CN115052612A - 含有水解乳清蛋白作为活性成分的用于减轻、预防或治疗肌肉减少症的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有水解乳清蛋白作为一种活性成分的用于减轻、预防或治疗肌肉减少症的组合物，所述水解乳清蛋白通使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶过对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的外切蛋白酶进行二级水解而获得，使得蛋白质降解被抑制且蛋白质合成通过PI3K‑Akt通路被激活，因此减少了肌肉损失同时增加了肌肉大小和肌肉力量。

Description

含有水解乳清蛋白作为活性成分的用于减轻、预防或治疗肌 肉减少症的组合物
技术领域
本公开涉及一种用于减轻、预防或治疗肌肉减少症的组合物，所述组合物含有水解乳清蛋白作为活性成分，其通过减少肌肉损失来增加肌肉大小和肌肉力量。
背景技术
骨骼肌是构成人体最大部分的器官。他们占据了全部身体重量的40％至50％同时在包括能量平衡、热量生成等若干代谢功能中扮演着重要的角色。从40岁开始人类的肌肉以每年1％或大于1％的速度减少。在80岁时，肌肉的质量会减少到最大肌肉质量的约50％。认为老年时期的肌肉减少是降低全部身体机能的最重要因素。随着年龄的增加，人们会感受到肌肉和脂肪质量的变化，身体形态的变化例如骨骼变形等。在全球范围内由于肌肉损失而引起的老年肥胖患病率为30％或高于30％并且在逐渐增加。
由于胰岛素分泌紊乱会因细胞能量供应不足而导致肌肉发育障碍，糖尿病患者发生肌肉减少症的风险高于正常人。此外，由于肌肉减少会增加关节炎、背痛和慢性疼痛，这可能加重由于腹部肥胖和骨折引起的损伤而导致的尿失禁，以及由于晚年抑郁增加而导致死亡，老年肌肉减少症是与各种疾病相关的降低生活质量的主要因素。
众所周知，肌肉减少症与老年慢性疾病例如骨质疏松、胰岛素抵抗和关节炎密切相关。通过预防或减轻肌肉减少症能够缓解由于年龄增长引起的身体活动能力的衰退。2011年，治疗共济失调和虚弱症的全球市场达到了大约140亿美元并且自那以后年复合增长率达到了9.4％。预计在2017年会达到大约235亿美元。
由于成肌细胞干细胞即卫星细胞的募集、激活或增殖紊乱肌肉减少症患者显示出成肌细胞的减少，并且成肌细胞的增殖和分化减少。因此，肌肉减少症患者在组织学水平表现出肌肉纤维数量和大小的减小同时表现出肌肉功能的衰退。
随着美国和欧洲近10年来对肌肉减少症流行病学的积极研究，对肌少症临床重要性的关注日益高涨。尽管早期的研究主要报道肌肉减少症通过全身无力、活动障碍和肌肉力量缺乏而降低生活质量，但近期的研究显示，骨质疏松性骨折的风险可能显著地增加了。此外，由于肌肉减少症会引起例如糖尿病、代谢综合征、肥胖、慢性肾功能衰竭、慢性肝衰竭等慢性疾病，并最终导致死亡率增加，肌肉减少症作为一种需要被适当治疗的疾病正在受到关注。
最近，有报道称在美国，肌肉减少症患者身体残疾的风险增加了约1.5倍至3.5倍，造成每年185亿美元的社会成本。根据韩国国家健康营养调查结果显示，在韩国肌肉减少症是一种非常常见的疾病，60岁以上男性的患病率为42％，60岁以上女性患病率为42.7％。可以肯定的是这在韩国是一个非常重要的社会问题，因为这个国家有着世界上最快的人口增长速度。
虽然，普遍认为体育锻炼、蛋白质和能量补充对于肌肉减少症是有帮助的，但是它们对于占据了病人大多数的老年患者来说作用很小，治疗药物的研制迫在眉睫。然而，对于减轻肌肉减少症和增加肌肉质量有直接效果的药物还在临床阶段，目前还没有药物获得FDA审批。虽然存在选择性雄激素受体调节剂、激活素受体拮抗剂、快速骨骼肌肌钙蛋白抑制剂等作为治疗肌肉减少症的药物，但它们目前仍处于早期临床阶段。
根据一份关于肌肉减少症治疗药物趋势的报告，预计全球肌肉减少症治疗药物市场将从2010年的约1000万美元(US)增长到2018年的2000万美元(US)(“SarcopeniaTherapeutics-Pipeline Assessment and Market Forecasts to 2018”,2011.11.17)。此外，欧盟旗下的某个人保护合作机构-的创新药物计划在2013年宣布该研究所会为四大健康研究问题之一的老年肌肉减少症的治疗药物发展投资5000万欧元，这项投资计划目前还在进行。
因此，一种老年人可以长期安全服用的天然产品的用于肌肉减少症的治疗药物是需要的。
公开内容
技术问题
本公开旨在提供一种能通过减少肌肉损失来增加肌肉大小和肌肉力量的水解乳清蛋白。
本公开也旨在提供一种能改善肌肉功能的食物组合物，其含有水解乳清蛋白作为活性成分。
本公开也旨在提供一种用于预防或治疗肌肉减少症的药物组合物，其含有水解乳清蛋白作为活性成分。
本公开也旨在提供一种用于制备所述水解乳清蛋白的方法。
技术方案
本公开的水解乳清蛋白可以通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的外切蛋白酶进行二级水解来获得。
水解乳清蛋白可以衍生自奶酪乳清。
水解乳清蛋白可以是常见的乳清粉、脱盐乳清粉、乳清浓缩蛋白或者乳清分离蛋白。
水解乳清蛋白可以是除去不溶性物质的水溶性水解乳清蛋白。
地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶可以是碱性蛋白酶、Protamax或其混合酶，米曲霉衍生的外切蛋白酶可以是风味蛋白酶。
混合酶可以是重量比为1：0.5至1：2的碱性蛋白酶和Protamax的混合物。
水解乳清蛋白可以由以下氨基酸组成：9mg/g至11mg/g的Cys、19mg/g至22mg/g的Tyr、18mg/g至19mg/g的Arg、37mg/g至39mg/g的Ala、43mg/g至45mg/g的Pro、68mg/g至72mg/g的Lys、13.5mg/g至14mg/g的His、40mg/g至41mg/g的Ile、77mg/g至80mg/g的Leu、15mg/g至17mg/g的Met、24mg/g至25mg/g的Phe、36mg/g至37mg/g的Val、120mg/g至130mg/g的Glu、80mg/g至82mg/g的Asp、35mg/g至41mg/g的Ser、14.5mg/g至15mg/g的Gly、54mg/g至55mg/g的Thr和10mg/g至11mg/g的Trp。
水解乳清蛋白包含基于总氨基酸的1重量％至5的游离氨基酸。
水解乳清蛋白包含155mg/g至180mg/g的BCAA氨基酸。
水解乳清蛋白的指示肽的含量可以是10mg/g至40mg/g。
本公开的用来改善肌肉功能的食物组合物可以含有水解乳清蛋白作为活性成分，所述水解乳清蛋白通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的外切蛋白酶进行二级水解而获得。
本公开的的用于减轻或预防肌肉减少症的食物组合物含有水解乳清蛋白作为活性成分，所述水解乳清蛋白通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的外切蛋白酶进行二级水解而获得。
肌肉减少症可以是肌肉萎缩、肌无力、肌营养不良、肌强直、肌张力低下、肌肉无力、肌萎缩侧索硬化或重症肌无力。
