CN115029317A - 用于过敏性鼻炎的鼻喷雾剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因修饰的间充质干细胞外泌体及其制备方法以及其在过敏性鼻炎治疗中的应用，主要通过分子生物学手段构建IL‑27表达的基因序列，构建哺乳动物细胞表达载体，进一步转染间充质干细胞，并获得基因修饰的间充质干细胞外泌体。本发明对过敏性鼻炎具有显著的治疗效果，具有较大的经济和社会效益，市场前景较好。

Description

用于过敏性鼻炎的鼻喷雾剂及制备方法
本申请是申请号为ZL202110204230.X、发明名称为“基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备及其应用”的发明专利的分案申请，在此将其全文引用于此。
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备及其应用，尤其涉及一种基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备及其在过敏性鼻炎治疗中的应用。
背景技术
过敏性鼻炎又称为变应性鼻炎，是由IgE介导通过释放组织胺、激肽类和白三烯等诱发的鼻黏膜I型变态反应性疾病。发病症状主要表现为鼻痒、鼻塞、喷嚏、流清涕、嗅觉障碍等，随着病程的进展，可伴有记忆力低下和咽炎等多种疾病，严重影响患者的工作及生活质量。该病为人类总常见的慢性病之一，近年来由于全球气候变化、环境污染、社会和心理压力等方面的影响，其发病率呈逐年升高趋势，被视为“21世纪”的流行病，全球约25％的人群深受其扰。
目前过敏性鼻炎的治疗主要包括三方面，避免接触过敏原、药物治疗和免疫治疗。对于已知的过敏原应尽量避免与之接触，但生活中不可避免接触花粉、尘螨和某些食物等过敏原。免疫治疗主要指过敏原特异性免疫治疗，但其治疗过程繁琐，治疗周期长(往往需3年左右)，见效慢，费用高，大多数患者难以坚持，而且治疗的安全性仍存在不确定性。药物治疗仍然是过敏性鼻炎的首选治疗方法，临床用药主要有糖皮质激素、抗组胺类药、减充血剂、抗胆碱药和肥大细胞膜稳定剂5类。治疗中，常以糖皮质激素和抗组胺类药为主，另外3类药为辅。抗组胺类药对鼻痒、喷嚏、流清涕有较好效果，但对鼻塞效果不明显；减充血剂能有效地缓解鼻粘膜充血，但对其它症状无效；抗胆碱药对缓解流清涕效果好，但对鼻塞、喷嚏症状无效，还有导致鼻腔干涩和出血的副作用；肥大细胞膜稳定剂具有较好的预防过敏性鼻炎的效果，对于已经产生的过敏介质不具有拮抗作用，对过敏性鼻炎的急性发作疗效不佳；糖皮质激素可从多个环节阻断鼻黏膜的过敏性炎症反应，能有效预防和治疗过敏性鼻炎的症状，为目前治疗过敏性鼻炎最有效的一线药物，但其起效缓慢，在用药数日或数周后起效，具有局部刺激的副作用，且糖皮质激素长期局部应用的副作用和远期疗效仍需循证医学的评价。
鉴于上述，本发明旨在提供一种基因修饰的间充质干细胞外泌体、制备方法及其应用，来解决上述的一个或多个技术问题。
发明内容
为了解决现有技术中的一个或多个技术问题，申请人研究发现，利用IL-27基因修饰间充质干细胞外泌体，对治疗过敏性鼻炎具有良好的效果，通过分泌表达IL-27因子，增强了间充质干细胞外泌体的免疫调节和抗过敏的功能，能够很好地修复鼻腔微环境，改善过敏性鼻炎的症状，克服现有过敏性鼻炎治疗药物所存在的副作用和治疗效果不佳问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
根据本发明一方面，提供了一种用于过敏性鼻炎的基因修饰的间充质干细胞外泌体，其特征在于通过以下步骤获得：
设计获得哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列，该哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列包含tPA信号肽编码序列、IL-27B链编码序列、linker序列和IL-27A链编码序列，如SEQ ID NO.1所示；
将所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列转入间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞；
培养该基因修饰的间充质干细胞获得所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
根据本发明又一方面，还提供了一种用于过敏性鼻炎的基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于以下步骤：
a.设计获得哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列，该哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列包含tPA信号肽编码序列、IL-27B链编码序列、linker序列和IL-27A链编码序列，如SEQ ID NO.1所示；
b.将所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列转入间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞；
