KR20010100235A

KR20010100235A - 파네실 전이효소의 저해 활성, 세포 주기의 조절 활성 및신생혈관유도 저해 활성을 갖는 9-아세틸아테미놀라이드화합물, 이의 분리 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR20010100235A
Application number: KR1020000014469A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 손광희; 정하원; 이승호; 한미영; 강현미; 김혜경; 장수익
Original assignee: 복성해; 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-03-22
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2001-11-14
Also published as: KR100372911B1; US6387948B1

Abstract

본 발명은 그늘쑥(Artemisia sylvaticaMaximowicz)의 꽃으로부터 분리정제 된 하기 화학식 1의 신규 9-아세틸아테미놀라이드(9-Acetylarteminolide) 화합물, 이의 분리 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 그늘쑥의 꽃을 유기용매로 추출한 후 농축하고 이 농축액을 유기용매에 용해시킨 후 농축하여 실리카겔 크로마토그래피, C18 칼럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 고속 액체 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 분리 방법에 따라 얻어지며, 이 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 파네실 전이효소 저해용, 세포주기 저해용 및 신생혈관유도(angiogenesis) 저해용 약학 조성물로 사용될 수 있다.

Description

파네실 전이효소의 저해 활성, 세포 주기의 조절 활성 및 신생혈관유도 저해 활성을 갖는 9-아세틸아테미놀라이드 화합물, 이의 분리 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물{9-ACETYLARTEMINOLIDE COMPOUND HAVING ACTIVITY FOR INHIBITING FARNESYL PROTEIN TRANSFERASE, CONTROLLING CELL CYCLE AND INHIBITING ANGIOGENESIS, METHOD FOR ISOLATING SAME AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME}

본 발명은 그늘쑥(Artemisia sylvaticaMaximowicz)의 꽃으로부터 추출된 신규 9-아세틸아테미놀라이드(9-Acetylarteminolide), 이의 분리 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

문명이 발달됨에 따라 암 발생률이 증가하고 있음에도 불구하고 암 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 40 여종의 세포독성이 강한 항암 물질을 투여하는 화학 요법에 의존하고 있는 실정이며 이들 치료법조차도 대부분 초기 암 또는 특정 암에만 국한되어, 암으로 인한 사망은 계속 증가하고 있는 추세이다.

인간 암의 30정도에 관련된 라스(ras) 유전자가 발현되기 위해서는 라스 단백질(Ras protein)이 원형질막에 결합하여야 하며, 이를 위해서는 라스 단백질의 C-말단에 파네실 그룹(Farnesyl group)이 결합되어야 한다. 따라서 이 과정을 억제할 수 있으면 라스 유전자의 발현을 억제할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

라스 단백질은 세포의 성장에 관여하는 성장조절인자들의 신호전달과정에서 가장 중요한 역할을 하며 분자량이 21 kDa이고 188 내지 189개의 아미노산 잔기로 구성되며 구아닌 뉴클레오티드(GDP와 GTP)와 결합할 수 있다. 라스 단백질은 라스 전구 발암유전자(rasproto-oncogenes)에 의해 발현되는데, 이 라스 유전자는 다양한 인간 종양에서 처음 발견된 발암유전자로서 인간 악성 종양과 관련있는 것으로 알려져 있으며, 크게 하비-라스(harvey-ras,H-ras), 키스텐-라스(kirsten-ras,K-ras) 및 엔-라스(N-ras)로 분류된다.

인간에서 발견되는 암의 30이상이 라스 단백질(H-Ras, K-Ras, N-Ras)의 생물학적 활성이 비정상적으로 변화된 라스 유전자를 가지며, 특히 췌장암(90), 직장암(50), 폐암(50) 등에서 높은 빈도의 변이된 라스 유전자가 발견된다고 보고되었다(M. Barbacid,Ann. Rev. Biochem.56, 779 (1987)).

세포의 증식과 분화를 조절하는 세포내 신호전달체로서 라스 단백질은 다른G 단백질처럼 GTP와 결합된 형태(switch "on")일 때 신호전달체로 작용하며 GTP가 본래의 GTP 가수분해 활성 또는 GTP 가수분해를 돕는 단백질인 GTPase 활성화 단백질(GTPase Activating Protein, GAP)에 의해 GDP로 가수분해될 때 비활성화(switch "off")된다(G. Bollag,Ann. Rev. Cell Biol.7, 601 (1991)).