此外，本公开中的用于减轻或预防肌肉减少症的药物组合物可以含有水解乳清蛋白作为活性成分，所述水解乳清蛋白通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的外切蛋白酶进行二级水解而获得。
组合物可以增加肌肉大小。
肌肉减少症可以是肌肉萎缩、肌无力、肌营养不良、肌强直、肌张力低下、肌肉无力、肌萎缩侧索硬化或重症肌无力。
制备本公开的水溶性水解乳清蛋白的方法可以包括：(A)通过将乳清蛋白与水按照重量比1：3至1：10的比例混合来溶解乳清蛋白的步骤；(B)通过将0.1重量份至1重量份的地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶加入到100重量份的溶解的乳清蛋白中来进行一级水解的步骤；(C)通过将0.1重量份至1重量份的米曲霉衍生的的外切蛋白酶加入到一级水解产物中来进行二级水解的步骤；和(D)通过过滤二级水解产物除去不溶性物质来获得水溶性水解乳清蛋白的步骤。
所述方法在步骤(D)之后还包括(E)对获得的水溶性水解乳清蛋白进行灭菌然后在室温冷却的步骤；和(F)对灭菌和冷却的水溶性水解乳清蛋白进行干燥和过滤的步骤。
地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶可以是碱性蛋白酶、Protamax或其混合酶。
米曲霉衍生的外切蛋白酶可以是风味蛋白酶。
有益效果
本公开的水解乳清蛋白和含有所述水解乳清蛋白作为活性成分的组合物能引起肌肉肥大和改善肌肉功能。此外，因为它们与对照组相比增加了肌肉损失相关基因的表达，本公开可以通过减少肌肉损失来增加肌肉大小和肌肉力量。
特别的，本公开显著地增加肌肉大小和肌肉力量，因为它们以与正常组相似的水平表达肌肉合成相关基因。
附图说明
图1示出了提供给正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组的蛋白质含量。
图2示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中握力随时间的变化。
图3a示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠四头肌重量的测量结果。图3b示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠腓肠肌重量的测量结果。图3c示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠比目鱼肌重量的测量结果。
图4示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠肌肉纤维横断面染色图像。
图5a示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠肌肉纤维横断面染色图像的归一化结果。图5b示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠肌肉纤维横截面积在小鼠肌肉中的分布。
图6a为正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠肌肉降解相关因子的表达的蛋白质印迹结果。图6b-6g分别示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠p-Foxo3a、Atrogin-1蛋白、MuRF-1蛋白、Atrogin-1 mRNA、MuRF-1 mRNA和Bnip3 mRNA因子的表达水平。
图7a为正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组、比较例2施用组中小鼠肌肉合成相关因子的表达的蛋白质印迹结果。图7b至7e示出了肌肉合成相关因子的磷酸化比例。
图8示出了根据本发明实施例1制备的水解产物分子重量的测量结果。
图9a-9d示出了实施例1和比较例3-5的水解乳清蛋白的细胞毒性。
图10示出了对照组(未处理)、地塞米松处理组、实施例1施用组和比较例3至5施用组中使用显微镜对肌管粗细进行测量的结果。
图11示出了对照组(未处理)、地塞米松处理组、实施例1施用组和比较例3至5施用组中使用显微镜对肌管粗细进行测量的结果。
图12示出了对照组(未处理)、地塞米松处理组、实施例1施用组和比较例3至5施用组中使用显微镜对肌管粗细进行测量的结果。
图13示出了对照组(未处理)、地塞米松处理组、实施例1施用组和比较例3至5施用组中使用显微镜对肌管粗细进行测量的结果。
具体实施方式
本公开涉及一种用于减轻、预防或治疗肌肉减少症的组合物，所述组合物含有水解乳清蛋白作为活性成分以用于通过减少肌肉损失来增加肌肉大小和肌肉力量。
本公开的乳清蛋白衍生自奶酪乳清，所述奶酪乳清是在通过分离凝乳从乳蛋白制备奶酪的过程中制备的。
所述水解乳清蛋白可以是常见的乳清粉、脱盐乳清粉、乳清浓缩蛋白或者乳清分离蛋白。
在下文中，详细描述本公开。
本公开的水解乳清蛋白可以通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的的外切蛋白酶进行二级水解来获得。
本公开的水解乳清蛋白具体地可以是通过过滤除去不溶性物质的水溶性乳清蛋白水解物，尽管它没有特别的限制，只要它是通过使用蛋白酶降解乳清蛋白获得的即可。
特别的，用于对乳清蛋白进行一级水解的地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶可以是最佳蛋白降解PH为7.0至8.5的碱性蛋白酶、最佳蛋白降解PH为5.0至11.0且最适温度为60℃的Protamax、或最佳蛋白降解PH为8.0至12.0其最适温度为40℃至50℃的Foodpro碱性蛋白酶。此外，用于进行二级水解的米曲霉衍生的的外切蛋白酶可以是最佳蛋白降解PH为5.0至7.0且最佳温度为50℃的的风味蛋白酶或Prozyme 2000P。当使用其他蛋白酶时，减轻、预防或治疗肌肉减少症的效果可能很低或根本不存在。
经过蛋白酶水解的水解乳清蛋白由以下氨基酸组成：9mg/g至11mg/g的Cys、19mg/g至22mg/g的Tyr、18mg/g至19mg/g的Arg、37mg/g至39mg/g的Ala、43mg/g至45mg/g的Pro、68mg/g至72mg/g的Lys、13.5mg/g至14mg/g的His、40mg/g至41mg/g的Ile、77mg/g至80mg/g的Leu、15mg/g至17mg/g的Met、24mg/g至25mg/g的Phe、36mg/g至37mg/g的Val、120mg/g至130mg/g的Glu、80mg/g至82mg/g的Asp、35mg/g至41mg/g的Ser、14.5mg/g至15mg/g的Gly、54mg/g至55mg/g的Thr和10mg/g至11mg/g的Trp。
此外，本公开的水解乳清蛋白包含基于总氨基酸的1重量％至5重量％，特别地2重量％至3重量％的游离氨基酸；同时包含155mg/g至180mg/g，特别地155mg/g至170mg/g的BCAA氨基酸，所述BCAA氨基酸指亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)。