c.培养该基因修饰的间充质干细胞获得所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
根据本发明又一方面，步骤a中，所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列通过人工合成，其中，IL-27B链和IL-27A链之间由GGGS GGGS GGGS组成的linker相连并依据人细胞偏爱的密码子对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行人工合成，进行合成时，在基因的上游引入tPA信号肽、Kozak序列和BamHI位点，在基因的下游引入终止密码子和EcoRI位点。
根据本发明又一方面，步骤b具体为：分别用BamHI和EcoRI双酶切人工合成的所述核酸序列及pHBAd腺病毒表达载体，构建pHBAd-IL27重组质粒，使用Lipofiter转染试剂将pHBAd-IL27重组质粒和pHBAd-BHG质粒转染包装病毒293A细胞，所述细胞病变并从底部脱落，获得含有所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列的成熟腺病毒；使用所述成熟腺病毒感染所述间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞。
根据本发明又一方面，步骤c具体为：培养该基因修饰的间充质干细胞，收集上清提取所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
根据本发明又一方面，还提供了前述的基因修饰的间充质干细胞外泌体在过敏性鼻炎治疗中的应用。
根据本发明又一方面，还提供了一种用于过敏性鼻炎的鼻喷雾剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
采用前述的制备方法制备基因修饰的间充质干细胞外泌体；
取去离子水，依次加入甘油、桉叶素、EDTA-Na2、苯扎氯铵以及所述基因修饰的间充质干细胞外泌体，边加边搅拌使其充分溶解，最后加入微晶纤维素-羧甲基纤维素钠，搅拌充分溶解后，使用HCl调节pH值为5.2-6.6，即得所述的鼻喷雾剂；
其中，每1000ml所述的鼻喷雾剂包含所述基因修饰的间充质干细胞外泌体5.0-15.0mg，桉叶素3.0-7.0g，甘油23.0-30.0g，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠12.0-18.0g，EDTA-Na2 0.5-1.0g，苯扎氯铵0.2g，溶剂为去离子水。
根据本发明又一方面，还提供了一种用于过敏性鼻炎的鼻喷雾剂，其特征在于每1000ml所述的鼻喷雾剂包含：
如权利要求1所述的基因修饰的间充质干细胞外泌体5.0-15.0mg；
桉叶素3.0-7.0g；
甘油23.0-30.0g；
微晶纤维素-羧甲基纤维素钠12.0-18.0g；
EDTA-Na2 0.5-1.0g；
苯扎氯铵0.2g；
余量为去离子水。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
1.本发明将IL-27基因修饰的间充质干细胞外泌体作为活性成分用于过敏性鼻炎的治疗，通过分泌表达IL-27因子，增强了间充质干细胞外泌体的免疫调节和抗过敏的功能，能够很好地修复鼻腔微环境，改善过敏性鼻炎的症状，达到治疗过敏性鼻炎的目的，治疗效果显著，且安全性好，没有激素产品的依赖性等副作用。
2.通过IL-27基因修饰后的间充质干细胞所获得的外泌体在形成外泌体的同时将有活性的IL-27蛋白一并装入外泌体中，赋予了间充质干细胞更强的免疫调节功能，从而增强了其所分泌的外泌体对过敏性鼻炎的治疗效果。
3.通过IL-27基因修饰后的间充质干细胞所获得的外泌体在形成外泌体的同时将有活性的IL-27蛋白一并装入外泌体中，提高了IL-27活性蛋白的稳定性。
4.通过IL-27基因修饰后的间充质干细胞所获得的外泌体在形成外泌体的同时将有活性的IL-27蛋白一并装入外泌体中，借助外泌体传递其所包含的核酸、蛋白质等生物信息，进而进一步提高了活性因子IL-27蛋白的生物利用率，这些因素综合作用可以获得更优的过敏性鼻炎治疗效果；
5.每1000ml鼻喷雾剂中，桉叶素(3.0-7.0g)与基因修饰的间充质干细胞外泌体(5.0-15.0mg)协同作用，进一步增强了过敏性鼻炎的治疗效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步具体的阐述，应理解，引用实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
根据本发明的一种优选实施方式，提供了一种基因修饰的间充质干细胞外泌体，其特征在于通过以下步骤获得：
设计获得哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列，该哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列包含tPA信号肽编码序列、IL-27B链编码序列、linker序列和IL-27A链编码序列，如SEQ ID NO.1所示；