라스 단백질의 구조 및 생화학적인 연구에 의하면, 라스 단백질의 활성화 단계에는 GTP 결합 뿐만 아니라 세포막에 위치하는 것도 중요한 것으로 밝혀졌다. 즉, 라스 단백질이 신호전달체로서 작용하기 위해서는 GTP와 결합한 후 원형질막에 위치하여야 하며, 세포질 내에 위치할 경우에는 그 활성을 나타내지 못한다. 실제로 라스 단백질은 세포질에서 비활성 전구체로 생합성된 다음, C-말단이 스테로이드 생합성 과정에서 만들어지는 지질과 결합하는 "번역 후 변형 과정(post-translational modification)"을 거친 후 원형질막 표면에 부착된다.

이러한 원형질막과의 결합은 라스 단백질을 포함한 대부분의 G 단백질들에서 발견되며, 이 지질화 반응은 C-말단 시스테인 잔기에서 일어난다. 이들 단백질은 C-말단에 한 개의 시스테인 잔기, 두 개의 지방족 아미노산 잔기(aliphatic residue) 및 한 개의 카복시 말단 "X" 잔기(carboxyl-terminal "X" residue)를 포함하는 CAAX 모티프를 가진다. 이 모티프에서 "X" 아미노산은 세린, 알라닌, 메티오닌, 글루탐산 등으로 한정되며, 파네실 전이효소(farnesyl protein trasferase)에 의한 단백질 기질의 인식에 중요하다. 이 잔기의 구성에 따라 결합되는 지질과 작용하는 효소가 결정된다. 이들 지질화 반응에는 크게 파네실화 반응 (Farnesylation)과 제라닐제라닐화 반응(Geranylgeranylation)의 두 가지 형태가있으며, 라스 단백질의 경우에는 파네실화 반응이 일어나고, 세포내의 지질 결합 단백질들은 대부분 제라닐제라닐화기가 결합한다(즉, 제라닐제라닐화 반응이 파네실화 반응의 5 내지 10 배 정도로 더 많이 일어난다)(P. J. Casey,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 8323 (1989)). 이소프레닐화 반응(isoprenylation)에 참여하는 이소프레닐기는 2-아세틸-CoA로부터 시작하여 콜레스테롤을 생합성하는 이소프레노이드의 생합성 과정에서 생기는 산물이다(J. L. Goldstein and M. S. Brown,Nature, 343, 425 (1990)).

라스 단백질의 번역 후 변형 과정은, 첫 단계로 C-말단의 4번째 아미노산 잔기인 시스테인 잔기에 파네실기가 도입되고, 두 번째로 이 시스테인 잔기의 카르복시쪽 3개 아미노산 잔기가 단백질 가수분해 효소에 의해 제거되고(proteolytic cleavage), 마지막으로 C-말단에 노출된 시스테인 잔기에 메틸화 반응이 일어나는 일련의 과정이다. 이 과정을 통해 라스 단백질의 C-말단이 친유성으로 변화되어 원형질막과 강력하게 결합한다. 이러한 번역 후 변형 과정에는 파네실 전달, 펩타이드 가수분해 및 메틸화 반응 효소의 세 효소가 관여하며, 각각의 효소를 효과적으로 저해할 수 있다면 세포내 신호전달을 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 기대되며, 이러한 효소 저해제들은 새로운 항암제로 기대되고 있다. 그 이유는 변형에 의해 장시간 활성화 상태로 존재하는 라스 단백질이라도 원형질막과 결합하지 못한다면 세포의 성장과 분화에 필요한 신호를 다음 단계의 신호전달 단백질인 라프 단백질(Raf protein)로 전달하지 못하기 때문이다.

번역 후 변형 과정에 관여하는 세 효소 중 펩타이드 가수분해 효소는 아직분리 정제되지 못했으며 정확한 반응 기작도 밝혀지지 않은 상태이므로, 파네실 전이효소 및 메틸화 반응 효소의 저해제의 연구가 매우 활발하다. 특히, 라스 단백질의 파네실화 반응은 변형 과정의 첫 번째 단계이기 때문에 파네실 전이효소 저해제의 탐색이 가장 활발하다.

파네실 전이효소는 1990 년에 처음으로 쥐로부터 순수 분리된 이후 라스 단백질의 C-말단 펩타이드와 유사한 구조를 갖는 화합물들에 의해서 경쟁적으로 저해된다는 사실이 알려지면서 이 구조를 모방한 파네실 전이효소 저해제들이 합성되었다(Y. Reiss,Cell, 62, 81 (1990)). 이들 펩티도미메틱 화합물로는 머크사(Merck Co.)에서 개발한 L-731,734 및 L-731,735(N. E. Kohlet al,Science, 260, 1934, (1993)), 및 제넨테크(Genentech)사의 벤조다이아제핀 등이 있으며, 특히 벤조다이아제핀은 라스 단백질이 과발현된 세포주에서도 좋은 항암 활성을 보인다(G. L. Jameset al,Science, 260, 1937 (1993)). 또한 머크사에서 개발한 L-744,822는 누드 마우스(nud mouse)에서 라스 유전자를 이식하여 유발시킨 종양을 강력하게 억제한다고 보고된 바 있다(N. E. Kohlet al,Nature Med., 1, 792 (1995)). 이 외의 합성 저해제로는 하이드록시파니실 포스폰산(hydroxyfarnesyl phosphonic acid) 유도체 및, 미국 세링플라우사에서 개발한 트리사이클(tricyclic) 화합물인 SCH 44,342 등이 있다(W. R. Bishop,et al,J. Biol. Chem., 270, 30661 (1995)).