当基于总氨基酸的游离氨基酸和BCAA氨基酸的含量满足上述范围时，可取得减轻、预防或治疗肌肉减少症的优异的效果。
此外，本公开的水解乳清蛋白的分子量为100Da至5000Da，特别为200Da至3500Da。
此外，本公开的水解乳清蛋白的指示肽的含量为10mg/g至40mg/g，特别地10mg/g至20mg/g。
由于本公开的水解乳清蛋白对于减轻、预防或治疗肌肉减少症有优异的效果，因此其可以用作用于改善肌肉功能的食物组合物或用作用于减轻或预防肌肉减少症的食物组合物，还可以用作用于预防或治疗肌肉减少症的药物组合物。
在本说明书中，术语“肌肉减少症”指的是肌肉质量和肌肉力量逐渐下降的一种疾病。所述肌肉减少症可以包括肌肉萎缩、肌无力、肌营养不良、肌强直、肌张力低下、肌肉无力、肌萎缩侧索硬化或重症肌无力。
此外，在本说明书中，术语“肌肉功能的改善”指的是增加肌肉力量和/或大小的效果。
此外，本公开提供了一种用于制备水溶性水解乳清蛋白的方法。
用于制备本公开的水溶性水解乳清蛋白的方法包括：(A)通过将乳清蛋白与水按照重量比1：3至1：10的比例混合来溶解乳清蛋白的步骤；(B):通过将0.1重量份至1重量份的地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶加入到100重量份的溶解的乳清蛋白中来进行一级水解的步骤；(C)通过将0.1重量份至1重量份的米曲霉衍生的外切蛋白酶加入到一级水解产物中来进行二级水解的步骤；和(D)通过过滤二级水解产物除去不溶性物质来获得水溶性水解乳清蛋白的步骤。
所述方法在步骤(D)之后还包括(E)对获得的水溶性水解乳清蛋白进行灭菌然后在室温冷却的步骤；和(F)对灭菌和冷却的水溶性水解乳清蛋白进行干燥和过滤的步骤。
首先，在步骤(A)中，在pH 7.0至7.5、40℃至60℃，特别地50℃至55℃的条件下，将乳清蛋白与水按照重量比1：3至1：10的比例混合来溶解乳清蛋白。
如果在乳清蛋白溶解的过程中温度和PH超出上述范围，乳清蛋白可能不会溶解。
随后，在步骤(B)中，通过将地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶加入到溶解的乳清蛋白中来进行一级水解。
地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶的可以是两种不同的地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶的混合物，更特别地是碱性蛋白酶和Protamax的混合酶。
碱性蛋白酶和Protamax按照重量比1：0.5至1：2，特别地1：1至1：1.5的比例进行混合。如果Protamax相对于碱性蛋白酶的含量超出上述范围，则减轻、预防或治疗肌肉减少症的效果可能会下降。
如果使用碱性蛋白酶和Protamax的混合酶，乳清蛋白会从链的内部降解。因此，乳清蛋白会被稀疏地降解成中等大小的肽段，特别是在末端暴露的疏水多肽，由于其强烈的苦味导致感官偏好下降。因此，在下一步使用第二种蛋白酶进行二级水解去改善这个问题。
此外，基于100重量份的溶解的乳清蛋白，碱性蛋白酶和Protamax的混合酶用量为0.1重量份至1重量份，特别地0.1重量份至0.4重量份。当混合酶的含量低于下限时，可能不会产生大量的短肽。如果其含量超过上限，减轻、预防或治疗肌肉减少症的效果可能会因产生大量中等长度的肽链而下降。
此外，一级水解在40℃至60℃，特别地45℃至55℃下进行2小时至5小时，特别地3小时至4小时。如果在一级水解的过程中反应温度和时间低于下限，一级水解可能不会完全进行。如果反应温度和时间超过上限，可能会产生大量副产物。
一级水解产物的PH为6.0至7.0。
随后，在步骤(C)中，通过将米曲霉衍生的外切蛋白酶加入到一级水解产物中进行二级水解。
由于在步骤(B)中使用混合酶会恶化感官偏好，因此在步骤(C)中使用米曲霉衍生的外切蛋白酶来产生短肽，从而提高感觉偏好。
分离自米曲霉的外切蛋白酶可以是风味蛋白酶。
基于100重量份的溶解的乳清蛋白，米曲霉衍生的外切蛋白酶用量为0.1重量份至1重量份，特别地0.2重量份至0.5重量份。当第二种蛋白酶的含量低于下限时，短肽的产量可能会减小。如果其含量超过上限，可能会产生大量副产物。
二级水解在40℃至60℃，特别地45℃至50℃下进行10小时至20小时，特别地13小时至17小时。如果在二级水解的过程中反应温度和时间低于下限，二级水解可能不会完全进行。如果反应温度和时间超过上限，可能会产生大量副产物。
随后，在步骤(D)中，通过过滤二级水解产物除去不溶性物质获得水溶性水解乳清蛋白。在步骤(D)之前，所述二级水解产物在80℃至100℃下处理5分钟至15分钟使酶失活然后冷却至室温(23℃至26℃)。在步骤(D)中使用冷却的二级水解产物。
在本公开中，通过过滤二级水解产物来获得除去不溶性物质的水溶性水解乳清蛋白从而取得更好的减轻、预防和治疗肌肉减少症的效果。
未除去不溶性物质的水解产物的效果是除去不溶性物质的水解产物的1/3至1/20。
具体地，过滤可以使用壳过滤器进行，尽管可以没有限制地使用任何能够去除不溶性物质的方法。
随后，在步骤(E)中，将获得的水溶性水解乳清蛋白在80℃至100℃下灭菌20至60分钟，然后冷却至室温。
随后，在步骤(F)中，干燥和过滤冷却和灭菌的水溶性水解乳清蛋白。
在通过喷雾干燥和除去磁性物质来对水溶性水解乳清蛋白进行干燥后，经30目至40目过滤器过滤，最终得到水溶性水解乳清蛋白。
与此同时，在本说明书中，术语“含有作为活性成分”指的是足以实现水解乳清蛋白效果的量。例如，水解乳清蛋白的使用浓度为10μg/mL至1500μg/mL，特别地为50μg/mL至1000μg/mL。由于水解乳清蛋白在人体内不会引起副作用，本公开的组合物含有的水解乳清蛋白的数量上限可以被本领域的技术人员适当地选择。
除活性成分外本公开的药物组合物可以使用药物上合适以及生理上可接受的佐剂来制备。赋形剂、崩解剂、甜味剂、黏合剂、被膜剂、膨胀剂、润滑剂、助流剂、调味剂等可以作为佐剂使用。
对于施用，除上面描述的活性成分外，可以使用一种或多于一种药物上可接受的载体来配制药物组合物。
药物组合物可以配制成颗粒剂、散剂、片剂、包衣片剂、胶囊剂、栓剂、液体、糖浆剂、汁剂、混悬剂、乳剂、药用滴剂、注射溶液等。例如，为了配制成片剂或胶囊剂，活性成分可以与口服的无毒的药物上可接受的惰性载体例如乙醇、甘油、水等结合使用。此外，如果需要或者有必要，也可以包括合适的黏合剂、润滑剂、崩解剂或着色剂。合适的黏合剂包括天然糖例如淀粉、明胶、葡萄糖或β-乳糖，天然胶或合成胶例如玉米甜味剂、金合欢、黄芪胶或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等，但是不限于此。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等，但是不限于此。