将所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列转入间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞；
培养该基因修饰的间充质干细胞获得所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
有利地，本发明通过分子生物学手段构建IL-27表达的基因序列，构建哺乳动物细胞表达载体，进一步转染间充质干细胞，并获得基因修饰的间充质干细胞外泌体。
根据本发明又一优选实施方式，还提供了一种基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于以下步骤：
a.设计获得哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列，该哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列包含tPA信号肽编码序列、IL-27B链编码序列、linker序列和IL-27A链编码序列，如SEQ ID NO.1所示；
b.将所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列转入间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞；
c.培养该基因修饰的间充质干细胞获得所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
根据本发明又一优选实施方式，步骤a中，所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列通过人工合成，其中，IL-27B链和IL-27A链之间由GGGS GGGS GGGS组成的linker相连并依据人细胞偏爱的密码子对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行人工合成，进行合成时，在基因的上游引入tPA信号肽、Kozak序列和BamHI位点，在基因的下游引入终止密码子和EcoRI位点。
根据本发明又一优选实施方式，步骤b具体为：分别用BamHI和EcoRI双酶切人工合成的所述核酸序列及pHBAd腺病毒表达载体，构建pHBAd-IL27重组质粒，使用Lipofiter转染试剂将pHBAd-IL27重组质粒和pHBAd-BHG质粒转染包装病毒293A细胞，所述细胞病变并从底部脱落，获得含有所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列的成熟腺病毒；使用所述成熟腺病毒感染所述间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞。
根据本发明又一优选实施方式，步骤c具体为：培养该基因修饰的间充质干细胞，收集上清提取所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
根据本发明又一优选实施方式，还提供了前述的基因修饰的间充质干细胞外泌体在过敏性鼻炎治疗中的应用。
根据本发明又一优选实施方式，还提供了一种用于过敏性鼻炎的鼻喷雾剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
采用前述的制备方法制备基因修饰的间充质干细胞外泌体；
取去离子水，依次加入甘油、桉叶素、EDTA-Na2、苯扎氯铵以及所述基因修饰的间充质干细胞外泌体，边加边搅拌使其充分溶解，最后加入微晶纤维素-羧甲基纤维素钠，搅拌充分溶解后，使用HCl调节pH值为5.2-6.6，即得所述的鼻喷雾剂；
其中，每1000ml所述的鼻喷雾剂包含所述基因修饰的间充质干细胞外泌体5.0-15.0mg，桉叶素3.0-7.0g，甘油23.0-30.0g，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠12.0-18.0g，EDTA-Na2 0.5-1.0g，苯扎氯铵0.2g，溶剂为去离子水。
根据本发明又一优选实施方式，还提供了一种用于过敏性鼻炎的鼻喷雾剂，其特征在于每1000ml所述的鼻喷雾剂包含：
如权利要求1所述的基因修饰的间充质干细胞外泌体5.0-15.0mg；
桉叶素3.0-7.0g；
甘油23.0-30.0g；
微晶纤维素-羧甲基纤维素钠12.0-18.0g；
EDTA-Na2 0.5-1.0g；
苯扎氯铵0.2g；
余量为去离子水。
有利地，桉叶素为无色至淡黄色油状液体，是桉叶油的主要成分，有樟脑和清凉的草药气味，具有疏风解热、祛湿解毒和抗菌抗病毒的作用，其与基因修饰的间充质干细胞外泌体协同作用，进一步增强了过敏性鼻炎的治疗效果。
根据本发明又一优选实施方式，还提供了一种包含间充质干细胞外泌体过敏性鼻炎治疗喷剂，其pH值为5.2-6.6，每1000ml包含间充质干细胞外泌体5.0-15.0mg，桉叶素3.0-7.0g，甘油23.0-30.0g，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠12.0-18.0g，EDTA-Na2 0.5-1.0g，苯扎氯铵0.2g，溶剂为去离子水。
