CN115015401A - 一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测，所述检测方法包括如下步骤：S1：供试品溶液制备：将茵陈、栀子和大黄在甲醇中混合，超声、过滤、浓缩、稀释、过滤得到供试品溶液；S2：对照品溶液制备：将目标对照品溶解，过滤，即得对照品溶液；S3：取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，得到色谱图；将色谱图导入国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，自动计算相似度；所述色谱条件为：C18色谱柱；以水为流动相A，甲醇为流动相B；流速为0.8‑1.2mL/min；采用梯度洗脱，检测波长为205‑280nm；进样量为5‑20μL；柱温为25‑35℃。本发明所述指纹图谱检测方法有效控制茵陈蒿汤复方制剂特征成分，所述指纹图谱质量好，精密度、稳定性和重复性佳。

Description

一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法。
背景技术
汉代张仲景所著《伤寒论》中有记载治疗湿热黄疸之中药名方，首选茵陈蒿汤，能驱热邪通水源、除胃热而泄瘀热。现代药理研究表明此复方具有促胆红素代谢、抗炎利胆、抗氧化、抗病毒及改善肝功能之功效，常被用来治疗各种肝脏疾病茵陈蒿汤复方制剂成分复杂多样，包含不同结构类型的化学成分，即黄酮类(如栀子素、茵陈黄铜)，有机酸(如3-咖啡酰奎宁酸)，羟基蒽醌类(如大黄酚、大黄酸、大黄素)等，以其多靶点、多成分的整体调节为主，在体内具有协同或拮抗等相互作用。正确揭示中药复方作用机制的科学内涵须得阐明成分间的配伍关系和相互作用，了解其基础的化学成分。
近年来，因茵陈蒿汤明显的临床作用效果，研究人员多以制药方式不同及药物入血成分检测研究为主，实验条件高、耗时长等导致无法大面积推广应用。
因此，本发明针对茵陈蒿汤复方制剂的有效成分进行了研究，建立了一种更加高效、便捷的实验方法，利用该方法能够初步探索中药复合成分的化学成分，进行成分的有效鉴定。
发明内容
针对上述现有技术的缺点，本发明提供一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
S1：供试品溶液制备：将茵陈、栀子和大黄在甲醇中混合，超声、过滤、浓缩、稀释、过滤得到供试品溶液；
S2：对照品溶液制备：将目标对照品溶解，过滤，即得对照品溶液；
S3：取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，得到色谱图；将色谱图导入国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，自动计算相似度；
所述液相色谱仪的色谱条件为：C18色谱柱；以水为流动相A，以甲醇为流动相B；流速为0.8-1.2mL/min；采用梯度洗脱，检测波长为205-280nm；进样量为5-20μL；柱温为25-35℃。
本发明采用高效液相色谱指纹图谱检测方法可以高效的同时检测出茵陈蒿汤复方制剂中绿原酸、咖啡酸、京尼平、栀子苷、芦丁、槲皮素、没食子酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚共11中成分的特征峰及含量，并导入国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行数据分析，有效验证茵陈蒿汤复方制剂的化学成分，为临床上治疗肝病提供理论验证。
本申请所述国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统为2012版国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统。
作为本发明的优选实施方式，色谱条件中，流速为1.0mL/min；检测波长为254nm；进样量为20μL；柱温为30℃。
本发明选用波长为254nm为色谱检测波长，能够全面展现茵陈蒿汤复方制剂的各吸收峰，色谱峰锋形、分离度较好，并且能够满足定量检测的要求。
作为本发明的优选实施方式，所述色谱柱为Shim-pack GIST C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm，5μm。
作为本发明的优选实施方式，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：0-10min，0％B；10-85min，10％B→95％B；85-90min，95％B→10％B；90-105min，10％B。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤S1中，供试品溶的制备方法具体包括：将茵陈、栀子颗粒和大黄颗粒混合均匀后，加入甲醇超声收集滤液，滤渣再加入甲醇超声，重复过滤2次，合并滤液后，将滤液浓缩得到浓度为1g/mL的浓缩液，取浓缩液用甲醇稀释得稀释液备用；过滤稀释液得到供试品溶液。
