CN115011711A - 闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法，根据鮰爱德华氏菌保守蛋白中的假设蛋白epi18设计引物，在反应体系中通过pH敏感的指示剂，可实现闭管可视化判定靶标基因的目的，该试剂盒检测灵敏度高，DNA最低检出率为7.9 copies/μL，特异性强，检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断；也可直接从病鱼脑组织直接提取DNA进行快速检测，相较于原始检测方法，速度快、可视化程度高，具有良好野外及资源有限的基层实验室检测应用的前景。

Description

闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法。

背景技术

斑马鱼是国际上应用于科学研究最广的实验鱼类，其健康状况和质量是开展一切与斑马鱼相关研究工作的基础。在斑马鱼室内养殖过程中，各类细菌性疾病的爆发，严重制约了以斑马鱼为基础的相关研究工作的进展。据报道鮰爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)是一种斑马鱼鱼房内危害比较严重的细菌性病原，一旦在斑马鱼实验室内爆发，传播迅速，死亡率高达50％，造成损失巨大，感染存活下来的斑马鱼依旧可以携带病原，其粪便经健康鱼吞食，或者通过摄食已感染鱼尸体而传染给其它健康鱼类造成第二次该类鱼病爆发。病鱼常表现为鱼腹部膨大，口腔、下颌、眼眶、鳃盖、肛门及鳍条基部等部位明显充血、出血，头顶正中部位皮下发红，头背部颅侧皮肤坏死、溃烂，病情严重的头骨裂开暴露脑组织等症状。

目前，鮰爱德华氏菌的检测方法有常规的分离培养(分离培养需要至少2天时间)、生理生化鉴定，聚合酶链式反应以及16S rDNA测序等。常规方法具有检测时间长、耗时耗力等缺点；酶联免疫检测方法(ELISA)可以快速检测细菌，但必需先制备相关抗体，步骤繁琐耗时。PCR技术具有灵敏、特异、快速等优点，广泛应用于水产养殖病原的检测中。但PCR技术对实验人员和环境的要求高，仪器设备贵、操作步骤多。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR仪器设备昂贵，无法用于现场检测。因此，建立快速、准确、灵敏的检测鮰爱德华氏菌的新方法，对于疾病的早期诊断和预警、实时监测，及时治疗具有重要的意义。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由Notomi T等人发明的新型核酸扩增技术(PMID:10871386)。该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在61-65℃的恒温条件下完成反应，避免了类似PCR扩增的变性、退火、延伸等多温度变化过程，极大地降低了反应设备的生产成本；同时其仍能保留等同于PCR技术的高灵敏度和特异性等优点，在快速检测领域展示出了巨大的活力。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。

目前，在其它物种分离的鮰爱德华氏菌检测中，国外Yeh等已有关于LAMP技术的报道(PMID:16157211)。然而经我们实践检测发现上述报道所用引物在斑马鱼源鮰爱德华氏菌检测中并不工作，且对LAMP结果判定，主要通过琼脂糖电泳实现，而LAMP扩增产物产量巨大，在开盖检测过程极易产生气溶胶等污染问题导致假阳性结果的出现。2015年有研究报道，在核酸等温扩增反应过程中，伴随着靶基因扩增产物的积累过程中，产生了大量的H⁺，使反应体系pH下降(PMID:25652028)。因此，可以利用pH敏感的指示剂通过颜色变化以判断LAMP反应是否发生，从而实现闭管可视化结果判定的目的。目前，尚未见pH指示剂应用于斑马鱼源鮰爱德华氏菌LAMP检测的相关报道。

发明内容

本发明提供了一种闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法，根据鮰爱德华氏菌保守蛋白中的假设蛋白epi18设计设计引物，在反应体系中添加了pH指示剂，可实现闭管可视化判定靶标基因的目的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的LAMP引物组合：外引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，内引物序列如SEQ ID NO.3和4所示。

检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒，包括序列如SEQ ID NO.1和2所示的外引物，序列如SEQ ID NO.3和4所示的内引物。

优选地，外引物与内引物的浓度比1：4-8。

优选地，上述试剂盒还包括LAMP反应预混液(含pH指示剂)，阳性质粒，所述的阳性质粒为含有鮰爱德华氏菌epi18基因的质粒。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

1、本发明建立的斑马鱼源鮰爱德华氏菌LAMP检测方法特异性强，所用的特异性引物根据文献报道的鮰爱德华氏菌保守蛋白中的假设蛋白epi18设计，且在反应体系中添加了pH指示剂，以达到闭管可视化判定靶基因是否被有效扩增的效果，可有效避免利用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料等方法引起的假阳性问题。

