CN115010720A - 中甸艾中倍半萜二聚体及其药物组合物与其制备方法和应用 - Google Patents

中甸艾中倍半萜二聚体及其药物组合物与其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供中甸艾中倍半萜二聚体及其药物组合物与其制备方法和应用，属于药物技术领域。本发明的结构式(I)所示21个新的倍半萜二聚体，artemzhongdianolides A1−A21(1‑21)对人肝星状细胞(HSC‑LX2)具有明显的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝纤维化药物。

Description

中甸艾中倍半萜二聚体及其药物组合物与其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于药物技术领域。具体地，涉及倍半萜二聚体化合物artemzhongdianolides A1-A21(1-21)，及其制备方法、药物组合物及其应用。
背景技术：
肝纤维化是多数肝病共同的病理过程，即在各种致病因子作用下肝脏内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)发生过度沉积，从而影响肝脏的生理结构和功能，如不及时抑制或逆转，则会加速肝硬化或肝癌的发生，严重影响人体的生存质量。目前单一控制病因或中药保肝是治疗肝纤维化的主要方式，临床上无针对肝纤维化治疗的化学合成药物。尽管近年来抗纤维化药物的研发取得了一定的进展，但一些候选药物在临床试验中难以达到预期的治疗效果或出现副作用。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肌成纤维细胞的主要来源。正常肝脏中，HSC增殖很慢，其通过调节细胞外基质的合成和降解而维持其动态平衡。当肝脏受到外界致病因子的持续刺激时，一系列复杂机制被启动，最终结果导致HSC由静息型转化为激活型，并分泌TGF-β、PDGF等各种促纤维因子，产生大量无序堆积的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，促进纤维化的发生和发展。因而，HSC是抗肝纤维化治疗的一个潜在靶点，当前许多抗肝纤维化在研药物通过抑制HSC的增殖及纤维形成能力、促进HSC的凋亡等途径以期达到治疗目的。本发明旨在基于人肝星状细胞(hepaticstellate cells line LX2,HSC-LX2)筛选模型，从天然产物中寻找新的抗肝纤维化活性成分。中甸艾(Artemisia zhongdianensis Y.R.Ling)隶属菊科蒿属植物，为多年生草本，分布于云南西北部(中甸)。
迄今为止，现有技术无倍半萜二聚体artemzhongdianolides A1-A21(1-21)的报道，也没有化合物1-21及其药物组合物作为抗肝纤维化药物的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的倍半萜二聚体，artemzhongdianolides A1-A21(1-21)，及其制备方法和应用，含artemzhongdianolidesA1-A21的药物组合物及其应用，在本发明前期工作中发现，中甸艾乙醇提取物具有显著的HSC-LX2细胞毒活性(浓度为400μg/mL时其抑制率达85.7％)，活性导向分离得到21个新的倍半萜二聚体，artemzhongdianolides A1-A21(1-21)，该类化合物对肝星状细胞具有明显的细胞毒活性，能够用于制备抗肝纤维化药物。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一系列倍半萜二聚体类化合物，artemzhongdianolides A1-A21(1-21)，具有如下式(I)所示结构：
Figure BDA0003677139230000021
本发明提供了上述倍半萜二聚体类化合物1-21的制备方法，中甸艾的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到乙酸乙酯萃取部分，然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以丙酮-石油醚以v/v计，0:100,5:95,10:90,20:80,40::60,50:50和100:0为洗脱剂梯度洗脱得到Fr.A-Fr.G七个流分；流分Fr.C经过硅胶柱层析用乙酸乙酯-石油醚以v/v计，5:95、10:90和20:80洗脱得到五个流分Fr.C1-Fr.C5；流分Fr.C5经MCI gel CHP20P柱层析，用水-甲醇10:90和0:100梯度洗脱和半制备HPLC制备得到化合物1,2,3,4,5,6,9,10,11,12；流分Fr.D经MCI gel CHP 20P柱层析，用水-甲醇40:60、60:40、80:20和100:0梯度洗脱得到4个流分Fr.D1-Fr.D4；Fr.D1经硅胶柱层析用丙酮-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80梯度洗脱后，再经过半制备HPLC得到化合物7,8,13,14,15,16,17,18,19,20,21。
本发明提供了上述技术方案所述倍半萜二聚体类化合物1-21在制备抗肝纤维化药物的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述技术方案所述的倍半萜二聚体类化合物1-21中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。
并此，还提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。以及，该药物组合物的制备方法，按上述化合物的制备方法先制得化合物1-21，然后取化合物1-21其中一种或其任意组合，再加上可药用载体。
当所述化合物1-21中的至少一种用于制备抗肝纤维化药物时，本发明优选将所述化合物1-21直接使用，或以药物组合物的形式使用。
本发明提供的药物组合物，包括上述化合物1-21中的至少一种和药学上可接受的载体或赋型剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物1-21中的至少一种与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗肝纤维化药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物1-21中的至少一种在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