本发明的一个优选实施方案中，每1000ml包含间充质干细胞外泌体10.0mg，桉叶素5.0g，甘油26.0g，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠15.0g，EDTA-Na2 0.5g，苯扎氯铵0.2g，溶剂为去离子水。
优选的，所述基因修饰的间充质干细胞是转染IL-27基因并能分泌表达具有功能的IL-27的间充质干细胞。
优选的，所述的转染IL-27基因的载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等病毒载体或pcDNA3.1等非病毒载体。
进一步优选的，所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞和胎盘间充质干细胞。
根据本发明又一优选实施方式，还提供了一种间充质干细胞外泌体鼻喷剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用哺乳动物细胞表达载体，设计构建IL-27分泌表达载体；
(2)分离、培养、纯化和鉴定间充质干细胞；
(3)将IL-27分泌表达载体转入间充质干细胞，继续培养至少3天后，收集培养上清，提取获得干细胞外泌体沉淀。
优选地，所述制备方法还包括步骤(4)：按比例配方，将桉叶素、甘油、微晶纤维素-羧甲基纤维素钠、EDTA-Na2、苯扎氯铵、间充质干细胞外泌体加入去离子水中，调节pH值，而后0.45μm无菌滤膜过滤除菌，即得所述的包含间充质干细胞外泌体的过敏性鼻炎治疗喷剂。
优选地，所述构建IL-27分泌表达载体是通过分子生物学和基因工程的手段将IL-27蛋白的表达盒亚克隆到哺乳动物细胞表达载体上。
在本发明的一个优选实施方案中，所述的表达载体为腺病毒载体。
进一步优选的，所述步骤(1)为：人工合成可用于哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列(如SEQ ID NO.1所示)，包含Kozak序列、tPA信号肽序列、IL-27B链(EBI3)序列、linker序列和IL-27A链(p28)序列。将所述可用于哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列通过BamHI和EcoRI内切酶连接入pHBAd腺病毒表达载体中。所述可用于哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列可编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
进一步优选的，所述步骤(2)为：取新鲜脐带，无菌生理盐水清洗去除血液，而后去除静脉、包膜和动脉，将华通氏胶剪碎后接种于培养皿中，加入间充质干细胞培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养6-8天，可见大量梭形细胞从组织块中爬出，即为所述的间充质干细胞。
下面将进一步结合实施例详细描述本发明的各个部分。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、人工合成编码IL-27的DNA序列(如SEQ ID NO.1所示)
IL-27的B链成熟蛋白序列，包含209个氨基酸残基，IL-27的A链成熟蛋白序列，包含215个氨基酸残基，B链和A链之间由GGGS GGGS GGGS组成的linker相连依据人细胞偏爱的密码子对上述氨基酸序列进行人工合成。进行合成时，在基因的上游引入tPA信号肽(MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP)、Kozak序列和BamHI位点，在基因的下游引入终止密码子和EcoRI位点。
实施例2、构建表达载体
分别用BamHI和EcoRI双酶切合成的基因片段及pHBAd腺病毒表达载体，37℃恒温过夜。将酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳切下目的片段后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。将回收的酶切后目的基因与载体按照3：1的摩尔比例混匀，使用T4 DNA Ligase连接酶16℃PCR仪恒温连接过夜，构建pHBAd-IL27重组质粒。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，转化的感受态细胞涂均匀于含有氨苄西林(100μg/mL)的LB平板培养基上，待菌液被完全吸收后，37℃倒置培养12-16h。用无菌枪头从转化平板上挑取4-8个生长状态良好的单菌落，接种于5mL含氨苄西林(100μg/mL)的LB培养基中，37℃强烈振荡(225rpm)培养过夜。使用快速质粒小提试剂盒提取质粒DNA，用BamHI和EcoRI双切鉴定重组质粒pHBAd-IL27，37℃消化3h，根据内切酶谱鉴定出正确克隆。选取酶切图谱正确的克隆，送测序公司进行测序验证。取测序验证正确的克隆，使用质粒大提试剂盒提取获得大量的重组质粒pHBAd-IL27，而后使用Lipofiter转染试剂将pHBAd-IL27质粒和pHBAd-BHG质粒转染包装病毒293A细胞，待细胞大部分病变并从底部脱落时收毒，反复冻融3次后，3000r/min离心5min，收集上清，获得大量含有上述IL-27序列的成熟腺病毒，检测计算病毒滴度后，储存于-80℃冰箱，用于后续实验。