2、本发明检测灵敏度高，基因组DNA最低检出率为7.9copies/μL；检测时间短，扩增反应只需60min；可以直接从病鱼脑组织DNA中直接检出鮰爱德华氏菌病原，从样品基因组DNA的提取到完成结果判断，整个检测流程仅需70min，比常规分离培养病原，提取病原基因组DNA，再进行PCR等分子或生理生化方法对病原进行确认缩短超过2天时间，大幅度提高检测速度；仪器设备要求低，无需常规PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统等，只需一个水浴锅就可完成检测，操作简单，结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作，检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断，具有良好野外及资源有限的基层实验室检测应用的前景。

附图说明

图1为实施例1中样品检测结果。1为待检样品，2为阳性对照组，3为阴性对照组。

图2为实施例2中灵敏度检测结果。1～6分别是10倍稀释的基因组模板，对应的模板中靶基因epi18拷贝数分别为7.9×10⁵、7.9×10⁴、7.9×10³、7.9×10²、7.9×10¹、7.9×10⁰(copy/μL)，7为阴性对照。

图3为实施案例3中采用文献提供检测鮰爱德华氏菌引物电泳方法检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌结果。1为DL2000 Marker，2为斑马鱼源鮰爱德华氏菌，3为阴性对照。

图4为实施案例3中采用文献提供检测鮰爱德华氏菌引物可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌结果。1为斑马鱼源鮰爱德华氏菌，2为阴性对照。

图5为实施例3中特异性检测结果。1～6分别为鮰爱德华氏菌、类志贺氏菌、弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、大肠杆菌，标记7为阴性对照。

图6为实施例4中斑马鱼病鱼脑组织中病原物的LAMP检测结果。1-4分别为病原脑组织DNA模板、阳性鮰爱德华氏菌DNA模板、健康鱼脑组织DNA模板、无菌水模板。

具体实施方式

实施例1：LAMP技术检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的方法的建立

(1)LAMP引物设计：根据文献报道的鮰爱德华氏菌的保守蛋白epi18基因在NCBI中查找其编码序列设计外引物为F3a和B3a，以国家斑马鱼资源中心分离保藏的斑马鱼源鮰爱德华氏菌质粒为模板，进行PCR扩增，扩增产物测序，确认该段序列碱基顺序，在此基础上再设计LAMP的内引物为FIPa和BIPa，引物序列见表1。

表1斑马鱼源鮰爱德华氏菌的LAMP检测引物序列

(2)致病菌基因组DNA提取：将-70℃长期保存国家斑马鱼资源中心独立分离出的斑马鱼源的鮰爱德华氏菌菌种(E.ictaluri)E1(柳力月等，斑马鱼“裂头病”病原的分离与鉴定及常见疾病诊断；2022)划线于BHIA固体培养基，30℃培养过夜。挑取单克隆于5mL BHI液体培养基中，30℃，165r/min摇床培养10小时左右，将过夜培养的菌体利用商品化试剂盒(天根生化科技有限公司)提取基因组DNA，置于-20℃保存，备用。或将过夜培养的菌体离心后加入到0.5mL TE缓冲液(pH8.0)或双蒸水中振荡混匀，95～100℃煮沸3～8min，10,000r/min离心取上清液，作为待检基因组DNA溶液，置-20℃保存。

(3)阳性对照的制备：以斑马鱼源鮰爱德华氏菌菌种E1的基因组DNA为模板，以epi18靶基因的F3和B3为引物进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)：2×Rapid Taq MasterMix(Vazyme)25μL，引物各2μL，模板1.0μL，超纯水20μL。反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃10min。产物经2％琼脂糖凝胶电泳后，经过切胶回收后，连接至pMD-18T载体，转化感受态细胞，测序验证，提取阳性质粒pMD-18T-epi18作为阳性对照，-20℃保存，备用。

(4)阴性对照制备：超纯水。

(5)样品检测及结果判定：取基因组DNA 1μL加入到LAMP反应体系中，所述的反应体系(25μL)中含有LAMP mix 12.5μl(含pH指示剂)，外引物10mM F3a和10mM B3a各1μl，内引物10mM FIPa和10mM BIPa各4μL，超纯水1.5μl，模板1μl，1M KOH调整体系pH为7.5～9.5。在65℃加热60min，85℃加热3min后，通过以下方式判定结果：肉眼观察反应体系的颜色，若epi18-LAMP反应体系的颜色与阳性对照相近，均变成黄色则为阳性反应，表明待检测样品中含有鮰爱德华氏菌；若epi18-LAMP反应体系颜色与阴性对照相近，即保持反应体系原有的颜色粉红色，则为阴性反应，表明待检样品中没有鮰爱德华氏菌(图1)。