효소학적 방법에 의한 탐색으로 파네실 전이효소를 저해시키는 다양한 천연물 유래 화합물들이 보고되었다. 처음으로 발견된 천연물 유래의 파네실 전이효소 저해제는 식물체로부터 분리한 리모넨(limonene), 퍼릴산(perillic acid) 및 디하이드로퍼릴산(dihydroperillic acid) 등이며, 처음으로 발견된 미생물 유래 저해제로는 1992 년에 방선균으로부터 분리된 스트렙토니그린(Streptonigrin) 유도체인 10'-데스메톡시 스트렙토니그린(10'-desmethoxy streptonigrin)이다. 두 개의 디카복실산 유도체인 카에토멜산(chaetomellic acid) A와 B는 카에토멜라 아쿠티세타(Chaetomella acutiseta)의 발효액으로부터 분리되었다. 또한 스쿠알렌 합성효소(squalene synthase)의 강력한 저해제로 알려진 자라고즈산(Zaragozic acid) A와 B는 파네실 전이효소의 경쟁적 저해제이다. 이 외에도 펩티신나민 (pepticinnamins) 등이 파네실전이효소 저해제로 보고되었다(V. Manne,et al,Drug Devep. Res., 34, 121 (1995); S. Omuraet al,Drug Future, 19751 (1994); 및 J. K. Buolamwini,Curr. Opinion Chem. Biol. 3, 500 (1999)).

라스 단백질의 원형질막 결합을 저해하는 물질들은 세포내에 신호전달을 저해하는 성질을 가지고 있어 세포주기가 G2 기에서 M 기로 진행되는 것을 저해한다고 알려져 있으며, 이러한 성질은 이 물질이 단순한 독성에 의해서 항암 활성을 보이는 것이 아니라 세포내 신호전달을 저해함으로써 항암 활성을 나타냄을 증명해 준다(M. M. Feldkamo, et al.Oncogene,7514(1999)).

세포는 핵외부로부터의 신호전달과 영양상태가 양호하면 G1기에 그 크기가 커지고, 세포주기로 진입한다. 포유 세포에서의 세포 주기는 제 1 체크포인트 (Checkpoint)가 존재하는 G1 기; 게놈 및 세포질 내의 여러 인자들이 복제되는 S 기; 제 2 체크포인트로 알려져 있고 DNA 복제와 완성을 조절하며 세포의 구성에 필요한 다양한 인자들이 생산되는 G2 기; 및 세포의 실질적 분열이 일어나는 분열기인 M 기로 이루어진다. 한편, G1 기에 성장인자와 충분한 영양이 공급되지 못하면 세포주기는 멈추게되고 성장멈춤기인 Go 상태로 접어든다. 이런 일련의 과정은 한 세포가 성장하여 두 세포로 분열되기 위해서 모든 세포가 거치는 과정이므로 세포의 생명유지에 매우 중요한 과정이다. 그러므로 세포주기의 연구와 이의 조절 물질의 개발은 세포성장 기전의 연구 및 세포주기 이상으로 인해 발생하는 암의 예방 및 치료제 개발에 필수적이라 할 수 있다(K. Nasmyth,Science,274, 1643-1677 (1996)).

한편 신생혈관유도(angiogenesis)는 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로, 정상적으로는 발생(embryonic development, female reproductive cycle), 성장 및 상처 치유시 필수적일 뿐 아니라, 각종 암, 관절염, 당뇨병성 망막증, 죽상경화증 등의 질병과도 깊은 관련이 있다. 특히 신생혈관유도는 악성종양으로 발전하는 과정 중의 하나인 암 전이 과정에서 필수적이다. 이러한 신생혈관유도의 양면성으로 인해 이에 대한 연구 역시 이를 억제하는 물질과 촉진하는 (상처의 치료촉진제) 물질의 탐색으로 나뉘어 진행되고 있으며, 몇몇 억제제는 항암제로서의 활성검증을 위한 임상 시험중이다(V. Brower,Nature Biotech. 17, 963 (1999)).