实施例3、获取脐带间充质干细胞
取新鲜脐带，无菌生理盐水清洗去除血液，剪成4cm的小段，而后去除静脉、包膜和2条动脉，将华通氏胶剪碎后接种于10cm培养皿中，加入间充质干细胞培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养6-8天，可见大量梭形细胞从组织块中爬出，即为所述的间充质干细胞，而后进行传代扩增和纯化鉴定所获得的脐带间充质干细胞。
实施例4、脐带间充质干细胞的转染
将脐带间充质干细胞接种于T175培养瓶中，待细胞密度达到约为80％时，使用感染复数(MOI)为200的分泌表达IL-27腺病毒感染脐带间充质干细胞，6h后换液，继续培养72h，收集上清提取外泌体，取2ml上清用于ELISA法检测IL-27的表达情况。
实施例5、脐带间充质干细胞外泌体的制备
采用差速离心法进行外泌体的提取，具体步骤如下：4℃，2000×g，离心10分钟，取上清。4℃，10000×g，离心30分钟，取上清。4℃，100000×g，持续离心120分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100000×g离心120分钟，获得外泌体沉淀。使用生理盐水重悬后，BCA方法定量。
实施例6、过敏性鼻炎喷剂的制备
上述用于治疗过敏性鼻炎的喷剂包含间充质干细胞外泌体，桉叶素，甘油，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠，EDTA-Na2和苯扎氯铵的水溶液。
微晶纤维素-羧甲基纤维素钠在鼻喷剂中主要起助悬剂和增稠剂的作用，有助于活性成分在鼻腔中的分布和存留时间，提高药物的利用率，其浓度为0.91-2.1％，本方案中使用的浓度优选为1.5％。
本实施例中按照如下处方组成进行配制：
表一、间充质干细胞外泌体过敏性鼻炎喷剂配方组成
Figure BDA0003184721590000081
取处方量的去离子水，依次加入甘油、桉叶素、EDTA-Na2、苯扎氯铵、间充质干细胞外泌体，边加边搅拌使其充分溶解，最后加入微晶纤维素-羧甲基纤维素钠，搅拌充分溶解后，使用HCl调节pH值为6.0左右，而后0.45μm无菌滤膜过滤除菌，装入无菌的鼻喷剂瓶中，即得所述的包含间充质干细胞外泌体的过敏性鼻炎治疗喷剂。
实施例7、过敏性鼻炎喷剂对大鼠过敏性鼻炎的治疗作用研究
1)大鼠过敏性鼻炎模型的建立
雄性Wistar大鼠60只，体质量180-200g，随机抽取10只作为正常大鼠空白组，剩余的大鼠每侧鼻孔使用微量加样器滴入10％甲苯二异氰酸酯(TDI)的橄榄油溶液5μl，每天1次，连续7天，进行激发造模，正常大鼠空白组同方式同等剂量给予橄榄油。末次激发后30min，通过观察大鼠的搔鼻、喷嚏和流涕情况评分判断造模是否成功。评分标准为：搔鼻1-2次、喷嚏1-3个、流涕至鼻孔各计1分；搔鼻多次、喷嚏4-10个、流涕超出前鼻孔各计2分；剧烈抓挠鼻面不止、到处擦磨、喷嚏11个以上、流涕满面各计3分。各症状计分叠加，总分超过5分者为造模成功。
2)大鼠过敏性鼻炎模型的治疗实验研究
2.1大鼠的分组与给药
造模成功后的大鼠，分为模型空白组、阳性对照组、外泌体喷剂低、中、高剂量组，每组10只进行分组，而后进行给药实验，空白组使用微量加样器每鼻孔给予15μl生理盐水，阳性对照组使用微量加样器每鼻孔给予15μl糠酸莫米松鼻喷雾剂，外泌体喷剂低、中、高剂量组使用微量加样器每鼻孔给予5μl、10μl、15μl的外泌体喷剂。同时对模型组大鼠隔日给予每鼻孔10％甲苯二异氰酸酯(TDI)的橄榄油溶液5μl维持致敏，正常大鼠空白组同方式同等剂量给予橄榄油，至实验结束。
2.2观测指标与结果
2.2.1鼻炎行为指标与得分：
于造模成功分组时、给药第7天和给药第14天，分别评价大鼠鼻炎症状的行为指标如搔鼻、喷嚏和流涕情况，并按照上述评分标准进行统计和计算，结果如下表所示：
表二、大鼠过敏性鼻炎症状的行为学积分
Figure BDA0003184721590000091
Figure BDA0003184721590000092
*表示与模型组相比p﹤0.01，具有显著差异。
2.2.2鼻粘膜组织HE染色病理结果
取各组大鼠鼻粘膜呼吸区，置于组织固定液中固定，经制蜡块切片，HE染色，在光学显微镜下观察各组大鼠鼻粘膜炎症情况。病理结果按照如下标准进行分级：“-”鼻粘膜上皮、粘膜下组织均无炎症反应和渗出物；“+”粘膜下充血并有少量炎症细胞浸润；“++”粘膜下有大量炎症细胞浸润，鼻腔内有炎性渗出物；“+++”粘膜下有大量炎症细胞浸润，粘膜下组织增生，可见粘膜脱落，鼻腔内有炎性渗出物和出血现象。
表三、大鼠粘膜组织HE染色病理结果
Figure BDA0003184721590000101
这些结果说明，按照本发明方案所获得的含有一种基因修饰的间充质干细胞外泌体制备的鼻腔喷剂，对过敏性鼻炎具有显著的治疗效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
1.本发明将IL-27基因修饰的间充质干细胞外泌体作为活性成分用于过敏性鼻炎的治疗，通过分泌表达IL-27因子，增强了间充质干细胞外泌体的免疫调节和抗过敏的功能，能够很好地修复鼻腔微环境，改善过敏性鼻炎的症状，达到治疗过敏性鼻炎的目的，治疗效果显著，且安全性好，没有激素产品的依赖性等副作用。