当所述组合物被配制成液体溶液时，灭菌和生物相容的盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油和乙醇中的一种或多于一种可以被用作药物上可接受的载体。如果有必要，也可以加入其它常见的添加剂例如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。此外，可以通过进一步加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、黏合剂或润滑剂来配制可注射剂例如水溶液、混悬剂、乳剂等、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。
根据特定的疾病或成分，可以使用Remington's Pharmaceutical Science,MackPublishing Company,Easton PA所描述的方法来制备制剂。
本公开说明中所述的药物组合物可以口服或肠外施用。对于肠外施用，它可以通过静脉注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、经皮等施用。特别地，它可以是口服施用。
本公开的药物组合物的合适施用剂量受制剂方法、施用方式、患者年龄、体重、性别、病理状况和饮食、施用时间、施用途径、排泄率和反应敏感性因素的影响，技能熟练的医生可以容易地确定和开具对所需要的治疗或预防有效的施用剂量。根据本公开具体的实例性实施方案，本公开的药物组合物的每日施用剂量为0.001g/kg至10g/kg。
本公开的药物组合物可以使用药学上可接受的载体和/或赋形剂制备成单剂量或多剂量单位。它可制作成油性或含水介质的溶液、混悬剂、乳剂、提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，并且还可含有分散剂或稳定剂。
此外，本公开提供了一种用于减轻、预防和治疗肌肉减少症的食物组合物，所述食物组合物含有水解乳清蛋白作为活性成分。
本公开的食物组合物可以通过使用与药物组合物相同的方法来配制，并且也可以被用作一种功能性食物或加入到不同的食物中。本公开的组合物可加入的食物包括，例如，饮料、酒精饮料、甜食、减肥棒、乳制品、肉、巧克力、披萨、拉面、其它面条、口香糖、冰淇淋、维生素复合物、膳食补充剂等。
除作为活性成分的水解乳清蛋白外，本公开的食物组合物可含有通常在食物制备过程中加入的成分，例如，蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、香料、调味剂。碳水化合物的实例包括常见的糖类例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖、寡糖等；多糖，例如糊精、环糊精等，以及糖醇例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。天然调味剂(奇异果甜蛋白或甜菊糖苷提取物(例如，莱包迪甙A、甘草甜素等))或合成甜味剂(糖精、阿斯巴甜等)可作为调味剂使用。例如，除本公开的水解乳清蛋白外，当本公开的食物组合物被制备成饮料或饮料时它还可以含有柠檬酸，果糖浆、糖、葡萄糖、乙酸、苹果酸、果汁、植物提取物等。
本公开提供了一种用于减轻、预防或治疗肌肉减少症的功能性健康食物，其包括含有水解乳清蛋白作为其活性成分的食物组合物。功能性健康食物指的是通过将水解乳清蛋白加入到食物材料中，例如饮料、茶、香料、口香糖、甜食等中制备的食物或能被制备成可以提供特定的健康功能的胶囊剂、散剂、混悬剂等的食物。与一般药物不同的是，它的优点在于长期使用药物时不会产生副作用。本公开的功能性健康食物是非常有用的因为它可以正常地摄取。功能性健康食物中水解乳清蛋白的添加量可以在不影响食物固有口感的范围内根据功能性健康食物的类型而改变。通常，食物中水解乳清蛋白的含量为0.01重量％至50重量％，特别地为0.1重量％至20重量％。当功能性健康食物的形式为丸剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂时，水解乳清蛋白的添加量通常为0.1重量％至100重量％，特别地为0.5重量％至80重量％。在具体的实施方案中，本公开功能性健康食物可以是丸剂、片剂、胶囊剂或饮料。
此外，本公开提供了一种用于制备用于减轻、预防或治疗肌肉减少症的药物或食物的水解乳清蛋白的用途。如上所述，水解乳清蛋白可用于减轻、预防或治疗肌肉减少症。
此外，本公开提供了一种用于减轻、预防或治疗肌肉减少症的方法，包括将有效用量的水解乳清蛋白施用至哺乳动物。
本文所使用的术语“哺乳动物”指的是治疗、观察或实验的对象，具体地指的是人类。
本文所使用的术语“有效用量”指的是经过研究人员、兽医、医学博士评估，足以在组织、动物或人体中引起生物学或医学反应的活性成分或药物组合物的用量，并且包括足以减轻相关疾病或病症的症状的量。本公开活性成分的有效量和施用量根据需要的效果而変化。相应地，最优施用剂量可以被那些在本领域技术人员容易地确定并根据不同的因素而调整，所述因素包括疾病类型、疾病严重性、活性成分和组合物中含有的其它成分的含量、制剂的类型、患者的年龄、体重、一般的健康情况、性别和饮食、施用时间、施用途径、组合物的排泄率、治疗时间和联合施用药物。特别地，本公开的用于预防、治疗或减轻肌肉减少症的方法中的水解乳清蛋白的施用剂量为0.001g/kg/天至10g/kg/天。
在本公的治疗方法中，含有水解乳清蛋白作为活性成分的组合物可以通过常见的方法施用，例如通过口服、直肠、静脉、动脉、腹膜内、肌内、胸骨内、经皮、局部、眼内或皮内途径。
实施例
在下文中，将会提供具体的实施例来帮助理解本公开。然而，以下的实施例只解释了本公开，并且对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在本公开内容的范围和技术思想内对其进行各种改变和修改，并且这些改变和修改包含在所附权利要求的范围内。
水溶性水解乳清蛋白和水解乳清蛋白的比较
实施例1.水溶性水解乳清蛋白(WP-S)
将乳清蛋白(WPC)和水于50℃下按照重量比1：5的比例混合溶解并使用碳酸氢钠调至pH为7.0至7.5，随后，将0.4重量份的混合酶(碱性蛋白酶2.4L FG(Novo Nordisk)：Protamax(Novo Nordisk)＝1：1重量比)加入到100重量份的溶解乳清蛋白中，然后在50℃下进行一级水解4个小时。在一级水解结束时，pH为6.0至7.0。
将0.2重量份的风味酶1000L(Novo Nordisk)加入到一级水解产物中并在50℃下进行二级水解15小时，随后，通过使用壳过滤器(1μm)对二级水解产物进行过滤来获得水溶性水解乳清蛋白。
在90℃下对获得的水溶性水解乳清蛋白灭菌30min然后冷却至室温，随后进行喷雾干燥(入口温度：190℃，出口温度：100℃；水蒸发率：1kg/小时至3kg/小时)并使用10000高斯的磁铁除去杂质，通过使用40目筛网过滤来获得粉末形式的水溶性水解乳清蛋白。
实施例2.水解乳清蛋白(WP-H)
除了不通过壳过滤器对二级水解产物进行过滤外，以与实施例1相同的方式获得水不溶性水解乳清蛋白。
比较例1.水溶性酸性水解乳清蛋白(AW-S)
除了使用酸性乳清蛋白代替乳清蛋白外，以与实施例1相同的方式获得水溶性酸性乳清蛋白水解产物。
酸性乳清蛋白(酸乳清)指的是基于通过pH控制的等电点而不是基于质量差而分离的乳清蛋白。
比较例2.酸性水解乳清蛋白(AW-H)