1.本发明提供了一系列新的倍半萜二聚体类化合物，artemzhongdianolides A1-A21(1-21)。
2.本发明提供了制备新化合物1-21的新的方法，该方法原料易得，易于操作，适于工业化生成。
3.本发明提供了新化合物1-21作为有效成分的药物组合物，为新的抗肝纤维化药物提供了具有较好药用作用的新的药物。
4.本发明的化合物1-21对肝星状细胞(HSC-LX2)的细胞毒活性均具有较强活性，化合物2,6和13具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为22.1,24.3和14.0μM,活性为阳性药物水飞蓟宾的6-10倍；化合物1,12,14,15,19,21亦表现出一定的细胞毒活性，其IC50值分别为32.5,95.2,84.2,69.4,34.5和46.9μM，活性优于阳性药物水飞蓟宾,其余化合物具有一定的HSC-LX2细胞毒活性，浓度为400μg/mL时其抑制率在14.2-88.5％之间。
附图说明：
图1为本发明化合物1-21的结构式；
图2为本发明化合物1的X-单晶衍射结构示意图；
图3化合物13的X-单晶衍射结构示意图；
图4化合物14的X-单晶衍射结构示意图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明倍半萜类二聚体化合物，artemzhongdianolides A1-A21(1-21)及其制备方法、结构鉴定、药理作用，但不以此试验例和实施例来限定本发明。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明倍半萜类二聚体化合物，artemzhongdianolides A1-A21(1-21)的制备：
25kg中甸艾的干燥地上部分，粉碎，在室温用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，每次200升，合并乙醇提取液，减压回收有机溶剂得到粗浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到749g乙酸乙酯部分，然后将乙酸乙酯萃取部分用乙酸乙酯溶解，吸附于7.5kg硅胶(200-300目)进行硅胶柱层析，以丙酮-石油醚以v/v计，0:100,5:95,10:90,20:80,40:60,50:50和100:0为洗脱剂梯度洗脱得到Fr.A-Fr.G(155,94,117,79,163,66和52g)七个流分；流分Fr.C(117g)经过硅胶柱层析用乙酸乙酯-石油醚以v/v计，5:95、10:90和20:80洗脱得到五个流分Fr.C1-Fr.C5(10,27,37,20和16g)；流分Fr.C5经过硅胶柱层析用乙酸乙酯-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80洗脱得到3个流分C5.1-C5.3,流分Fr.C5.2经MCIgel CHP 20P柱层析，用水-甲醇10:90和0:100梯度洗脱得到流份C5.2.1-C5.2.4,流分Fr.C5.2.2经过硅胶柱层析用乙酸乙酯-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80洗脱得到五个流分C5.2.2.1-C5.2.2.5,流份C5.2.2.2经半制备液相(H2O-MeOH,35:65,3.0mL/min)得到化合物3(7mg)，流份C5.2.2.3经半制备液相(H2O-CH3CN,46:54,3.0mL/min)得到化合物10(5mg),流份C5.2.2.5经半制备液相(H2O-CH3CN,50:50,3.0mL/min)得到化合物11(6mg),流份C5.2.3经凝胶柱层析、制备液相和半制备液相(H2O-MeCN,58:42)得到化合物1(5mg),6(2mg),9(2mg)和12(3mg).流份C5.2.4经硅胶柱层析乙酸乙酯-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80洗脱得到三个流分C5.2.4.1-5.2.4.3,流份C5.2.4.2经凝胶柱层析和半制备液相(H2O-MeCN 50:50)得到化合物4(3mg)和5(2mg)，流份C5.2.4.3经半制备液相(H2O-MeOH,42:58,3.0mL/min)得到化合物2(4mg)。流份Fr.D经MCI gel CHP 20P柱层析，用水-甲醇40:60、60:40、80:20和100:0梯度洗脱得到4个流分Fr.D1-Fr.D4；Fr.D1经硅胶柱层析用丙酮-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80梯度洗脱后得到五个流份D1.1-D1.5，Fr.D1.5经硅胶柱层析用乙酸乙酯-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80梯度洗脱后得到五个流份D1.5.1-D1.5.5，流份D1.5.1经半制备液相(H2O-MeOH,60:40,3.0mL/min)得到化合物14(128mg)，流份D1.5.2经凝胶柱层析和半制备液相(H2O-MeCN 50:50)得到化合物15(12mg),18(24mg)和17(10mg)，流份D1.5.4经半制备液相(H2O-MeCN,75:25,3.0mL/min)得到化合物21(4mg)，流份D1.5.5经凝胶柱层析和半制备液相(H2O-MeCN55:45)得到化合物7(10mg),8(6mg)和20(4mg)，Fr.D3经硅胶柱层析用丙酮-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80梯度洗脱后得到五个流份D3.1-D3.5，Fr.D3.1经硅胶柱层析用丙酮-石油醚以v/v计，2:98、10:90和20:80梯度洗脱后得到五个流份D3.1.1-D3.1.5，流份D3.1.4经凝胶柱层析和半制备液相(H2O-MeCN 50:50)得到化合物13(10mg)，流份D3.1.4经半制备液相(H2O-MeCN 50:50)得到化合物16(2mg)和19(4mg).
化合物1-21的结构数据：
熔点采用
Figure BDA0003677139230000051