1970 년대 초, 하버드 의대의 폴크만(Folkman) 박사에 의해 암세포가 신생혈관유도를 위한 특정 인자를 분비한다는 가설이 제안된 후, 폴크만 연구진을 포함한 여러 연구진은 신생혈관유도가 암세포 전이 과정에 중요한 역할을 한다고 보고하였으며, 신생혈관유도를 저해하는 신생혈관유도 인자(angiogenic factor)가 존재한다고 보고한 바 있다(J. Folkman,et al.,Science,235, 442 (1987)). 1985 년에 하버드 의대의 발리(Vallee) 박사는 인간의 결정선암세포의 분비액으로부터 분리된 신생혈관 유도인자인 안지오제닌(angiogenin)을 최초로 보고하였다. 고형암(solid tumor)은 그 주위에 유도된 새로운 혈관을 이용하여 영양분을 공급받고 노폐물을 배설함으로써 계속 성장하며 또 이 암세포가 순환기에 연결되어 폐, 간 등의 다른 부위로 전이된다고 보고되었다(L. A. Liotta,et al.,Cell,64, 327 (1991)). 또한 1994 년에 신생혈관유도 인자의 하나인 안지오스타틴(angiostatin)은 폐암 세포의 전이와 성장을 막는다고 보고되었다(M. S. O'Relly,et al.,Cell,79, 715 (1994)). 이러한 사실들은 암연구 초기에 암세포가 혐기성 호흡을 하는 것으로 이해된 것과는 달리, 암세포의 성장에는 산소와 영양소 공급이 절대적임을 보여준다. 또한 신생 혈관의 유도와 라스 단백질의 활성과 밀접한 관계가 있음이 폴크만 박사팀에 의해 보고되었다(J. Folkman, et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94, 861 (1997)).

1993 년 독일 과학자들은 콩에서 신생 혈관의 유도를 저해하는 화학물질인 제니스테인(genistein)을 분리하였는데(T. Fotsis,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2690 (1993)), 이 물질은 작은 악성 종양이 크게 자라는 것을 억제할 것으로 기대되고 있다. 또한 1995 년 미국 미네소타대학의 욱컨(Faith M. Uckun) 박사팀은 대표적인 소아암 중의 하나가 B- 세포 전구체 백혈병(BCP leukemia)이며 이 세포주를 이식한 쥐에 단일 항체와 제니스테인을 가교 결합시킨 약물을 투여한 결과 인간 B-세포 전구체 백혈병 세포가 99.999정도 소멸된다고 보고하였다(F. M.Uckun,et al.,Science,267, 886 (1995)).

따라서, 신생혈관유도 억제제(angiogenesis inhibitor)는 암의 성장 기작을 밝히는 단서가 되고, 암의 조기 진단, 예방 및 치료에 응용될 수 있을 뿐만 아니라 신생혈관유도와 관련된 질병인 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증, 혈관종 등의 질병 치료에도 광범위하게 사용될 것이다. 이런 이유로 신생혈관유도 억제제에 관한 연구가 계속되고 있다(W. Auerbach,et al.,Pharmac. Ther. 61, 265 (1994)).

따라서, 본 발명의 목적은 파네실 전이효소를 저해하는 신규 화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 분리 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 파네실 전이효소 저해용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명이 또다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 세포주기 조절용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 신생혈관유도 저해용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명의 화합물의 수소 NMR 스펙트럼이다.

도 2는 본 발명의 화합물의 탄소 NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 화합물의 COSY NMR 스펙트럼이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 9-아세틸아테미놀라이드(9-Acetylarteminolide) 화합물을 제공한다.

화학식 1

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 그늘쑥(Artemisia sylvaticaMaximowicz) 꽃을 유기용매로 추출한 후 농축하고 이 농축액을 유기용매에 용해시킨 후 농축하여 실리카겔 크로마토그래피, C18 칼럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 고속 액체 크로마토그래피를 차례로 수행하는 단계를 포함하는 상기 화합물의 분리 방법을 제공한다.

상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 유효성분으로서 상기 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 파네실 전이효소 저해용 약학 조성물을 제공한다.

상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 유효성분으로서 상기 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 세포주기 조절용 약학 조성물을 제공한다.

상기 또다른 목적에 따라, 본 발명에서는 유효성분으로 상기 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 신생혈유도 저해용 약학 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화합물은 화학식 1로 표시되는 신규 화합물로서, 본 발명자들은 이를 "9-아세틸아테미놀라이드"로 명명하였다.

본 발명의 화합물은 그늘쑥(Artemisia sylvaticaMaximowicz)의 꽃으로부터 다음과 같이 분리 정제하여 얻을 수 있다.