除了不通过壳过滤器对二级水解产物进行过滤外，以与实施例1相同的方式获得水不溶性水解乳清蛋白。
<测试实施例I>
实验动物
在通过后肢固定(IM)小鼠引起肌肉萎缩的肌肉萎缩动物模型中研究了实施例和比较例中制备的水解产物是否能恢复肌肉萎缩。
在进行IM一星期后，将实施例和比较例中制备的四种水解产物施用至小鼠连续2周，同时保持后肢固定。四十二只5周大的雄性C57BL/6小鼠在对实验室环境熟悉一周后被用于实验。测试组为未处理的正常组(正常)、对照组(引起肌肉萎缩组，IM)和四种水解产物施用组(AW-H、AW-S、WP-H和WP-S)，并且每组由七只老鼠组成。使用清水溶解样品，随后以800mg/kg/天的剂量施用。根据文献(Disease Models&Mechanisms,8(9),1059-1069,2015)描述的方法通过使用由1.5mL微管、曲别针和搭扣带制备的装置将小鼠的一条后腿夹紧来对后肢进行固定。在整个实验过程中，每隔3天测量小鼠的饮食和水摄入量以及体重。
-6个测试组-
正常组(正常)：没有引起肌肉萎缩。
对照组(IM)：在引起肌肉萎缩之后施用水而不是水解产物。
实施例1(WP-S)：在引起肌肉萎缩之后按照800mg/kg/天施用水解产物(WP-S)。
实施例2(WP-H)：在引起肌肉萎缩之后按照800mg/kg/天施用水解产物(WP-H)。
比较例1(AW-S)：在引起肌肉萎缩之后按照800mg/kg/天施用水解产物(AW-S)。
比较例2(AW-H)：在引起肌肉萎缩之后按照800mg/kg/天施用水解产物(AW-H)。
测试实施例1.蛋白质含量的测量
图1示出了提供给正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组的蛋白质含量。
由于提供的水解产物是一种蛋白质，因此每日蛋白质摄入量是通过饮食摄入量和水解产物摄入量计算的。如图1显示的，在蛋白质摄入方面每组之间没有显著差异。
测试实施例2.握力变化的测量
图2示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中握力随时间的变化。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001.
在后腿固定和施用的过程中，使用握力计(Bioseb，法国)每3天对小鼠握力的变化进行测量。将老鼠的尾巴放在握力计的网格上，当老鼠的任何一只爪子脱离网格时，测量其最大握力(g)。每只老鼠测量5次然后记录平均值。针对体重对握力进行归一化。
如图2所示，正常组握力随时间与体重成比例增加。与正常组相比对照组握力显著降低。
此外，可以确定的是在口服施用水解产物后的第9天，实施例1施用组的握力与正常组相比显著增加。
特别的，在口服施用水解产物后的第12天，实施例1施用组的握力与其它组相比显著增加。
测试实施例3.肌肉组织重量变化的测量
图3a示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠股四头肌重量的测量结果；图3b示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠腓肠肌重量的测量结果；图3c示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠比目鱼肌的测量结果。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001.
所述小鼠被处死后测量其中一只后腿的股四头肌、腓肠肌和比目鱼肌的重量。测量数据针对体重进行归一化，然后进行比较。
如图3所示，由于肌肉萎缩，对照组中股四头肌、腓肠肌和比目鱼肌的重量与正常组相比分别减少了约20％、约23％和约37％。
可以确定的是在实施例1(WP-S)施用组中，股四头肌、腓肠肌和比目鱼肌的重量分别减少了约13％、约18％和约18％。也就是说，肌肉重量减少量分别减少了36％、20％和52％。
与此相反，在比较例2(AW-H)施用组中，股四头肌、腓肠肌和比目鱼肌的重量分别减少了约19％、约22％和约23％。也就是说，肌肉重量减少量显著减少了37％。在比较例1(AW-S)施用组中，股四头肌、腓肠肌和比目鱼肌的重量分别减少了约21％、约22％和约25％，在实施例2(WP-H)施用组中，股四头肌、腓肠肌和比目鱼肌的重量分别减少了约20％、约22％和约23％。
相应地，可以确定的是在四种水解产物中实施例1(WP-S)在降低肌肉重量减少上有最好的效果。
测试实施例4.降低肌肉纤维横截面积减少的效果
图4示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠肌肉纤维横截面染色图像；图5a示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠肌肉纤维横截面染色图像的归一化结果；图5b示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠肌肉纤维横截面积在小鼠肌肉中的分布。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
进行组织学分析来研究在肌肉萎缩的小鼠模型中水解产物是否能改善小鼠肌肉纤维横截面积减少。在使用4％多聚甲醛对从测试实施例3中获得的腓肠肌进行固定之后，沿垂直方向将肌肉组织切成4μm厚的石蜡切片，观察截面积。使用苏木素和伊红(H&E)对切片染色13小时，然后使用光学显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)在100倍放大倍数下观察。随后，使用ImageJ软件对肌肉纤维横截面积进行定量。
如图4和图5a-5b所示，由于肌肉萎缩，对照组中肌肉纤维横截面积与正常组相比减少了47％。
此外，与正常组相比，在比较例2(AW-H)施用组中肌肉纤维横截面积减少了37％，在比较例1(AW-S)施用组中肌肉纤维横截面积减少了47％，在实施例2(WP-H)施用组中肌肉纤维横截面积减少了47％，在实施例1(WP-S)施用组中肌肉纤维横截面积减少了34％。可以确定的是肌肉纤维横截面积的减少量只在实施例1(WP-S)施用组中显著降低了25％。
将肌肉纤维数量对肌肉纤维横截面积作图时，实施例1(WP-S)施用组与正常组的分布最接近。
测试实施例5.肌肉降解相关因子调控的研究
图6a为正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠肌肉降解相关因子的表达的蛋白质印迹结果；图6b-6g分别示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠p-Foxo3a、Atrogin-1蛋白、MuRF-1蛋白、Atrogin-1 mRNA、MuRF-1 mRNA和Bnip3 mRNA因子的表达水平。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