本实验作者选用甲醇超声提取方法对茵陈蒿汤复方制剂中的成分进行提取，相比传统的煎煮法，超声提取方法提取效率高，峰数多，而且实验操作简单快捷。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤S2中，目标对照品包括绿原酸、咖啡酸、京尼平、栀子苷、芦丁、槲皮素、没食子酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤S2中，对照品溶液制备具体包括：将目标对照品分别使用甲醇定容，配制为质量浓度为2mg/mL的对照品储备液；将咖啡酸、没食子酸对照品储备液加甲醇定容稀释100倍，将绿原酸、芦丁、槲皮素、栀子苷、京尼平、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素对照品储备液加甲醇定容稀释50倍，将大黄素甲醚对照品储备液加甲醇定容稀释10倍，过滤，得到11个对照品溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用最快捷的甲醇超声浸泡法对茵陈蒿汤复方制剂建立指纹图谱，该方法不改变其化学成分和性质，并且简便、快速、耗时短，且能够有效的检测茵陈蒿汤复方制剂中的活性成分。本发明所述茵陈蒿汤复方制剂指纹图谱检测方法能够有效的控制茵陈蒿汤复方制剂的特征成分，且使用梯度洗脱所得的指纹图谱质量更好，精密度、稳定性和重复性佳。
附图说明
图1为实施例1测试对照品溶液重叠色谱图；
图2为实施例1茵陈蒿汤复方制剂供试品溶液色谱图；
图3为实施例2中8批茵陈蒿汤复方制剂以及S6、S7、S8的24小时重复样品的HPLC指纹图谱和对照图谱。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
S1：供试品溶液制备：将9g茵陈、6g栀子颗粒和3g大黄颗粒混合均匀后，加入200mL甲醇超声20min收集滤液，滤渣再加入甲醇超声，重复过滤2次，合并滤液后，将滤液浓缩得到浓度为1g/mL的浓缩液，取浓缩液用甲醇稀释得稀释液备用；使用0.45μm微孔滤膜过滤稀释液得到供试品溶液；
S2：对照品溶液制备：将2.5mg绿原酸、咖啡酸、京尼平、栀子苷、芦丁、槲皮素、没食子酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚分别使用甲醇定容，配制为质量浓度为2mg/mL的对照品储备液；将咖啡酸、没食子酸对照品储备液加甲醇定容稀释100倍，将绿原酸、芦丁、槲皮素、栀子苷、京尼平、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素对照品储备液加甲醇定容稀释50倍，将大黄素甲醚对照品储备液加甲醇定容稀释10倍，使用0.45μm微孔滤膜过滤，得到11个对照品溶液；
S3：取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，得到色谱图；
S4：将色谱图导入国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)，自动计算相似度；
所述色谱条件为：以C18色谱柱；以水为流动相A，以甲醇为流动相B；流速为1.0mL/min；采用梯度洗脱，检测波长为254nm；进样量为20μL；柱温为30℃；所述梯度洗脱的洗脱程序如下：0-10min，0％B；10-85min，10％B→95％B；85-90min，95％B→10％B；90-105min，10％B。
图1为实施例1测试对照品溶液重叠色谱图；图2为实施例1茵陈蒿汤复方制剂供试品溶液色谱图。图1和2中1-11分别以下组分的特征峰：1为没食子酸、2为咖啡酸、3为绿原酸、4为栀子苷、5为京尼平、6为芦丁、7为檞皮素、8为芦荟大黄素、9为大黄素、10为大黄酚、11为大黄素甲醚图。根据图1和2可知：(1)各对照品色谱峰与其左右干扰峰分离度良好，且其他杂质峰无干扰；(2)初步建立的茵陈蒿汤方剂指纹图谱有11个成分得到鉴定：绿原酸、咖啡酸、檞皮素是茵陈和栀子共有，栀子苷和芦丁来自栀子，没食子酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素及大黄素甲醚为大黄独有；(3)茵陈和栀子的指纹图谱保留时间大致在0～60min；保留时间在60～90min共有峰主要来源于大黄。
(1)供试品溶液的专属性试验
分别取空白溶剂和茵陈蒿汤供试品溶液，分别进样分析；所述空白溶剂为甲醇。
结果表明，空白溶剂对供试品溶液的测定不存在干扰，专属性良好。
(2)供试品溶液的精密度试验
取同一份供试品溶液，分别连续进样6次，将数据导入国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，以10号峰，即大黄酚，作为参照峰，计算其他共有指纹峰的相对保留时间，结果见表1。
表1
Figure BDA0003507382970000051
测试6次供试品图谱与对照组图谱的平均相似度为0.975；11种有效成分保留时间的RSD在0.02％～0.53％，表明本方法的仪器精密度良好。
(3)供试品溶液的稳定性试验
取同一份供试品溶液，分别在制备后0h、2h、6h、12h、18h、24h进样测定，将数据导入国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，以10号峰，即大黄酚，作为参照峰,计算其他共有指纹峰的相对保留时间，结果见表2。
表2
Figure BDA0003507382970000061
测试6次供试品图谱与对照组图谱的平均相似度为0.972；11种有效成分保留时间的RSD均小于0.7％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
(4)供试品溶液的重复性试验
取同一份供试品溶液，平行进样测定5次，将数据导入国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，以10号峰，即大黄酚，作为参照峰,计算其他共有指纹峰的相对保留时间，结果见表3。