먼저 대한민국 중부지방에 자생하는 그늘쑥의 꽃을 분쇄한 후 유기용매 중에서 추출한 후 여과하여 액상의 추출액을 얻는다. 이때 유기용매로는 클로로포름과 아세톤의 혼합액, 메탄올, 에탄올 등을 들 수 있으며, 클로로포름과 아세톤의 혼합비는 2:1 내지 1:2이고, 바람직하게는 1:1이다. 이 추출액을 감압 농축한 후 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 유기용매에 녹이고 유기용매층을 얻는다. 이때 파네실 전이효소 저해 활성은 유기용매층에서 확인된다. 유기용매를 감암하에 농축한 후 이 농축액으로 실리카겔 크로마토그래피를 수행하는데, 예를 들어 상기 농축액을 실리카겔 칼럼에 가하여 흡착시킨 후 헥산과 에틸 아세테이트를 9:1 내지 3:7의 비율로 변화시키면서 가하여 비극성 물질을 제거한 후 클로로포름과 에탄올을 가하여 활성 물질을 부분정제한다. 얻어진 부분 정제된 활성 분획을 더욱 정제하기 위해 C18 칼럼을 이용한 크로마토그래피를 수행한다. 정제된 활성 분획으로 박막 크로마토그래피를 수행하여 여러 분획으로 분리한 후 파네실 전이효소 저해 활성이 가장 우수한 분획을 얻는다. 이 분획으로 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 본 발명의 화합물을 얻는다. 상기 고압 액체 크로마토그래피는 페노메넥스(phenomenex)사의 울트라카브(ultracarb) 10 ODS, YMC J'sphere ODS-H80 C18 칼럼 등의 칼럼을 사용하여 50 내지 70 의 메탄올과 50 내지 30 의 물로 용출시키는 것이다.

본 발명의 화합물은 파네실 전이효소 저해 활성을 가지므로, 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 파네실 전이효소 저해용 약학 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물의 파네실 전이효소에 대한 IC₅₀(50활성 저해농도) 값은 약 0.9 ng/㎖(1.8 mM)이다. 본 발명의 화합물은 라스 단백질과 같은 발암 단백질의 파네실화 반응을 저해함으로써 이 발암 단백질이 원형질 막에 부착하는 것을 방지하여 발암 단백질의 발현을 방지하므로, 이 화합물을 함유하는 본 발명의 조성물은 라스 단백질 등의 발암 단백질이 관련된 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 화합물은 세포주기에서 G2 기로부터 M 기로의 전환을 저해하는 활성을 가지므로, 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 세포주기 조절용 약학 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은 5 ㎍/㎖의 농도에서도 세포주기 조절 활성을 보인다. 따라서 본 발명의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 화합물은 신생혈관유도를 저해하는 활성을 가지므로, 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 신생혈관유도 저해용 약학 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은 10 ㎍/㎖의 농도에서도 신생혈관유도 저해 활성을 보인다. 또한 신생혈관유도 저해 활성으로 인해 암전이를 억제하므로 항암제로도 유용할 뿐만 아니라 신생혈관 형성이 관련된 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증, 혈관종 등의 예방 및 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 캅셀제, 산제, 과립, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 kg 당 2 ㎎ 내지 15 ㎎, 바람직하게는 5 mg 내지 10 mg의 양을 1회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 오래전부터 한약제로 사용되어온 그늘쑥으로부터 분리 정제된 것이므로 안전하며, 실험 동물에서도 급성 독성을 나타내지 않았다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참조예: 파네실 전이효소 저해 활성

파네실 전이효소의 효소원으로는 스프라그 다우리(Spraguo Dowley) 흰쥐(수컷, 체중 100 내지 150g)의 뇌를 적출하여 생리식염수로 세척하고 균질화한 후 이 균질액을 원심분리한 다음 큐 세파로즈 고속 칼럼(Q Sepharose Fast Flow column,Pharmacia, Co.)을 사용하여 부분정제한 것을 사용하였다.

파네실 전이효소의 활성은³H-파네실 파이로포스페이트(³H-Farnesyl pyrophosphate, FPP)를 기질로 사용하는 브로우(Blow) 등의 방법을 일부 수정하여 신틸레이션 프록시미티 분석(Scintillation Proximity Assay, SPA)하여 다음과 같이 측정하였다. 즉, 10㎕의 시료액, 10㎕의 분석용 완충용액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 25mM MgCl₂, 2mM KCl, 5mM DTT, 5mM Na₂HPO₄및 0.01Triton X-100), 20㎕의 희석된³H-FPP, 20㎕의 바이오틴-라민 B 펩티드(biotin-lamin B peptide), 40㎕의 파네실 전이효소를 잘 혼합한 후, 상온에서 30 분 동안 반응시키고, 여기에 150㎕의 SPA 구슬(Amersham, Int, UK)과 반응용액(bead/stop reagent solution)을 가한 다음 액체 섬광계수기(scintillation counter)를 이용하여 바이오틴-라민 B 펩티드의 파네실화 정도를 CPM(count per minute) 단위로 측정하였으며, 하기 수학식 1에 따라 파네실 전이효소의 저해 활성을 계산하였다.