蛋白质印迹和qRT-PCR被用于研究在肌肉萎缩的小鼠模型中肌肉降解相关因子Foxo3a、MuRF-1、Atrogin-1和Bnip3的蛋白质和基因表达水平是否发生变化。Foxo3a是一种与肌肉萎缩相关的转录因子。已知其活性会受到抑制，因为在被磷酸化时定位于细胞质中。Atrogin-1和MurF1是仅在肌肉中特异行表达的泛素连接酶。它们被认为是在肌肉萎缩中最具代表性的降解肌蛋白的因子。Bnip3是一种与线粒体自噬和自噬相关的因子。已知在肌肉萎缩中其表达会增加。
使用含有CompleteTM蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂(Roche Diagnostics,Indianapolis,USA)的裂解缓冲液从测试实施例3中获取的腓肠肌中提取蛋白质。在根据制造商的说明书使用PierceTMBCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Rockford,USA)对提取蛋白的浓度进行测定之后，将蛋白浓度调整到一定水平。在12％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，通过电印迹法将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时，然后与一抗在4℃孵育过夜。次日，将膜与HRP(辣根过氧化物酶)偶联的二抗孵育1.5小时或大于1.5小时，然后使用LAS3000荧光图像分析仪(Fuji Film，Tokyo,Japan)进行分析。Foxo3a和p-Foxo3a抗体购买自Cell SignalingTechnology(Danvers,USA)；MuRF-1和Atrogin-1二抗购买自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,USA)；β-肌动蛋白抗体购买自GeneTex(California,USA)。
在使用easy-RED(iNtRON Biotechnology，Seongnam,Korea)对测试实施例3中获取的腓肠肌提取mRNA后，通过与20μL RevoScriptTM反转录酶预混试剂盒(iNtRONBiotechnology)反应合成cDNA。然后，使用含有10μL SYBR premix EX Taq(Takara,Japan)、2μL cDNA、1μL每种引物(10pmol/μL)、1μL Rox染料和6μL无RNA酶/DNA酶水的混合物在Step One Plus实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，CA,USA)上进行实验。所述引物购买自Bionics，序列见表1。
[表1]
Figure BDA0003662771630000161
如图6a-6g所示，正常组中p-Foxo3a和Foxo3a的磷酸化比例与对照组相比显著降低，该比例只有在实施例1(WP-S)中显著增加。
此外，对照组中Atrogin-1的蛋白质组和基因组的表达与正常组相比显著增加，施用水解产物显著减降低了其表达(WP-S>AW-H≥WP-H)。
此外，对照组中MurF1的蛋白质组和基因组的表达与正常组相比显著增加，但在实施例1(WP-S)施用组中显著减少。
此外，对照组中Bnip3的基因组表达与正常组相比显著增加，施用水解产物显著减降低了其表达(WP-S>AW-S)。
综上所述，将实施例1(WP-S)施用于肌肉萎缩的小鼠模型会通过减少由于肌肉萎缩所增加的肌肉降解相关因子蛋白质组和基因组的表达来解决肌肉萎缩。
测试实施例6.肌肉合成相关因子表达调控的研究
图7a示出了正常组、对照组、实施例1施用组、实施例2施用组、比较例1施用组和比较例2施用组中小鼠肌肉合成相关因子的表达的蛋白质印迹结果；图7b-7e示出了肌肉合成相关因子的磷酸化比例。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。
使用蛋白质印迹来研究在肌肉萎缩的小鼠模型中的肌肉合成相关因子PI3K、Akt、S6K1和4E-BP1的磷酸化比例是否发生变化。已知PI3K-Akt通路是一种由生长因子例如IGF-1激活并最终增加肌肉合成的信号通路。S6K1和4E-BP1受到PI3K磷酸化作用、Akt磷酸化作用、等影响从而被磷酸化，通过S6核糖体蛋白的磷酸化作用或真核翻译起始因子4E的释放诱导蛋白质合成。因此，通过使用蛋白质印迹测定四种因子的磷酸化比例来研究施用水解乳清蛋白是否会增加肌肉合成。
采用与测试例5相同的方法，对测试例3获取的腓肠肌进行蛋白质印迹检测。p-PI3K抗体购买自Abcam(England)；PI3K、p-Akt、Akt、p-S6K1、S6K1、p-4E-BP1和4E-BP1抗体购买自Cell Signaling Technology(Danvers,USA)；Gapdh抗体购买自GeneTex(California,USA)。
如图7所示，其它组中p-PI3K和PI3K的磷酸化比例与正常组相比显著减少。
此外，对照组中p-Akt和Akt的磷酸化比例与正常组相比显著减少，但是施用实施例1(WP-S)后会显著增加。
此外，对照组中p-S6K1和S6K1的磷酸化比例与正常组相比显著减少，但是施用水解产物(WP-S>AW-H)后会显著增加。
此外，对照组中p-4E-BP1和4E-BP1的磷酸化比例与正常组相比显著减少，但是施用水解产物后会显著增加(WP-S>WP-H>AW-S)。
综上所述，将实施例1(WP-S)施用于肌肉萎缩的小鼠模型会通过增加由于肌肉萎缩所减少的肌肉合成相关因子蛋白质组和基因组的表达来解决肌肉萎缩。
本公开的水解乳清蛋白和其它水解乳清蛋白的比较
实施例1.水溶性水解乳清蛋白(WP-S)
使用实施例1中的水溶性水解乳清蛋白。
比较例3.Arla水解乳清蛋白
使用Arla水解乳清蛋白(Arla Foods Ingredients，Arla SP-8011)。
比较例4.Hilmar水解乳清蛋白
使用Hilmar水解乳清蛋白(Hilmar Ingredients,Hilmar 8010)。
比较例5.Murray Goulburn水解乳清蛋白
使用Murray Goulburn水解乳清蛋白(韩国专利申请第No.1311318号的实施例2)。
<测试实施例II>
测试实施例7.氨基酸组成的测定
在使用酸水解的方法降解水解乳清蛋白后，使用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的组成。简要来说，精确地称量25mg水解乳清蛋白并加入到有盖子的管中，然后再加入2.5mL6N HCl后110℃水解24小时。在使用3G-4玻璃过滤器除去不溶性物质后，使用旋转真空蒸发仪((N-1110，EYELA，Tokyo，Japan)在50℃下使溶剂从滤液中完全蒸发。然后，使用0.01NHCl制备25mL用于氨基酸分析的样品。注射40μL样品溶液后使用氨基酸分析仪(Biochrom30，Cambridge，UK)进行氨基酸分析。
[表2]
氨基酸(mg/g) 实施例1 比较例3 比较例4 比较例5
Asp 81.56 82.22 84.31 83.11
Thr 54.29 56.87 55.79 58.46
Ser 39.78 42.94 41.63 43.27
Glu 129.96 137.17 132.99 132.43
Pro 43.75 46.84 43.95 45.79