2.通过IL-27基因修饰后的间充质干细胞所获得的外泌体在形成外泌体的同时将有活性的IL-27蛋白一并装入外泌体中，赋予了间充质干细胞更强的免疫调节功能，从而增强了其所分泌的外泌体对过敏性鼻炎的治疗效果。
3.通过IL-27基因修饰后的间充质干细胞所获得的外泌体在形成外泌体的同时将有活性的IL-27蛋白一并装入外泌体中，提高了IL-27活性蛋白的稳定性。
4.通过IL-27基因修饰后的间充质干细胞所获得的外泌体在形成外泌体的同时将有活性的IL-27蛋白一并装入外泌体中，借助外泌体传递其所包含的核酸、蛋白质等生物信息，进而进一步提高了活性因子IL-27蛋白的生物利用率，这些因素综合作用可以获得更优的过敏性鼻炎治疗效果；
5.每1000ml鼻喷雾剂中，桉叶素(3.0-7.0g)与基因修饰的间充质干细胞外泌体(5.0-15.0mg)协同作用，进一步增强了过敏性鼻炎的治疗效果。
以上所述为本发明相关实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。例如，本发明的基因修饰的间充质干细胞外泌体还可用于哮喘、肺纤维化或类风湿性关节炎的治疗。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure BDA0003184721590000121
Figure BDA0003184721590000131
Figure BDA0003184721590000141
序列表
<110> 赛浦生物科技（长春）有限公司
<120> 基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccgccg ccaccatgga cgccatgaag agaggcctgt gctgcgtgct gctgctgtgc 60
ggcgctgtgt ttgtgagccc tagaaagggg cctcctgccg ctctgaccct gcctagagtg 120
cagtgcagag ccagcaggta tcccatcgcc gtcgattgca gctggaccct gccccctgct 180
cccaacagca catctcccgt gagcttcatc gccacctaca gactgggaat ggctgccaga 240
ggccacagct ggccctgcct gcagcagaca cccacttcta caagctgcac catcaccgac 300
gtgcagctgt tcagcatggc tccctacgtg ctgaacgtga ccgccgtgca cccctggggc 360
tctagctcta gcttcgtgcc cttcatcacc gagcacatca tcaagcccga ccctcccgag 420
ggcgtgaggc tgtctcctct ggccgagaga cagcttcaag tacagtggga acctcccggc 480
agctggccct tccccgagat cttcagcctg aagtactgga tcagatacaa gagacaaggc 540
gctgccaggt tccacagagt gggccctatc gaggccacaa gcttcatcct gagagccgtc 600
agacctagag ctagatacta cgtgcaagtg gctgcccaag acctcaccga ctacggcgag 660
ttaagcgatt ggtctctgcc tgccaccgca accatgtcat taggcaaagg aggcgggagc 720
ggcggtgggt ctggcggcgg aagctttcct agacctcccg gcagacctca gctgagcctg 780
caagagctga ggagagagtt caccgtgtct ctgcacctgg ctagaaagct gctgagcgag 840
gtgagaggcc aagcccacag gttcgccgag agccacctgc ctggcgtgaa cctgtacctg 900
ctgcctctgg gcgagcagct gcccgacgtg agcctgacct tccaagcctg gaggagactg 960
agcgaccccg agagactgtg cttcatctct accactctgc agcccttcca cgccctgctg 1020
ggcggcttag gtacccaagg cagatggacc aacatggaga gaatgcagct gtgggccatg 1080
aggctggacc tgagagacct gcagagacac ctgagattcc aagtgctggc tgctggcttc 1140
aacctgcccg aggaggagga ggaggaggag gaggaggaag aggaggaaag aaagggactg 1200
ctccctggtg ccttaggctc tgcactacaa ggccctgccc aagtgagctg gcctcagctg 1260
ctgtctacct acaggttgct gcacagcctg gagctggtgc tgagcagagc agtgagggaa 1320
