下二元DES对角蛋白收率的影响折线图
图7：水用量对角蛋白收率的影响柱形图(二元DES)
图8：二元DES用量对角蛋白收率的影响
图9：不同配体及比例的三元DES对角蛋白收率的影响
图10：100℃下三元DES对角蛋白收率的影响折线图
图11：110℃下三元DES对角蛋白收率的影响折线图
图12：120℃下三元DES对角蛋白收率的影响折线图
图13：水用量对角蛋白收率的影响(三元DES)
图14：三元DES用量对角蛋白收率的影响
图15：三元DES的循环使用性能
图16：羽毛角蛋白二级结构示意图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明使用从养殖地收集(中国邢台)的废弃鸽毛，进行清洗消毒粉碎后得到的鸽毛用于降解试验。Urea(99％)在罗恩试剂(中国上海)购买，磷酸(85％)购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
实施例1
本实施例展示了二元、三元低共熔溶剂的制备过程及制备结果，当取不同摩尔比的氢键供体和氢键受体分别加到三颈烧瓶中，在并在80℃下搅拌约30min，当液体变得均匀透明时，便获得DES，实验结果见表1。
表2
图1、图2分别为DES-1、DES-2所述的氯化胆碱、磷酸与尿素、磷酸的红外谱图。可以看出，在3600～3000cm-1处两种DES均存在较宽的吸收峰，是氯化胆碱与磷酸、尿素与磷酸混融后形成的一系列分子间氢键作用的特征峰，其中3650～3580cm-1为游离-OH的伸缩峰，3400～3200cm-1为-OH氢键缔合的伸缩峰；1641cm-1处的吸收峰为DES吸附的水；1004～1120cm-1和491.8cm-1处的特征峰与磷酸P-OH的拉伸有关。上述特征峰的出现表明氯化胆碱与磷酸、尿素与磷酸之间均已形成氢键相互作用。
实施例2
图3展示了DES-1-DES-6在磷酸和氢键受体的比例为1:3～1:5时，对于提取羽毛中角蛋白的提取效果。
将羽毛洗涤干净，置于乙醇水溶液浸泡2h除去角质层，晾干后备用。分别取DES-1～DES-6各25g，各称取0.2g羽毛加入DES中，在100℃条件下反应30min，得到降解后的溶液。该溶液经过滤后，再通过1Kda透析袋中采用去离子水透析两天，然后进行了冷冻干燥，24-48h后获得再生角蛋白，六种DES的提取角蛋白的收率排序为DES-6>DES-3>DES-2>DES-5>DES-1>DES-4。DES-6与DES-3作为催化剂时角蛋白的收率最高，分别为72.7％、71.8％。进一步实验验证，当磷酸和氢键受体的比例为1:6时，当温度为100℃，时间为40min时，角蛋白收率为77.58％，上述实验进一步验证了磷酸和氢键受体的摩尔比为3～6:1，优选比例为5:1。
实施例3
本实施例考察并验证不同比例的低共熔溶剂在不同反应温度条件下对角蛋白收率的影响。
如图4、图5、图6所示，分别展示了在100℃、110℃、120℃下考察了反应温度对于角蛋白收率的影响。反应中羽毛的用量为0.2g，取DES-1～DES-6，用量为25g。由于反应前期体系内蛋白浓度变化较快，后期蛋白浓度变化放缓，因此间隔取样时间设置为5、10、15、20、25、30、40、55、75、100min。
由图4可知，不同比例的二元DES在参与反应时，100℃条件下，羽毛的溶解速率与角蛋白的收率具有明显差异。不同比例的低共熔溶剂体系下角蛋白的收率先升高再降低，最后趋于稳定，角蛋白可以获得的最大收率顺序为：DES-6>DES-3>DES-2>DES-5>DES-1>DES-4。
由图4、图5、图6可知，随着温度的升高，反应速率随之提高，所有DES达到最高收率的时间明显缩短。以DES-6为例，当反应温度为120℃时，需要10min即可达到最高收率；反应温度为110℃时，需要15min时取得最高收率82.02％；而在100℃时，则需要25min才可以达到最高收率80.9％；进一步拓展实验发现，在80℃时，则需要120min才可以达到最高收率63.75％；在90℃时，需要90min才可以达到最高收率68.81％；而当反应温度为130℃时，在5min即可取得角蛋白收率80.89％，当反应温度升高到145℃时，在2min的角蛋白收率为68.69％。