Gly 14.57 14.00 14.44 13.92
Ala 38.81 43.09 39.87 39.33
Cys 10.08 11.8 12.35 17.00
Val 36.91 39.6 38.98 37.12
Met 15.08 14.3 15.46 14.15
Ile 40.57 41.97 44.68 41.08
Leu 77.84 83.21 80.72 76.32
Tyr 19.55 22.53 22.34 19.56
Phe 24.91 25.6 25.64 23.66
His 13.75 14.41 14.29 13.48
Lys 68.32 72.76 72.09 67.06
Arg 18.29 19.43 17.76 16.14
Trp 10.63 11.27 11.60 10.41
Ile+Leu+Val 155.32 164.78 148.72 154.52
测试实施例8.分子量的测定
图8示出了根据本公开在实施例1中制备的水解产物的分子量的测量结果。
在加入490μL双蒸水和500μL含有0.1％TFA的乙腈溶解0.01g实施例1中的水解产物后，使用MALDI-TOF质谱仪研究质量分布(4700 Proteomics analyzer，AppliedBiosystems，MA，USA)。
如图8所示，实施例1中水解产物的分子量为210Da至2800Da。除CHCA基质峰外，在324m/z、496m/z、611m/z、1375m/z、1700m/z和1880m/z观察到主要的肽峰。在1700m/z或低于1700m/z观察到许多肽峰。
测试实施例9.指示肽的含量的测量
指示肽的合成
通过AbClon(Seoul，Korea)来合成经氨基酸测序确认的指示肽Leu-Asp-Ile-Gln-Lys(LDIQK)。合成肽LDIQK的分子量和纯度分别为615.73Da和95.05％。
指示肽的定量
使用配备有Watchers 120 ODS-BP色谱柱(4.6x250mm，5μm)的Agilent1260infinity HPLC系统(Santa Clara，CA，USA)和Shimadzu HPLC prominence系统对指示肽进行定量。除分析仪器外分析条件相同。0.5g实施例1中的粉状样品不经任何预处理完全溶解于10mL HPLC级蒸馏水中，然后离心(7500x g，20分钟)。使用0.2μm注射器过滤器对上清液进行过滤然后用于分析。通过缩二脲试验对可溶蛋白的浓度进行测定。用于对指示肽进行定量的HPLC分析条件见表3，指示肽的浓度见表4。
[表3]
Figure BDA0003662771630000191
[表4]
实施例1 比较例3 比较例4 比较例5
LDIQK(mg/g) 23.46±2.47 0.1±0.01 0.3±0.01 0.6±0.01
如表4所示，根据本公在实施例1中制备的水溶性水解乳清蛋白与比较例3至5相比有明显更高的指示肽含量。
测试实施例10.细胞毒性的测定
图9a-9d示出了实施例1和比较例3至5中水解乳清蛋白的细胞毒性。
在接种C2C12小鼠成肌细胞后，当汇合度达到90％时，使用分化培养基(2％马血清)替换培养基，使胞分化7天。分化后，使用实施例1和比较例3-5中水解乳清蛋白以不同浓度(0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL)处理细胞，并在48小时后测定细胞毒性。
如图9a-9d所示，实施例1和比较例3至5中所述的水解乳清蛋白在高达500μg/mL时无细胞毒性。
测试实施例11.肌管粗细的测量(直径)
图10示出了对照组(未处理)、地塞米松处理组、实施例1施用组和比较例3-5施用组中使用显微镜对肌管粗细进行测量的结果。
图11示出了对照组(未处理)、地塞米松处理组、实施例1施用组和比较例3-5施用组中使用显微镜对肌管粗细进行测量的结果。
在接种C2C12小鼠成肌细胞后，当汇合度达到80％时，使用分化培养基(2％马血清)替换培养基，使细胞分化7天。为了研究对肌肉萎缩的抑制效果，从诱导分化的第七天开始，使用50μM地塞米松(Dexa；Sigma Aldrich，USA)和100μg/mL实施例1或比较例3至5中的水解乳清蛋白处理细胞2天(48小时)。培养后，使用光学显微镜(CKX41，Olympus)在400倍放大倍数下对细胞进行成像，然后使用ImageJ软件(USA)对图像进行分析。在10个随机位置对细胞进行成像并对至少10个肌管的粗细进行分析(6个重复/组)。
对照组(未处理)中的C2C12细胞未经处理，地塞米松处理组中的C2C12细胞经50μM地塞米松处理。
如图10所示，使用根据本公开的实施例1中制备的水溶性水解乳清蛋白处理的组与地塞米松处理组或使用比较例3至5中的水解乳清蛋白处理的组相比肌管更粗。
如图11所示，地塞米松处理组中的肌管的粗细与对照组(未处理)相比减少了30.4％，使用实施例1中水解乳清蛋白处理的组中的肌管粗细与地塞米松处理组(恢复率：48％)相比增加了21％。
与此相反，使用比较例3中水解乳清蛋白处理的组中的肌管粗细与地塞米松处理组(恢复率：28％)相比增加了12％，使用比较例4和比较例5中水解乳清蛋白处理的组中的肌管粗细与地塞米松处理组(恢复率：21％)相比增加了9％。相应地，可以确定的是与比较例3至5相比，实施例1中的水溶性水解乳清蛋白可以很明显地增加地塞米松处理减小后肌管的增粗效果。
测试实施例12.校正蛋白质含量后肌管粗细(直径)的测量
图12示出了对照组(未处理)、地塞米松处理组、实施例1施用组和比较例3-5施用组中使用显微镜对肌管粗细进行测量的结果。
图13示出了对照组(未处理)、地塞米松处理组、实施例1施用组和比较例3-5施用组中使用显微镜对肌管粗细进行测量的结果。
在接种C2C12小鼠成肌细胞后，当汇合度达到80％时，使用分化培养基(2％马血清)替换培养基，使细胞分化7天。为了研究对肌肉萎缩的抑制效果，从诱导分化的第七天开始，使用50μM地塞米松(Dexa；Sigma Aldrich，US)和80μg/mL实施例1或比较例3至5中的水解乳清蛋白处理细胞2天(48小时)。培养后，使用光学显微镜(CKX41，Olympus)在400倍放大倍数下对细胞进行成像，然后使用ImageJ软件(US)对图像进行分析。在10个随机位置对细胞进行成像并对至少10个肌管的粗细进行分析(6个重复/组)。
对照组(未处理)中的C2C12细胞未经处理，地塞米松处理组中的C2C12细胞经50μM地塞米松处理。
如图12所示，使用根据本公开的在实施例1中制备的水溶性水解乳清蛋白处理的组与地塞米松处理组或使用比较例3至5中水解乳清蛋白处理的组相比肌管更粗。
如图13所示，地塞米松处理组中的肌管的粗细与对照组(未处理)相比减少了32％，使用实施例1中水解乳清蛋白处理的组中的肌管粗细与地塞米松处理组(恢复率：74％)相比增加了35％。
与此相反，使用比较例3中水解乳清蛋白处理的组中的肌管粗细与地塞米松处理组(恢复率：33％)相比增加了16％，使用比较例4和比较例5中水解乳清蛋白处理的组中的肌管粗细与地塞米松处理组(恢复率：29％)相比增加了13％。相应地，可以确定的是与比较例3至5相比，实施例1中的水溶性水解乳清蛋白可以很明显地增加地塞米松处理减小后肌管的增粗效果。
