CN115011675A - 一种slc16a2基因点突变检测引物、检测方法及其应用 - Google Patents

一种slc16a2基因点突变检测引物、检测方法及其应用 Download PDF

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阴晓琳
王亮
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Abstract

本发明公开了一种SLC16A2基因点突变检测引物、检测方法及其应用，属于基因工程技术领域。本发明设计了六对SLC16A2基因扩增引物，通过提取gDNA、SLC16A2六个外显子特异性扩增、Sanger测序、序列比对，检测SLC16A2基因六个外显子上的已知突变位点和未知突变位点，本发明可提前筛查成人女性遗传AHDS(Allan‑Herndon‑Dudley syndrome)的风险，为产前诊断提供新的方法，对于优生优育具有重要意义。

Description

一种SLC16A2基因点突变检测引物、检测方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种SLC16A2基因点突变检测引物、检测方法及其应用。
背景技术
AHDS(Allan-Herndon-Dudley syndrome)是罕见的X连锁隐性遗传病，属于遗传性痉挛性截瘫中甲状腺功能缺陷的一个亚型。临床表现复杂，主要表现为锥体束征(剪刀布态)、肌张力减退、肌肉萎缩等运动发育迟滞以及智商<30、冷漠、基本交际能力和语言永久缺失、饮食二便无法自理等智力发育迟缓，给家庭和社会带来了沉重负担。
AHDS(Allan-Herndon-Dudley syndrome)是以X连锁方式遗传，由SLC16A2基因突变导致(其中点突变比例为85％，拷贝数突变比例为15％)。SLC16A2基因编码一种完整的膜蛋白：单羧酸转运蛋白8(Monocarboxylate transporter 8，MCT8)，负责转运甲状腺激素。MCT8有助于细胞摄取四碘甲状腺原氨酸(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、反向三碘甲状腺原氨酸(rT3)和二碘甲状腺原氨酸(T2)。而SLC16A2基因在许多组织中表达，并且在中枢神经系统的发育中起重要作用。因此，男性SLC16A2基因突变会导致中枢性甲状腺功能减退症，并且存在严重的神经系统异常，包括整体发育迟缓，中枢性肌张力低下，痉挛性四肢瘫痪，肌张力障碍运动，眼球震颤以及视线和听力受损；在其他组织(肌肉，心脏，皮肤，骨骼，肠)中，临床表现为甲状腺激素利用率降低，并伴有外周甲状腺功能减退。另外，SLC16A2突变杂合子女性的甲状腺相关表型较轻，没有神经系统缺陷。SLC16A2突变杂合子女性虽然没有明显的临床表现，但是其长大成人一旦怀孕后，若腹中胎儿是男孩则百分之百患病，将会给家庭及社会带来沉重负担。因此，进行备孕期女性SLC16A2基因筛查可为产前诊断增加一种新的方法，对于优生优育具有重要意义。
发明内容
本发明旨在提供一种SLC16A2基因点突变检测的引物、检测方法及其应用，以解决上述背景技术中的问题。通过设计特异性扩增引物，进行聚合酶链式反应(PCR)，对PCR扩增产物进行Sanger测序得到样本的gDNA序列信息，与野生基因型比对，找出SLC16A2基因突变位点，该方法能够检测SLC16A2基因第1、2、3、4、5和6号外显子中已知和未知的突变。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供PCR引物在制备检测SLC16A2基因点突变的检测试剂盒中的应用，所述PCR引物的序列如SEQ ID NO:1-12所示。
进一步地，如SEQ ID NO:1-2所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第1号外显子；如SEQ ID NO:3-4所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第2号外显子；如SEQID NO:5-6所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第3号外显子；如SEQ ID NO:7-8所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第4号外显子；如SEQ ID NO:9-10所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第5号外显子；如SEQ ID NO:11-12所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第6号外显子。
本发明另一方面提供一种检测SLC16A2基因点突变的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括上述的PCR引物、PCR扩增酶及PCR扩增缓冲液。
本发明还提供一种检测SLC16A2基因点突变的检测方法，主要包括以下步骤：
(1)从外周血中提取DNA，得到gDNA，并对其浓度和纯度进行测定；
(2)将步骤(1)得到的gDNA与上述的PCR引物和PCR扩增试剂混合，经过PCR反应，扩增SLC16A2 DNA片段，并进行纯度和浓度测定；
(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)得到的SLC16A2 DNA片段的质量；
(4)通过Sanger测序法检测步骤(2)得到的SLC16A2 DNA片段，获得样本SLC16A2基因序列；
(5)将步骤(4)获得的样本SLC16A2基因序列与野生型SLC16A2基因序列比对，获得突变位点。
进一步地，步骤(1)中提取DNA过程采用QIAamp DNA Mini Kit提取试剂盒提取。
进一步地，步骤(1)中利用紫外分光光度计测量gDNA的浓度和纯度。
进一步地，步骤(2)中的PCR反应体系中正向引物和反向引物的摩尔浓度均为100～1000nM，gDNA的浓度为50～100μg/mL。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增第1、2、3、4和5号外显子时，扩增程序为：96～100℃变性5～20秒，58～62℃退火5～10秒，70～74℃延伸10～20秒，循环30～50次，0～4℃保存。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增第6号外显子时，扩增程序为：96～100℃变性5～20秒，53～57℃退火5～10秒，70～74℃延伸15～30秒，循环30～50次，0～4℃保存。