X-4B显微熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)测定；比旋光度由Autopol VI旋光仪(Rudolph Research Analytical,Hackettstown,USA)测定；红外光谱采用ATR衰减全反射-金刚石晶体(ATR ITX-DIAMOND)方法，通过NICOLET iS10型红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific,Madison,USA)测定；紫外光谱由UV-2401PC型紫外光谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；ECD谱由Applied Photophysics圆二色谱仪(AppliedPhotophysics,Surrey,UK)测定；核磁共振谱使用Avance III 600(Bruker,Bremerhaven,Germany)超导核磁共振仪测定，使用TMS(四甲基硅烷)作为内标；高分辨质谱采用岛津LC-MS-IT-TOF(Shimadzu,Kyoto,Japan)，安捷伦UPLC/Q-TOF和G6230质谱仪(AgilentTechnologies,Santa Clara,USA)测定；薄层层析硅胶板HSGF254购自烟台江友硅胶开发有限公司；柱层析硅胶(200～300目)为临沂市海祥化工有限公司生产；柱层析葡聚糖凝胶LH-20购自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；高效液相色谱仪购自岛津公司，控制器型号是CBM-20A，泵型号是LC-20AR，检测器型号为SPD-M20A，柱温箱型号为AT-350，色谱柱型号为Agilent-Eclipse XDB-C18(5μm,9.4×250mm)；色谱纯乙腈购自迈瑞达公司，去离子通道水通过MingCheTM-D 24UV Merk Millipore系统纯化而得；中压液相(Dr Flash-Ⅱ)为上海利穗公司产品，MCI柱日本三菱公司，型号为CHP-20P(75～150μm)；分析纯甲醇和乙腈购自天津大茂化学试剂厂；显色剂为10％H2SO4-EtOH溶液。
Figure BDA0003677139230000061
Artemzhongdianolide A1(1)
分子式：C31H38O8
分子量：538
性状：无色针晶
旋光：
Figure BDA0003677139230000063
(c 0.066,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值539.2642[M+H]+,计算值539.2639[M+H]+。
IR vmax:3441,1766,1716,1642,1458,1265,1063cm–1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
Figure BDA0003677139230000062
Artemzhongdianolide A2(2)
分子式：C31H38O8
分子量：538
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000073
(c 0.050,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值539.2626[M+H]+,计算值539.2639[M+H]+。
IR vmax:3442,1755,1705,1633,1457,1384,1082cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):197(+11.4),235(+16.4),247(–17.2),326(+2.2)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
Figure BDA0003677139230000071
Artemzhongdianolide A3(3)
分子式：C30H36O8
分子量：524
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000074
(c 0.056,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值525.2490[M+H]+,计算值525.2483[M+H]+。
IR vmax:3441,1769,1745,1706,1646,1378,1262,1212,1128cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):219(–8.0),235(+7.9),320(–2.4)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
Figure BDA0003677139230000072
Artemzhongdianolide A4(4)
分子式：C30H38O8
分子量：526
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000083
(c 0.010,甲醇)
HRESIMS(–)m/z:实验值525.2506[M–H]–,计算值525.2494[M–H]–。
IR vmax:3429,1753,1628,1457,1377,1264,1158,1064cm-1。
ECD(甲醇)λmax(Δε):197(+11.2),216(+1.6)nm。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
Figure BDA0003677139230000081
Artemzhongdianolide A5(5)
分子式：C31H40O8
分子量：540
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000084
(c 0.030,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值585.2699[M+HCOO]–,计算值585.2705[M+HCOO]–。
IR vmax:3441,1755,1633,1457,1384,1262,1085cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
Figure BDA0003677139230000082
Artemzhongdianolide A6(6)
分子式：C31H40O9
分子量：556
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000093
(c 0.10,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值557.2731[M+H]+,计算值557.2745[M+H]+。
IR vmax:3440,1765,1720,1634,1458,1383,1263,1087,872cm–1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
Figure BDA0003677139230000091
Artemzhongdianolide A7(7)
分子式：C30H38O8