상기 식에서, 공시료는 효소 및 저해제 시료가 없는 경우이고, 대조시료는 저해제 시료가 없는 상태에서 최적조건으로 반응시킨 후 CPM을 측정한 것이다.

실시예 1: 9-아세틸아테미놀라이드 화합물의 추출 및 분리 정제

대한민국 중부 지방에 자생하는 그늘쑥(Artemisia sylvaticaMaximowicz)의 꽃 1 kg을 잘게 분쇄한 후 여기에 클로로포름과 아세톤의 혼합액(1:1) 5 ℓ을 가하고 상온에서 48 시간 동안 방치한 다음 교반하고 여과하여 액상과 고체 부분을 분리하였다. 액상을 모아서 감압하에 농축한 후 이 농축액에 메틸렌 클로라이드 2 ℓ를 가하여 용해시켰다. 용해된 부분(유기용매층)을 합한 후 참조예의 방법에 따라 파네실 전이효소 저해 활성을 측정하여 유기용매층에 활성 물질이 포함되어 있음을 확인하였다.

활성 물질이 포함된 유기용매층을 모아 감압하에 농축한 후 메틸렌 클로라이드에 용해시킨 후 이 용액을 실리카겔 (Merck, Art No.9385)에 가하여 활성물질을 흡착시킨 다음, 헥산과 에틸 아세테이트의 비율을 9 : 1에서 3 : 7로 변화시키면서 일차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 비극성 물질들을 제거하고, 클로로포름과 메탄올의 혼합 용액(1:9)을 이용하여 용출하여 활성 분획을 분리하였다. 얻어진 활성 분획들을 합한 후 이 혼합물을 C18 컬럼에 흡착시킨 다음 메탄올과 물로 용출시켜 부분정제된 활성물질을 얻었다. 이어서 이 물질을 박막 크로마토그래피하여 여러 분획으로 나눈 후, 가장 높은 활성을 보이는 분획을 최종적으로 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)하여 본 발명의 화합물을 얻었다. 이때 HPLC 컬럼으로는 페노메넥스(phenomenex)사의 울트라카브(ultracarb) 10 ODS(250 x 21.2 mm)를 사용하였으며 활성물질은 50내지 70메탄올과 50내지 30물로 용출하였다. 이때 수율은 그늘쑥 꽃 1kg 당 30 mg이었다.

얻어진 본 발명의 화합물의 이화학적 성질은 하기 표 1과 같다.

외형(appearance)	무색 고체
분자식	C₃₂H₃₆O₈
분자량	측정치(M+H)	548.2480
분자량	계산치(M+H)	548.2410
융점 (^oC)	110
[α]_{D (in MeOH)}	-2.54
가용성	알콜, 아세톤, 클로로포름, DMSO
불용성	헥산, H₂O

얻어진 본 발명의 화합물의 파네실 전이효소 저해 활성을 참조예의 방법에 따라 측정하였으며, 그 결과 IC₅₀(50활성 저해 농도) 값이 0.9 ng/㎖(1.8 mM)이었다.

실시예 2: 9-아세틸아테미놀라이드 화합물의 구조 분석

실시예 1에서 얻은 본 발명의 화합물의 UV 흡광도를 시마주사의 UV-265 분광 광도계(Shimadzu UV-265 spectrophotometer)로 측정하였으며, IR 흡광도를 바이오-래드사의 디지랩 디비젼 FTS-80 분광 광도계(Bio-Rad Digilab Division FTS-80 spectrophotometer)로 측정하였고, 분자량 및 분자식은 VG70-SEQ 질량 분광계(mass spectrometry)를 이용하여 고해상도(High resolution) MS를 측정하여 결정하였다. 또한 핵자기공명기(Varian 300 MHz, 500 MHz NMR)를 이용하여¹H,¹³C, COSY, HMQC, HMBC, NOESY 스펙트럼을 얻었으며, 이 결과는 도 1 내지 3 및 하기 표 2에 나타내었다.