在下文中，描述了含有本公开的水解乳清蛋白的组合物的制剂实施例。然而，所提供的实施例仅用来解释本公开并不会限制本公开。
制剂实施例1散剂的制备
实施例1中获得的水溶性水解乳清蛋白 500mg
乳糖 100mg
滑石粉 10mg
通过将上述成分混合并装入密封袋中制成粉剂。
制剂实施例2片剂的制备
Figure BDA0003662771630000221
在将上述成分混合后，根据通常的片剂制备方法制成片剂。
制剂实施例3胶囊剂的制备
实施例1中获得的水溶性水解乳清蛋白 200mg
结晶 3mg
乳糖 14.8mg
硬脂酸镁0.2mg
在将上述成分混合后，根据通常的胶囊剂制备方法通过将混合物装入明胶胶囊中以制成胶囊剂。
制剂实施例4注射剂的制备
Figure BDA0003662771630000222
根据通常的注射剂制备方法通过将上述成分混合并装入安瓿瓶中制成注射剂。
制剂实施例5液体制剂的制备
Figure BDA0003662771630000223
根据通常的液体制剂制备方法，在使用纯化水溶解上述成分并且加入适量的柠檬调味剂后，加入纯化水至总重量为100g。将所述制备的液体制剂装入棕色瓶子中，然后灭菌。
制剂实施例6颗粒剂的制备
Figure BDA0003662771630000224
Figure BDA0003662771630000231
虽然上述维生素和矿物混合物的组成是相对优选的实施例，但是它们可以根据需要被改变。根据通常的颗粒剂制备方法通过将上述成分混合制成颗粒剂，根据通常的方法将其制成功能性食物组合物。
制剂实施例7功能性饮料的制备
Figure BDA0003662771630000232
Figure BDA0003662771630000241
根据通常的功能性饮料制备方法，在将上述成分混合并加热到85℃同时搅拌一小时后，将制备的溶液进行过滤并装入灭菌的2L容器中。在密封和灭菌后，将溶液存放在冰箱中以用于随后制备本公开的功能性饮料组合物。
虽然上述组合物是相对优选的实施例，但是它可以根据地区和种族偏好例如顾客、国家、使用目的等需要改变。
工业应用
本公开的水解乳清蛋白和含有所述水解乳清蛋白作为活性成分的组合物可以用作用于减轻、预防或治疗肌肉减少症的组合物。

Claims (20)

1.一种水解乳清蛋白，其通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的的外切蛋白酶进行二级水解而获得。
2.根据权利要求1所述的水解乳清蛋白，其中所述乳清蛋白衍生自奶酪乳清。
3.根据权利要求1所述的水解乳清蛋白，其中所述乳清蛋白是常见的乳清粉、脱盐乳清粉、乳清浓缩蛋白或乳清分离蛋白。
4.根据权利要求1所述的水解乳清蛋白，其中所述水解乳清蛋白是除去不溶性物质的水溶性水解乳清蛋白。
5.根据权利要求1所述的水解乳清蛋白，其中所述地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶是碱性蛋白酶、Protamax或其混合酶；所述米曲霉衍生的外切蛋白酶是风味蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的水解乳清蛋白，其中所述混合酶是重量比为1：0.5至1：2的碱性蛋白酶和Protamax的混合物。
7.根据权利要求1所述的水解乳清蛋白，其中所述水解乳清蛋白由以下氨基酸组成：9mg/g至11mg/g的Cys、19mg/g至22mg/g的Tyr、18mg/g至19mg/g的Arg、37mg/g至39mg/g的Ala、43mg/g至45mg/g的Pro、68mg/g至72mg/g的Lys、13.5mg/g至14mg/g的His、40mg/g至41mg/g的Ile、77mg/g至80mg/g的Leu、15mg/g至17mg/g的Met、24mg/g至25mg/g的Phe、36mg/g至37mg/g的Val、120mg/g至130mg/g的Glu、80mg/g至82mg/g的Asp、35mg/g至41mg/g的Ser、14.5mg/g至15mg/g的Gly、54mg/g至55mg/g的Thr和10mg/g至11mg/g的Trp。
8.根据权利要求1所述的水解乳清蛋白，其中所述水解乳清蛋白包含基于总氨基酸的1重量％至5重量％的游离氨基酸。
9.根据权利要求1所述的水解乳清蛋白，其中所述水解乳清蛋白包含155mg/g至180mg/g的BCAA氨基酸。
10.根据权利要求1所述的水解乳清蛋白，其中所述水解乳清蛋白的指示肽的含量为10mg/g至40mg/g。
11.一种用于改善肌肉功能的食物组合物，其包含水解乳清蛋白作为活性成分，所述水解乳清蛋白通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的外切蛋白酶进行二级水解而获得。
12.一种用于减轻或预防肌肉减少症的食物组合物，其包含水解乳清蛋白作为活性成分，所述水解乳清蛋白通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的外切蛋白酶进行二级水解而获得。
13.根据权利要求12所述的食物组合物，其中所述肌肉减少症是肌肉萎缩、肌无力、肌营养不良、肌强直、肌张力低下、肌肉无力、肌萎缩侧索硬化或重症肌无力。
14.一种用于预防或治疗肌肉减少症的药物组合物，其包含水解乳清蛋白作为活性成分，所述水解乳清蛋白通过使用地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶对乳清蛋白进行一级水解并使用米曲霉衍生的外切蛋白酶进行二级水解而获得。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述组合物增加肌肉大小。
16.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述肌肉减少症是肌肉萎缩、肌无力、肌营养不良、肌强直、肌张力低下、肌肉无力、肌萎缩侧索硬化或重症肌无力。
17.一种用于制备水溶性水解乳清蛋白的方法，其包括：
(A)通过将乳清蛋白与水按照重量比1：3至1：10的比例混合来溶解乳清蛋白的步骤；
(B)通过将0.1重量份至1重量份的地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶加入到100重量份的溶解的乳清蛋白中来进行一级水解的步骤；
(C)通过将0.1重量份至1重量份的米曲霉衍生的外切蛋白酶加入到一级水解产物中来进行二级水解的步骤；和
(D)通过过滤二级水解产物除去不溶性物质来获得水溶性水解乳清蛋白的步骤。
18.根据权利要求17所述的用于制备水溶性水解乳清蛋白的方法，其在步骤(D)之后还包括，
(E)对获得的水溶性水解乳清蛋白进行灭菌然后在室温冷却的步骤；和
(F)对灭菌和冷却的水溶性水解乳清蛋白进行干燥和过滤的步骤。
19.根据权利要求17所述的用于制备水溶性水解乳清蛋白的方法，其中所述地衣芽孢杆菌衍生的内切蛋白酶是碱性蛋白酶、Protamax或其混合酶。
20.根据权利要求17所述的用于制备水溶性水解乳清蛋白的方法，其中所述米曲霉衍生的外切蛋白酶是风味蛋白酶。
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