进一步地，步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳所用的琼脂糖凝胶的浓度为1～2％；电泳的电压为100～150V，时间为20～30分钟。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
本发明设计和合成PCR扩增SLC16A2基因六个外显子的引物对，不仅能检测SLC16A2基因已知点突变还能检测SLC16A2未知点突变，可提前筛查成人女性遗传AHDS(Allan-Herndon-Dudley syndrome)的风险，为产前诊断提供新的方法，对于优生优育具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
本发明实施例中若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
实施例1:
引物设计与合成：利用“PrimerPremier5”设计SLC16A2六个外显子的基因扩增引物对，具体引物序列如下：
第1号外显子的正向引物如SEQ ID NO:1所示：
5’-GAACAGGGTTCAGTAGTTTGGGAAG-3’，
第1号外显子的反向引物如SEQ ID NO:2所示：
5’-TCCCTTTCTCTCTTGCAGACACG-3’；
第2号外显子的正向引物如SEQ ID NO:3所示：
5’-ACAGGGTTCTTCTAATGCTGGAGAC-3’，
第2号外显子的反向引物如SEQ ID NO:4所示：
5’-CCCTCAGCCTTGGGGAAATAAC-3’；
第3号外显子的正向引物如SEQ ID NO:5所示：
5’-CTGGCTTTCCTTTGAACAGTCCTCT-3’，
第3号外显子的反向引物如SEQ ID NO:6所示：
5’-CCCCATTTTCCACTAAGGTCTTCC-3’
第4号外显子的正向引物如SEQ ID NO:7所示：
5’-AACACACTTTGGAAGAGTTGCCTG-3’，
第4号外显子的反向引物如SEQ ID NO:8所示：
5’-CTGTGGATAACCTTGCATTTGTGG-3’；
第5号外显子的正向引物如SEQ ID NO:9所示：
5’-GCTGTGCCTTCCACTTACAACCC-3’，
第5号外显子的反向引物如SEQ ID NO:10所示：
5’-TGCCCTTCTGGGAAAATGGAG-3’；
第6号外显子的正向引物如SEQ ID NO:11所示：
5’-TAGCTTCTTTCATAATGAGCATTCG-3’，
第6号外显子的反向引物如SEQ ID NO:12所示：
5’-GTTTTCAATATGGCACATTTGTAGC-3’。
实施例2:
SLC16A2基因点突变检测方法，主要包括以下步骤：
(1)待测样本的gDNA提取
本实施例中gDNA样本来自外周静脉血，采用QIAamp DNA Mini Kit提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作步骤提取。
(2)对待测样本提取出的gDNA利用紫外分光光度计测量其纯度和浓度。
(3)目的片段扩增，按照以下体系加入各试剂进行PCR扩增：
Figure BDA0003674971350000041
Figure BDA0003674971350000051
第1、2、3、4和5号外显子的PCR反应条件为：
Figure BDA0003674971350000052
第6号外显子的PCR反应条件为：
Figure BDA0003674971350000053
(4)检测SLC16A2基因PCR扩增产物的浓度
本实施例中SLC16A2基因PCR扩增产物的浓度采用
Figure BDA0003674971350000054
dsDNA HS Assay Kit试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。
(5)琼脂糖凝胶电泳：
配制琼脂糖凝胶(浓度为1.5％)；电泳的电压调为120V、时间为25分钟；于凝胶成像仪中分析SLC16A2六个外显子的PCR产物的质量。
(6)Sanger测序，获得所有基因的相关序列，并根据测序结果判断样本的基因是否存在突变以及具体的突变位点。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连干细胞与精准医学创新研究院
<120> 一种SLC16A2基因点突变检测引物、检测方法及其应用
<130> 20220408
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaacagggtt cagtagtttg ggaag 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tccctttctc tcttgcagac acg 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acagggttct tctaatgctg gagac 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccctcagcct tggggaaata ac 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctggctttcc tttgaacagt cctct 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccccattttc cactaaggtc ttcc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aacacacttt ggaagagttg cctg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgtggataa ccttgcattt gtgg 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctgtgcctt ccacttacaa ccc 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgcccttctg ggaaaatgga g 21
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tagcttcttt cataatgagc attcg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gttttcaata tggcacattt gtagc 25