원자	δC	δH	HMBC (C→H)	COSY
1	134.46		3, 5, 6, 9, 15
2	195.11		3
3	136.60	6.20 (s)	5, 14
4	170.34		3, 5
5	52.23	3.28 (d, 9.8)	3, 7	6
6	80.48	4.06 (t, 10.4)	5, 7	5, 7
7	59.57	2.75 (t, 10.4)	9	6, 8
8	68.66	4.78 (t, 10.4)	7, 9	7, 9
9	44.84	2.50 (t, 12.4), 2.26 (m)	15	8
10	144.06		9
11	61.62		7
12	178.88		13
13	40.55	2.57 (d, 11.6), 1.90 (d, 11.6)	7
14	20.59	2.32 (s)
15	20.81	2.40 (s)
16	169.25		17
17	23.88	2.00(s)
1'	63.85		2', 3', 6', 15'
2'	132.59	5.79 (d, 5.6)	5', 6'	3'
3'	143.56	6.37(d, 5.6)	2', 14'	2'
4'	57.92		2', 3', 14'
5'	66.86	1.98 (d, 9.9)		6'
6'	79.47	4.01 (t, 10.4)	5'	5', 7'
7'	44.05	3.07 (m)	13'	6', 8'
8'	24.34	2.20 (m), 1.46 (m)		9'
9'	35.53	1.83 (m), 1.77 (m)	15'	8'
10'	73.29		9', 15'
11'	141.37		13'
12'	170.71		13'
13'	120.12	6.09 (d, 3.4), 5.38 (d, 2.9)
14'	15.18	1.55 (s)
15'	30.51	1.28 (s)
16'	61.09	4.12 (q, 7.2)	17'	17'
17'	14.88	1.23 (t, 6.5)		16'

도 1 내지 3 및 표 2의 스펙트럼 결과를 종합적으로 분석하여 화학식 1의 구조를 결정하였다.

화학식 1

본 발명자들은 이 화합물을 "9-아세틸아테미놀라이드"로 명명하였다.

실시예 3: 세포주기 조절 활성

세포주기를 분석하기 위해, 인체 유방암 세포주 MCF-7(생명공학연구소 유전자 은행)를 RPMI1640 배지(GIBCO BRL)를 이용하여 T25 플라스크(배양액 7.5㎖)에 분주하고 5CO₂/37 ℃ 배양기에서 12 시간 동안 배양하였다. 이어서, 대조군 (control)으로 사용될 세포 배양액에는 DMSO 7.5 ㎕를 가하고(최종 농도 0.1), 실험군으로 사용될 세포 배양액에는 실시예 1에서 얻은 화합물 시료를 DMSO에 5 ㎎/㎖가 되도록 녹인 용액 7.5 ㎕를 가하였다(배양액 중 DMSO 농도 0.1, 최종 시료 농도 5 ㎍/㎖). 이어서, DMSO 또는 화합물 시료가 처리된 MCF-7 세포주를 5CO₂/37 ℃ 배양기에서 각기 12, 24 및 36 시간 동안 배양한 후 세포주기 분석에 사용하였다.

세포주기 조절 활성을 검색하기 위해, 세포 배양액이 포함된 배양 플라스크에 트립신을 처리하여 세포를 분리한 후, 200xg에서 5 분 동안 원심분리하여 세포를 침전시키고 이 세포 침전물을 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 이 세포에 70에탄올 3 ㎖를 가하고 -20 ℃에서 12 시간 동안 처리하여 세포를 고정시켰다. 이어서 이를 200xg에서 5 분 동안 원심분리하여 세포를 침전시키고 세포 침전물을 다시 PBS로 2회 세척하여 잔여 에탄올을 제거하였다. 세포 침전물에 1㎖의 PBS를 가하여 혼합한 후, 100 ㎍/㎖의 RNase A 용액 50 ㎕를 가하고 37 ℃에서 30 분 동안 반응시킨 다음 1 ㎎/㎖의 요오드 프로피디움(propidium iodide)이 포함된 PBS 10㎕를 가하여 세포를 염색하였다.

염색된 20,000 개 세포의 세포 주기를 Becton-Dickinson FACS calibur (Becton-Dickinson, CA)를 이용하여 분석하였고, Becton-Dickinson Modifit 세포주기 분석 프로그램을 이용하여 세포주기 G1, S, G2+M 기의 세포를 백분율로 계산하였다.

그 결과, G2+M 기의 세포가 50 정도 증가하여 본 발명의 화합물이 세포주 MCF7에서 G2 기로부터 M 기로의 전환을 저해함을 확인하였다.

실시예 4: 신생혈관유도 저해 활성

신생혈관유도 저해 활성은 혈관 형성을 직접 육안으로 확인할 수 있는 수정란의 융모막(chorioallantoic membrane, CAM)을 이용한 CAM 분석법에 따라 다음과 같이 조사하였다.

실험에 사용될 수정란을 풀무원(주)에서 구입하였으며, 시료의 처리를 위한 써마녹스 커버슬립(Thermanox coverslips)은 눈크(Nunc)사에서, 관찰에 필요한 10인트라리포즈(Intralipose, 지방 에멀젼)와 1 ㎖ 및 5㎖ 주사기는 녹십자사에서 각각 구입하였다. 수정란을 부화시키기 위해 90이상의 습도를 유지하는 배양기(Incubator)를 사용하였으며, 수정란의 감염을 방지하기 위해 모든 조작을 클린 벤취(Clean bench)에서 수행하였고, 결과의 관찰 및 촬영을 위해 카메라가 장착된 해부현미경을 사용하였다.