表3
Figure BDA0003507382970000062
Figure BDA0003507382970000071
测试5次供试品图谱与对照组图谱的平均相似度为0.974；11种有效成分保留时间的RSD均小于0.6％，表明该方法可进行重复实验。
实施例2
一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱的建立
将不同批次的茵陈、栀子和大黄按照实施例1随机搭配为8批茵陈蒿汤复方制剂，并分别标记为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8，具体搭配信息见表4。
按照实施例1的拟定方法分别制备上述8批茵陈蒿汤复方制剂的供试品溶液和S6、S7、S8分别制备后24小时的重复实验样品，再按照实施例1拟定的色谱条件分别测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度软件”(2012版)评价8批茵陈蒿汤和对照品溶液的HPLC指纹图谱，计算其整体相似度，结果见表5，编号R为对照品溶液，S6、S7、S8分别制备后24小时的重复实验样品，分别为编号S6-1、S7-1、S8-1。
表4
Figure BDA0003507382970000072
Figure BDA0003507382970000081
表5
Figure BDA0003507382970000082
Figure BDA0003507382970000091
根据表5的结果可知，8个不同批次的茵陈蒿汤复方制剂以及S6、S7、S8的24小时重复样品与对照指纹图谱相似度均大于0.900，表明各批次的茵陈蒿汤复方制剂具有较好的一致性。
图3为实施例2中8批茵陈蒿汤复方制剂以及S6、S7、S8的24小时重复样品的HPLC指纹图谱和对照图谱。从图中可以看出在茵陈蒿汤复方制剂的HPLC指纹图谱中共标定多个共有峰，通过与混合对照品溶液图谱的峰保留时间及光谱图对照，分别指认了11个色谱峰。其中1号峰为没食子酸，2号峰为咖啡酸，3号峰为绿原酸，4号峰为栀子苷，5号峰为京尼平，6号峰为芦丁，7号峰为檞皮素，8号峰为芦荟大黄素，9号峰为大黄素，10号峰为大黄酚，11号峰为大黄素甲醚。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：供试品溶液制备：将茵陈、栀子和大黄在甲醇中混合，超声、过滤、浓缩、稀释、过滤得到供试品溶液；
S2：对照品溶液制备：将目标对照品溶解、过滤即得对照品溶液；
S3：取供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，得到色谱图；将色谱图导入国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，自动计算相似度；
所述液相色谱仪的色谱条件为：C18色谱柱；以水为流动相A，甲醇为流动相B；流速为0.8-1.2mL/min；采用梯度洗脱，检测波长为205-280nm；进样量为5-20μL；柱温为25-35℃。
2.如权利要求1所述的茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，色谱条件中，流速为1.0mL/min；检测波长为254nm；进样量为20μL；柱温为30℃。
3.如权利要求1所述的茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Shim-pack GIST C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm，5μm。
4.如权利要求1所述的茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：0-10min，0％B；10-85min，10％B→95％B；85-90min，95％B→10％B；90-105min，10％B。
5.如权利要求1所述的茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，供试品溶的制备方法具体包括：将茵陈、栀子颗粒和大黄颗粒混合均匀后，加入甲醇超声收集滤液，滤渣再加入甲醇超声，重复过滤2次，合并滤液后，将滤液浓缩得到浓度为1g/mL的浓缩液，取浓缩液用甲醇稀释得稀释液备用；过滤稀释液得到供试品溶液。
6.如权利要求1所述的茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，目标对照品包括绿原酸、咖啡酸、京尼平、栀子苷、芦丁、槲皮素、没食子酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚。
7.如权利要求6所述的茵陈蒿汤复方制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，对照品溶液制备具体包括：将目标对照品分别使用甲醇定容，配制为质量浓度为2mg/mL的对照品储备液；将咖啡酸、没食子酸对照品储备液加甲醇定容稀释100倍，将绿原酸、芦丁、槲皮素、栀子苷、京尼平、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素对照品储备液加甲醇定容稀释50倍，将大黄素甲醚对照品储备液加甲醇定容稀释10倍，过滤，得到11个对照品溶液。
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