分子量：526
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000094
(c 0.052,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值525.2489[M–H]–,计算值525.2494[M–H]–。
IR vmax:3434,1753,1636,1456,1380,1321,1145,994cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表1和4。
Figure BDA0003677139230000092
Artemzhongdianolide A8(8)
分子式：C30H36O8
分子量：524
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000103
(c 0.053,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值523.2328[M–H]–,计算值523.2337[M–H]–。
IR vmax:3435,1758,1713,1635,1456,1379,1264,1135cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
Figure BDA0003677139230000101
Artemzhongdianolide A9(9)
分子式：C30H36O8
分子量：524
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000104
(c 0.030,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值525.2482[M+H]+,计算值525.2483[M+H]+。
IR vmax:3433,1763,1633,1384,1262,1126,1026,892cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
Figure BDA0003677139230000102
Artemzhongdianolide A10(10)
分子式：C30H38O8
分子量：526
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000113
(c 0.020,甲醇)
HRESIMS(-)m/z:实验值527.2627[M+H]+,计算值527.2639[M+H]+。
IR vmax:3436,1751,1633,1457,1264,1157,1070cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和4。
Figure BDA0003677139230000111
Artemzhongdianolide A11(11)
分子式：C30H38O9
分子量：542
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000114
(c 0.050,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值565.2418[M+Na]+,计算值565.2408[M+Na]+。
IR vmax:3435,1751,1630,1457,1321,1264,1158,1068,852cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和5。
Figure BDA0003677139230000112
Artemzhongdianolide A12(12)
分子式：C31H40O9
分子量：556
性状：无色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000123
(c 0.102,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值579.2566[M+Na]+,计算值579.2565[M+Na]+。
IR vmax:3440,1752,1632,1457,1371,1262,1158,1048,851cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和5。
Figure BDA0003677139230000121
Artemzhongdianolide A13(13)
分子式：C30H36O6
分子量：492
性状：无色针晶
旋光：
Figure BDA0003677139230000124
(c 0.060,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值493.2591[M+H]+,计算值493.2585[M+H]+。
IR vmax:3510,1766,1703,1612,1318,1218,1125,1026cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和5。
Figure BDA0003677139230000122
Artemzhongdianolide A14(14)
分子式：C30H36O8
分子量：524
性状：无色针晶
旋光：
Figure BDA0003677139230000133
(c 0.058,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值523.2334[M–H]–,计算值523.2337[M–H]–。
IR vmax:3444,1759,1708,1644,1456,1154,1045cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表2和5。
Figure BDA0003677139230000131
Artemzhongdianolide A15(15)
分子式：C30H36O6
分子量：524
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000134
(c 0.060,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值525.2492[M+H]+,计算值525.2483[M+H]+。
IR vmax:3435,1753,1707,1455,1243,1155,1018cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
Figure BDA0003677139230000132