实施例2：斑马鱼源鮰爱德华氏菌的闭管可视化环介导等温扩增技术的灵敏度

以实施例1构建的pMD-18T-epi18阳性质粒为模板，进行10倍比稀释，模板中靶基因epi18拷贝数分别为7.9×10⁵、7.9×10⁴、7.9×10³、7.9×10²、7.9×10¹、7.9×10⁰(copy/μL)，以无菌去离子水作为阴性对照，同时采用实施例1所述的LAMP反应体系及程序进行LAMP反应，反应体系为25μL。通过实施例1中的肉眼观察变化以判断所检测样品的结果。结果如图2显示，靶基因epi18拷贝数大于或等于7.9copy/μL检测结果为阳性，阴性对照的结果均呈现为阴性反应，说明该方法针对鮰爱德华氏菌假设基因epi18扩增的灵敏度为7.9copy/μL。

实施例3：斑马鱼源鮰爱德华氏菌闭管可视化的环介导等温扩增技术的特异性

关于在其它物种分离的鮰爱德华氏菌检测中，国外Yeh等已有关于LAMP技术的报道(PMID:16157211)，采用该文献提供的引物和电泳检测方法对斑马鱼源鮰爱德华氏菌进行检测的结果如图3所示，能特异性检出斑马鱼源鮰爱德华氏菌，但是检测结果需要跑电泳确认，存在操作复杂且容易产生气溶胶污染等弊端；若采用该文献提供的检测引物利用本发明中的闭管可视化检测方法，检测结果如图4所示，不能成功检出斑马鱼源鮰爱德华氏菌，故国外Yeh等发表的LAMP技术检测鮰爱德华氏菌方法针对闭管可视化检测鮰爱德华氏菌并不可行，其文献提到的方法仅适合于电泳检测出鮰爱德华氏菌，该方法需要检测地点具有电泳及成像设备，制备电泳凝胶及跑胶过程中还存在毒性，相比于肉眼可视化检测不存在优势。

为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实施例1中的LAMP检测方法，分别以类志贺氏菌、弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、大肠杆菌为模板，并设置以无菌去离子水为模板的阴性对照，进行特异性试验。检测结果如图5所示：鮰爱德华氏菌特异性扩增，类志贺氏菌、弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、大肠杆菌以及阴性对照均未出现扩增。上述结果说明，本发明所述的LAMP检测方法能特异性成功扩增出斑马鱼鮰爱德华氏菌的靶序列，而不与其它细菌核酸发生交叉反应，特异性好，未出现假阳性。

实施例4：闭管可视化的环介导等温扩增技术用于检测斑马鱼病鱼中鮰爱德华氏菌

从头顶穿孔、打转游动的斑马鱼中提取DNA：取发病鱼脑组织10mg至1.5mL的离心管中，利用商品化试剂盒(诺唯赞公司)快速提取组织基因组DNA，置于-20℃保存，备用。斑马鱼源鮰爱德华氏菌的LAMP检测，采用实施例1所述的LAMP反应体系及程序进行LAMP反应，反应体系为25μL。以鮰爱德华氏菌DNA模板为阳性对照，以无症状健康斑马鱼脑组织DNA模板为阴性对照，以无菌水模板为空白对照，结果如图6所示，病鱼组及阳性对照组颜色呈现黄色，其它组均为粉红色，以此判断该病鱼存在鮰爱德华氏菌感染。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 闭管可视化检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaatctccac ttccagcgag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtactgggc tttgcatgg 19

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaatggatg gactgcgcca gtttttggaa agttctggcc ctgaa 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggaataccg acattgtggc ctttttgcag gcaatgagtg ctcaa 45

Claims (4)

1.用于检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的LAMP引物组合，其特征在于，外引物序列如SEQID NO.1和2所示，内引物序列如SEQ ID NO.3和4所示。

2.检测斑马鱼源鮰爱德华氏菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，外引物与内引物的浓度比1：4-8。

4.根据权利要求2至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括含有pH指示剂的LAMP反应预混液，阳性质粒，所述的阳性质粒为含有鮰爱德华氏菌epi18基因的质粒。

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