(단계 1) 1일째(0일배)

수정란을 배양기에서 부화시켰다. 이때, 배양기의 온도는 37 내지 38 ℃로, 습도는 90이상 유지하였다. 여기에서 0일배는 수정란이 산란된 후 18 ℃에서 3 내지 4 일 이내로 보관된 것을 말한다.

(단계 2) 3일째(2일배)

수정란의 뾰족한 끝 부분에 칼로 흠을 낸 후, 수평으로 뉘어 놓고 5 ㎖의 주사기로 구멍을 낸 다음 알부민을 2 ㎖ 정도의 양으로 뽑아내었다. 수정란이 건조 및 감염되지 않도록 구멍을 유리 테이프로 봉한 후 구멍이 아래로 향하도록 위치시키고 다시 배양하였다.

(단계 3) 4일째(3일배)

수정란의 기낭(air sac)쪽(주사기 구멍의 반대 쪽)에 직경 2 내지 3 ㎝ 크기의 원형 창(window)을 내고, 수정란으로 확인된 것만 넓은 유리 테이프로 막은 후 다시 배양하였다. 이때, 원형 창은 날카로운 칼로 수정란의 껍질 위에 원형으로 흠을 낸 뒤 핀셋으로 껍질을 뜯어내어 만들었으며, 껍질가루가 안쪽으로 떨어지지 않도록 주의하였다. 3일배는 창을 냈을 때 십자가형의 가는 혈관이 보인다.

(단계 4) 5일째(4.5일배)

이 시기에는 직경이 2 내지 5 ㎜ 정도인 CAM이 생성된다. 실시예 1에서 얻은 화합물 시료를 적당한 용매(증류수, 에탄올 등)에 녹인 다음 이 용액 10㎕씩을 4 등분된 써마녹스 커버슬립위에 떨어뜨리고 클린 벤취안에서 건조시킨 후 가위로 4 등분하여 자른 다음 클린 벤취의 자외선 하에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 수정란에 부착된 유리 테이프를 칼로 뜯어낸 후 CAM 위에 시료가 처리된 써마녹스 커버슬립을 핀셋으로 집어 뒤집어 조심스럽게 올려놓은 다음 유리 테이프로 막았다. 이 때 가위, 칼, 핀셋 등은 70에탄올로 소독하여 사용하였으며, 핀셋은 시료가 처리된 써마녹스 커버슬립을 로딩할 때마다 소독하여 사용하였다.

(단계 5) 7일째(6.5일배)

수정란에 부착된 유리 테이프를 칼로 뜯어내었다. 주사기로 인트라리포즈(지방 에멀젼) 1 ㎖를 취하고 기포를 제거한 뒤, 수정란의 CAM의 바로 아래 부분에 주입하여 신생혈관의 형성 여부를 관찰하였다. 이때 흰색 바탕에 뚜렷한 혈관을 관찰할 수 있으며, 인트라리포즈의 주입시 혈관이 다치지 않도록 주의하였다. 신생혈관유도의 저해도는 하기 수학식 2에 따라 결정하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물의 신생혈관유도 저해활성 농도는 10 ㎍/㎖이었으며, 이 농도에서 신생혈관유도 저해도는 60 이었다.

본 발명의 화합물은 그늘쑥으로부터 분리 정제된 신규 화합물로서, 파네실 전이효소를 저해하고 세포 주기를 조절하며 신생혈관 유도를 저해함으로써, 이와 관련된 질병, 예를 들어 암, 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증, 혈관종 등의 예방 및 치료에 유용하다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 9-아세틸아테미놀라이드(9-Acetylarteminolide) 화합물.

화학식 1
그늘쑥(Artemisia sylvaticaMaximowicz) 꽃을 유기용매로 추출한 후 농축하고 이 농축액을 유기용매에 용해시킨 후 농축하여 실리카겔 크로마토그래피, C18 칼럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 고속 액체 크로마토그래피를 차례로 수행하는 단계를 포함하는 제 1 항의 화합물의 분리 방법.
제 1 항의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 파네실 전이효소 저해용 약학 조성물.
제 3 항에 있어서,

암의 예방 및 치료에 사용되는 약학 조성물.
제 1 항의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 세포주기 조절용 약학 조성물.
제 5 항에 있어서,

암의 예방 및 치료에 사용되는 약학 조성물.
제 1 항의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 신생혈관유도 억제용 약학 조성물.
제 7 항에 있어서,

암, 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증 및 혈관종의 예방 및 치료에 사용되는 약학 조성물.