Artemzhongdianolide A16(16)
分子式：C31H41O9
分子量：556
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000143
(c 0.050,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值557.2751[M+H]+,计算值557.2745[M+H]+。
IR vmax:3437,1756,1630,1458,1329,1244,1037,875cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
Figure BDA0003677139230000141
Artemzhongdianolide A17(17)
分子式：C30H38O8
分子量：526
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000144
(c 0.050,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值549.2465[M+Na]+,计算值549.2459[M+Na]+。
IR vmax:3429,1749,1632,1458,1323,1155,896cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
Figure BDA0003677139230000142
Artemzhongdianolide A18(18)
分子式：C30H38O9
分子量：542
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000153
(c 0.080,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值565.2410[M+Na]+,计算值565.2408[M+Na]+。
IR vmax:3436,1747,1634,1322,1155,984,851cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
Figure BDA0003677139230000151
Artemzhongdianolide A19(19)
分子式：C31H40O9
分子量：556
性状：无色针晶
旋光：
Figure BDA0003677139230000154
(c 0.040,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值555.2594[M–H]–,计算值555.2600[M–H]–。
IR vmax:3435,1748,1630,1457,1264,1194,1079cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
Figure BDA0003677139230000152
Artemzhongdianolide A20(20)
分子式：C30H38O8
分子量：526
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000162
(c 0.044,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值549.2466[M+Na]+,计算值549.2459[M+Na]+。
IR vmax:3435,1749,1636,1455,1155,1018cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
Figure BDA0003677139230000161
Artemzhongdianolide A21(21)
分子式：C30H36O8
分子量：524
性状：白色粉末
旋光：
Figure BDA0003677139230000163
(c 0.020,甲醇)
HRESIMS(+)m/z:实验值525.2479[M+H]+,计算值525.2483[M+H]+。
IR vmax:3436,1757,1628,1321,1268,1015cm-1。
1H NMR和13C NMR(DEPT)数据见表3和5。
Figure BDA0003677139230000171
Figure BDA0003677139230000181
Figure BDA0003677139230000191
Figure BDA0003677139230000201
Figure BDA0003677139230000211
实施例2：
倍半萜类二聚体化合物，artemzhongdianolides A1-A21(1-21)对HSC-LX2的细胞毒活性。
1.材料和方法
1.1材料
人肝星状细胞系(hepatic stellate cells line LX2,HSC-LX2)购自上海纪宁生物科技有限公司；RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自Gibco BRL(NY,USA)；MTT购自广州赛国生物科技有限公司。
1.2仪器
Flex Station 3台式多功能酶标仪(Bio-RAD 680,美国)；分析天平(AG135,Metler Toledo，中国)；恒温箱(DHP-9082,上海)。
1.3实验过程
采用MTT法测定样品对HSC-LX2细胞的毒活性。HSC-LX2细胞于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。取对数期生长的细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板中，24h后将其维持液替换为含不同浓度供试样品的培养基，同时设置只加维持液的细胞对照组，并以水飞蓟宾做阳性药物对照。培养48h后，弃掉培养液并加入100μL MTT溶液(浓度为1mg/mL)；置于37℃恒温箱孵育4h，弃掉MTT溶液并加入100μL DMSO溶解甲躜晶体；最后，在490nm处用酶标仪检测每孔吸光度值。HSC-LX2细胞抑制率计算公式为抑制率(％)＝[A(空白)–A(样品)]/A(空白)×100％。其半数抑制浓度(50％inhibitory concentration,IC50)利用Graphpad Prism 5软件计算。
2.结果
对分离得到的所有化合物评价了其体外的HSC-LX2细胞毒活性(表5)。化合物1-21对肝星状细胞(HSC-LX2)的细胞毒活性均具有较强活性，化合物2,6和13具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为22.1,24.3和14.0μM,活性为阳性药物水飞蓟宾的6-10倍；化合物1,12,14,15,19,21亦表现出一定的细胞毒活性，其IC50值分别为32.5,95.2,84.2,69.4,34.5和46.9μM，活性优于阳性药物水飞蓟宾,其余化合物具有一定的HSC-LX2细胞毒活性，浓度为400μg/mL时其抑制率在14.2-88.5％之间。