ctgctcctcc tgagcaaggc tgggcacagc gtgtggcctc tgggcttccc cactctgagc 1380
cctcagccct gataagaatt c 1401
<210> 2
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu
20 25 30
Pro Arg Val Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys
35 40 45
Ser Trp Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe
50 55 60
Ile Ala Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro
65 70 75 80
Cys Leu Gln Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val
85 90 95
Gln Leu Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His
100 105 110
Pro Trp Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile
115 120 125
Ile Lys Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu
130 135 140
Arg Gln Leu Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro
145 150 155 160
Glu Ile Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala
165 170 175
Ala Arg Phe His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu
180 185 190
Arg Ala Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala Gln
195 200 205
Asp Leu Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr
210 215 220
Ala Thr Met Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Phe Pro Arg Pro Pro Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln
245 250 255
Glu Leu Arg Arg Glu Phe Thr Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu
260 265 270
Leu Ser Glu Val Arg Gly Gln Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu
275 280 285
Pro Gly Val Asn Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp
290 295 300
Val Ser Leu Thr Phe Gln Ala Trp Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg
305 310 315 320
Leu Cys Phe Ile Ser Thr Thr Leu Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly
325 330 335
Gly Leu Gly Thr Gln Gly Arg Trp Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu
340 345 350
Trp Ala Met Arg Leu Asp Leu Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe
355 360 365
Gln Val Leu Ala Ala Gly Phe Asn Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu
370 375 380
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Arg Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu
385 390 395 400
Gly Ser Ala Leu Gln Gly Pro Ala Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu
405 410 415
Ser Thr Tyr Arg Leu Leu His Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala
420 425 430