Claims (9)

1.PCR引物在制备检测SLC16A2基因点突变的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述PCR引物的序列如SEQ ID NO:1-12所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，如SEQ ID NO:1-2所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第1号外显子；如SEQ ID NO:3-4所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第2号外显子；如SEQ ID NO:5-6所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第3号外显子；如SEQ ID NO:7-8所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第4号外显子；如SEQID NO:9-10所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第5号外显子；如SEQ ID NO:11-12所示的PCR引物用于扩增SLC16A2基因序列的第6号外显子。
3.一种检测SLC16A2基因点突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1中所述的PCR引物、PCR扩增酶及PCR扩增缓冲液。
4.一种检测SLC16A2基因点突变的检测方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)从外周血中提取DNA，得到gDNA，并对其浓度和纯度进行测定；
(2)将步骤(1)得到的gDNA与权利要求1中所述的PCR引物和PCR扩增试剂混合，经过PCR反应，扩增SLC16A2 DNA片段，并进行纯度和浓度测定；
(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)得到的SLC16A2 DNA片段的质量；
(4)通过Sanger测序法检测步骤(2)得到的SLC16A2 DNA片段，获得样本SLC16A2基因序列；
(5)将步骤(4)获得的样本SLC16A2基因序列与野生型SLC16A2基因序列比对，获得突变位点。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中提取DNA过程采用QIAampDNA Mini Kit提取试剂盒提取；利用紫外分光光度计测量gDNA的浓度和纯度。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR反应体系中正向引物和反向引物的摩尔浓度均为100～1000nM，gDNA的浓度为50～100μg/mL。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增第1、2、3、4和5号外显子时，扩增程序为：96～100℃变性5～20秒，58～62℃退火5～10秒，70～74℃延伸10～20秒，循环30～50次，0～4℃保存。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增第6号外显子时，扩增程序为：96～100℃变性5～20秒，53～57℃退火5～10秒，70～74℃延伸15～30秒，循环30～50次，0～4℃保存。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳所用的琼脂糖凝胶的浓度为1～2％；电泳的电压为100～150V，时间为20～30分钟。
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