表5.化合物的HSC-LX2细胞毒活性
Figure BDA0003677139230000221
Figure BDA0003677139230000231
抑制率和IC50均从三次独立的实验中得到。
3.结论
实验结果显示，化合物1-21对肝星状细胞(HSC-LX2)的细胞毒活性均具有较强活性，化合物2,6和13具有较强的细胞毒活性其IC50值分别为22.1,24.3和14.0μM,活性为阳性药物水飞蓟宾的6-10倍；化合物1,12,14,15,19,21亦表现出一定的细胞毒活性，其IC50值分别为32.5,95.2,84.2,69.4,34.5和46.9μM，活性优于阳性药物水飞蓟宾,其余化合物具有一定的HSC-LX2细胞毒活性，浓度为400μg/mL时，其抑制率在14.2-88.5％之间
以上结果表明中甸艾中倍半萜类二聚体化合物，artemzhongdianolides A1-A21(1-21)可作为药物用于制备抗肝纤维化疾病的药物。
制剂实施例1-7：
在以下制剂实施例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物1-21中的至少一种能够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定：
1.将化合物1-21中的至少一种，用DMSO溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5-5mg/mL。
2.将化合物1-21中的至少一种，用DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将化合物1-21中的至少一种，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将化合物1-21中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将化合物1-21中的至少一种，按常规口服液制备方法制成口服液。
6.将化合物1-21中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将化合物1-21中的至少一种，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
由以上实施例可知，本发明提供了一种中甸艾中化合物及其制备方法和应用，药物组合物及其应用。本发明提供的21种新的倍半萜类化合物，对人肝星状细胞HSC-LX2具有不同程度的细胞毒活性，能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备抗肝纤维化药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.如下结构式(I)所示的倍半萜二聚体化合物1-21，其为：artemzhongdianolides A1-A21(1-21)，
Figure FDA0003677139220000011
2.权利要求1所述的结构式(I)所示的倍半萜二聚体化合物1-21的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：中甸艾的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到乙酸乙酯萃取部分，然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以丙酮-石油醚以v/v计，0:100,5:95,10:90,20:80,40:60,50:50和100:0为洗脱剂，梯度洗脱得到Fr.A-Fr.G七个流分；流分Fr.C经过硅胶柱层析用乙酸乙酯-石油醚以v/v计，5:95、10:90和20:80洗脱得到五个流分Fr.C1-Fr.C5；流分Fr.C5经MCI gel CHP 20P柱层析，用水-甲醇10:90和0:100梯度洗脱和半制备HPLC制备得到化合物1,2,3,4,5,6,9,10,11,12；流分Fr.D经MCI gel CHP20P柱层析，用水-甲醇40:60、60:40、80:20和100:0梯度洗脱得到4个流分Fr.D1-Fr.D4；Fr.D1经硅胶柱层析用丙酮-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80梯度洗脱后，再经过半制备HPLC，得到化合物7,8,13,14,15,16,17,18,19,20,21。
3.权利要求1所述的结构式(I)所示的倍半萜二聚体化合物1-21在制备抗肝纤维化药物中的应用。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的结构式(I)所示的化合物1-21的至少一种和药学上可接受的载体。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
6.权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：中甸艾的干燥地上部分，粉碎，用95％乙醇冷浸提取两次，每次4天，合并乙醇提取液，减压回收乙醇浸膏，浸膏分散在水中后用乙酸乙酯萃取，随后浓缩得到乙酸乙酯萃取部分，然后将乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱层析，以丙酮-石油醚以v/v计，0:100,5:95,10:90,20:80,40:60,50:50和100:0为洗脱剂，梯度洗脱得到Fr.A-Fr.G七个流分；流分Fr.C经过硅胶柱层析用乙酸乙酯-石油醚以v/v计，5:95、10:90和20:80洗脱得到五个流分Fr.C1-Fr.C5；流分Fr.C5经MCI gel CHP 20P柱层析，用水-甲醇10:90和0:100梯度洗脱和半制备HPLC制备得到化合物1,2,3,4,5,6,9,10,11,12；流分Fr.D经MCI gel CHP 20P柱层析，用水-甲醇40:60、60:40、80:20和100:0梯度洗脱得到4个流分Fr.D1-Fr.D4；Fr.D1经硅胶柱层析用丙酮-氯仿以v/v计，2:98、10:90和20:80梯度洗脱后，再经过半制备HPLC，得到化合物7,8,13,14,15,16,17,18,19,20,21；然后取化合物1-21其中一种或其任意组合，再加上可药用载体。
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