Val Arg Glu Leu Leu Leu Leu Ser Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro
435 440 445
Leu Gly Phe Pro Thr Leu Ser Pro Gln Pro
450 455

Claims (8)

1.一种用于过敏性鼻炎的基因修饰的间充质干细胞外泌体，其特征在于通过以下步骤获得：
设计获得哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列，该哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列包含tPA信号肽编码序列、IL-27B链编码序列、linker序列和IL-27A链编码序列，如SEQ ID NO.1所示；
将所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列转入间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞；
培养该基因修饰的间充质干细胞获得所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
2.一种用于过敏性鼻炎的基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于以下步骤：
a.设计获得哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列，该哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列包含tPA信号肽编码序列、IL-27B链编码序列、linker序列和IL-27A链编码序列，如SEQ ID NO.1所示；
b.将所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列转入间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞；
c.培养该基因修饰的间充质干细胞获得所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a中，所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列通过人工合成，其中，IL-27B链和IL-27A链之间由GGGS GGGS GGGS组成的linker相连并依据人细胞偏爱的密码子对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行人工合成，进行合成时，在基因的上游引入tPA信号肽、Kozak序列和BamHI位点，在基因的下游引入终止密码子和EcoRI位点。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤b具体为：分别用BamHI和EcoRI双酶切人工合成的所述核酸序列及pHBAd腺病毒表达载体，构建pHBAd-IL27重组质粒，使用Lipofiter转染试剂将pHBAd-IL27重组质粒和pHBAd-BHG质粒转染包装病毒293A细胞，所述细胞病变并从底部脱落，获得含有所述哺乳动物细胞高效表达IL-27的核酸序列的成熟腺病毒；使用所述成熟腺病毒感染所述间充质干细胞获得基因修饰的间充质干细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤c具体为：培养该基因修饰的间充质干细胞，收集上清提取所述基因修饰的间充质干细胞外泌体。
6.一种基因修饰的间充质干细胞外泌体在制备治疗过敏性鼻炎药物中的应用，其特征在于所述基因修饰的间充质干细胞为SEQ ID NO.1所示的核酸序列修饰的间充质干细胞。
7.一种用于过敏性鼻炎的鼻喷雾剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
采用基因修饰的间充质干细胞外泌体；
取去离子水，依次加入甘油、桉叶素、EDTA-Na2、苯扎氯铵以及所述基因修饰的间充质干细胞外泌体，边加边搅拌使其充分溶解，最后加入微晶纤维素-羧甲基纤维素钠，搅拌充分溶解后，使用HCl调节pH值为5.2-6.6，即得所述的鼻喷雾剂；
其中，每1000ml所述的鼻喷雾剂包含所述基因修饰的间充质干细胞外泌体5.0-15.0mg，桉叶素3.0-7.0g，甘油23.0-30.0g，微晶纤维素-羧甲基纤维素钠12.0-18.0g，EDTA-Na2 0.5-1.0g，苯扎氯铵0.2g，溶剂为去离子水；
其中，所述基因修饰的间充质干细胞为SEQ ID NO.1所示的核酸序列修饰的间充质干细胞。
8.一种用于过敏性鼻炎的鼻喷雾剂，其特征在于每1000ml所述的鼻喷雾剂包含：
基因修饰的间充质干细胞外泌体5.0-15.0mg；
桉叶素3.0-7.0g；
甘油23.0-30.0g；
微晶纤维素-羧甲基纤维素钠12.0-18.0g；
EDTA-Na2 0.5-1.0g；
苯扎氯铵0.2g；
余量为去离子水；
其中，所述基因修饰的间充质干细胞为SEQ ID NO.1所示的核酸序列修饰的间充质干细胞。
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