上述实验验证了在反应温度为100℃～150℃之间时，随着温度的升高，DES降解羽毛的角蛋白的收率逐渐增加，达到最高收率的反应速率也随之增加，由于在反应温度为100℃以下以及超过145℃时，角蛋白的最高收率不超过70％，故而反应温度优选为110℃～130℃；进一步的，反应时间为2～120min，优选5～25min。
实施例4
如图7所示，限定反应中羽毛的用量为0.2g，取DES-1～DES-6各25g，反应温度为110℃，反应时间为15min，本实施例展示水用量对于DES的物性比如粘度、密度具有显著的影响，这些影响会导致角蛋白收率发生变化。考察DES-6时分别加入1mL、2mL、3mL、4mL水，对于角蛋白收率的影响。
与不加水相比，当加入1mL水时，角蛋白收率略微升高为83.24％。少量的水对醋酸钠-尿DES溶解羽毛有积极的影响，水的加入会降低反应体系的粘度，从而促进了传质，促使羽毛在反应体系中溶解。然而随着水量的增多，角蛋白收率随即快速下降。原因为水分子会竞争DES负责溶解的氢键。因此太多的水是不利于羽毛溶解的，上述实验验证了水的体积加入量与羽毛质量之比为5:1～20:1，优选的，水的体积和羽毛质量比为5:1～10:1，最优选的，反应中水的加入量与羽毛质量比为5:1。
实施例5
本实施例验证了低共熔溶剂与羽毛的质量比为75～175:1，优选为125～150:1，在150:1时角蛋白的收率最高。
具体的说，如图8所示，限定反应中羽毛的用量为0.2g，水加入量为1mL，反应温度为110℃，反应时间为15min。图8展示了DES-6在分别加入15g、20g、25g、30g、35g时，对于角蛋白收率的影响。
当DES-6用量为15g时，角蛋白收率较低为55.02％，原因可能为催化剂用量过低导致提供的氢键剪切DES活性位点不足，催化效率降低，同时，DES溶解过量的羽毛后，体系会变得非常黏稠不利于反应的进一步进行，最终降低角蛋白收率。随着DES用量的增加，角蛋白的收率明显升高，当DES用量为30g时，角蛋白收率最高为84.16％。
实施例6-实施例9展示三元DES催化降解羽毛制备角蛋白的过程，实施例10展示了三元DES催化循环次数的实验过程。
实施例6
如图10所示，本实施例展示不同的催化剂及比例对于角蛋白的提取具有重要影响。验证了三元组分为[ChCl][P][ZnCl2]与[urea][P][ZnCl2]在1:5:1～1:5:3的比例下对于提取羽毛中角蛋白的催化效果。本实施例的反应中羽毛的用量为0.2g，取六种DES-7～DES-12，用量为25g，反应温度为100℃，反应时间为25min。并采用考马斯亮蓝法，使用紫外可见光分光光度计测量蛋白质浓度。
在相同的反应条件下，六种DES的提取角蛋白的收率排序为DES-8>DES-7>DES-10>DES-11>DES-12>DES-9。DES-8作为催化剂时角蛋白的收率最高，为82.84％。
实施例7
如图10、图11、图12所示，本实施例分别在100℃、110℃、120℃下考察了反应温度对于角蛋白收率的影响。反应中羽毛的用量为0.2g，DES的用量为25g。由于反应前期体系内蛋白浓度变化较快，后期蛋白浓度变化放缓，因此间隔取样时间设置为5、10、15、20、25、30、40、55、75、100min。
反应前20min，所有的DES反应体系中角蛋白含量逐步上升，25min时角蛋白收率出现拐点，之后体系中角蛋白含量持续下降。相比于二元DES，同样在100℃条件下，三元DES用更短的时间达到了更高的角蛋白收率。DES-9在反应20min时就达到了角蛋白收率最高点，但是之后由于酸性环境下二硫键及肽键大量断裂与水解，导致体系内的角蛋白含量迅速降低。DES-8在反应25min时收率是六种DES最高的，为82.84％。
在110℃下，羽毛的溶解速率进一步加快，DES-8与DES-9在10min时角蛋白的含量出现拐点，收率达到最高，分别为为85.46％与82.32％。其余DES在15min时也达到了收率最高点，六种DES的提取角蛋白的收率排序为DES-8>DES-11>DES-7>DES-9>DES-10>DES-12。
然而当温度继续升高到120℃时，各DES中角蛋白的含量在5min时就出现下降。于是增加测量了2.5min时的角蛋白含量，在2.5min时，反应体系中角蛋白浓度已经很高，5min时即达到最高点，随后角蛋白含量迅速降低。原因为，在高温下由于DES氢键剪刀的作用，羽毛迅速溶解，且二硫键及肽键也在酸性环境中快速断裂。此时反应的控制步骤由羽毛的溶解转变为二硫键及肽键断裂，因此高温不利于提高三元DES对角蛋白的收率。
实施例8
如图13所示，本实施例介绍了DES-8分别加入1mL、2mL、3mL、4mL水时，角蛋白收率的变化。反应中羽毛的用量为0.2g，DES的用量为25g，反应温度为110℃，反应时间为10min。
随着反应中水的加入，角蛋白的收率逐渐增加。水用量为2mL时角蛋白的收率达到最高87.24％。
实施例9
如图14所示，本实施例介绍了DES-8用量对于角蛋白收率的影响。反应中羽毛的用量为0.2g，DES的用量为25g，反应温度为110℃，水用量为2mL，反应时间为10min。
角蛋白的收率随着DES-8用量增加而升高。DES-8用量为15g时，角蛋白收率较低为63.12％，原因可能为催化剂用量过低导致提供的氢键剪切DES活性位点不足，催化效率降低。同时，DES溶解过量的羽毛后，体系会变得非常黏稠不利于反应的进一步进行，最终降低角蛋白收率。当DES用量为25g时，角蛋白收率最高为87.24％。
实施例10
如图15所示，本实施例展示DES-8在90℃条件下抽真空(真空度为0.09MPa)并蒸馏5h后得到回收后的DES催化剂，并将其置于真空干燥箱中干燥12h，随后将其在最佳反应条件下再次应用于提取角蛋白。
所述催化剂循环使用4次后仍可以保持较高的角蛋白收率。由此说明，本发明所述低共熔溶剂的催化性能较为稳定。
对比例1
乙酸钠和尿素及少量水组成的水性DES，在100℃，6h条件下降解了86％的羽毛，得到收率为45％的再生角蛋白。
与上述对比例对比之后可发现，本发明所述二元及三元低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法均可在短时间内得到较高溶解度以及较高收率的角蛋白。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法，将羽毛加入低共熔溶剂中，加热搅拌溶解后，依次透析、过滤、冷冻干燥分离得到角蛋白，其特征在于，所述低共熔溶剂包括氢键供体和氢键受体，所述氢键供体为磷酸单用或与氯化锌复配，所述氢键受体为氯化胆碱或尿素。
2.根据权利要求1所述的低共熔溶剂，其特征在于，所述氢键供体为磷酸单用时，磷酸和氢键受体的摩尔比为3～6:1，优选5:1。
3.根据权利要求1所述的低共熔溶剂，其特征在于，所述氢键供体为磷酸和氯化锌复配时，磷酸、氯化锌的复配摩尔比为5:1～5:3，优选5:2。
4.根据权利要求1所述的低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法，所述低共熔溶剂与羽毛的质量比为75～175:1，优选125～150:1。
5.根据权利要求1所述的降解羽毛制备角蛋白的方法，其特征在于，所述反应时间为2～120min，优选5～25min。
6.根据权利要求1所述的低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法，其特征在于，所述反应温度为100℃～150℃。
7.根据权利要求6所述的低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法，其特征在于，所述反应温度为110℃～130℃。
8.根据权利要求1-7所述的低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法，其特征在于，将羽毛加入低共熔溶剂之后还加入水，所述水的体积和羽毛质量比为5:1～20:1。
9.根据权利要求8所述的低共熔溶剂降解羽毛制备角蛋白的方法，其特征在于，所述水的体积和羽毛质量比为5:1～10:1。
10.根据权利要求1所述的低共熔溶剂，其特征在于，所述低共熔溶剂循环套用2-4次。
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