KR100445334B1 - 그늘쑥의 잎으로부터 유파티린과 자세오시딘의 추출방법및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 그늘쑥의 잎으로부터 분리정제 된 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)의 추출방법 및 이를 함유하는 약학조성물에 관한 것으로, 그늘쑥을 메탄올로 추출하고, 상기 추출액을 농축하여 실리카겔 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 고속 액체 크로마토그래피로 정제하여 상기의 플라본들을 분리 정제하였으며, 상기 단일성분으로 분리된 화합물은 각종 기기 분석을 통하여 그 구조식을 확립하여, 이들 화합물을 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)으로 확인하였으며, 이 화합물은 라스 발암유전자 활성화에 필수적인 효소인 파네실 전달효소의 활성 및 신생혈관형성(angiogenesis)을 저해함으로 발암유전자 발현억제제, 항암제, 암전이 억제, 당뇨병성 망막증, 각막이식시 생기는 신생혈관에 의한 실명 예방제로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

그늘쑥의 잎으로부터 유파티린과 자세오시딘의 추출방법 및 이를 함유하는 조성물{Method of Extracting Eupatilin and Jaceosidin from Artemisia Sylvatica Maximowicz and Composition containing the same}
본 발명은 그늘쑥의 잎으로부터 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘 (jaceosidin)의 추출방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 본 발명은 그늘쑥의 잎으로부터 파네실 전달 효소(Farnesyl Protein Transferase)의 활성 및 신생혈관 형성 유도(Angiogenesis)를 저해하는 물질인 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)의 분리, 정제하는 방법 및 이를 함유하는 발암유전자 발현억제제, 암전이 억제제, 당뇨병성 망막증, 각막이식시 생기는 신생혈관에 의한 실명 예방제에 관한 것이다.
암의 발생률은 문명이 발달됨에 따라 증가되고 있음에도 불구하고 암환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 40여종의 강한 세포독성을 보이는 항암물질 투여에 의한 화학요법에 의존하고 있는 상태이다. 이들 치료법도 대부분 조기 암환자나 특정 암에만 국한되어 암으로 인한 사망은 계속 증가하고 있는 추세이다.
인간 암의 30% 정도와 관계가 있는 라스(ras) 암 유전자가 발현되기 위해서는 라스 단백질(Ras protein)이 원형질막에 결합하여야 하며, 이를 위해서는 라스 단백질의 C-말단에 파네실 그룹(Farnesyl group)이 결합되어야한다. 만일 이 과정을 억제할 수 있으면, 상기 유전자의 발현을 억제할 수 있을 것으로 기대되어 이를 통한 새로운 항암제 개발 노력이 진행되고 있다.
세포의 성장에 관여하는 성장조절인자들의 신호전달과정에서 가장 중요한 역할을 하는 단백질은 분자량이 21kDa이며 188-189개의 아미노산으로 구성된 라스 단백질로서 구아닌 뉴클레오티드(guanine nucleotides) (GDP와 GTP)와 결합할 수 있다. 라스 단백질은 라스 프로토-온코진(rasproto-oncogenes)(전구발암유전자)에 의해서 발현되고 라스 진(rasgene)은 다양한 사람의 종양에서 온코제닉 진(oncogenic gene)(발암유전자)으로서 처음 발견된 유전자이며 사람의 악성종양과 관련이 있다고 알려져 있다. 이 유전자는 크게 할베이-라스(harvey-ras(H-ras)), 컬스텐-라스(kirsten-ras(K-ras)), 그리고 N-라스(N-ras)로 분류된다. 사람에서 발견되는 대부분의 암에서 30%이상이 라스 단백질 (H-Ras, K-Ras, N-Ras)의 생물학적 활성이 비정상적으로 변화된 라스 진(rasgene)을 갖고 있다는 것이 증명되었으며, 특히 췌장암(90%), 직장암(50%), 폐암(50%)등은 높은 빈도로 변이된 라스 진(rasgene)을 갖고 있음이 확인되었다(M. Barbacid,Ann. Rev. Biochem. 56, 779,1987). 라스 단백질은 세포의 증식과 분화를 조절하는 세포내 신호전달체이며, 많은 G 단백질과 마찬가지로 라스 단백질도 GTP와 결합된 형태(switch "on")일 때 신호전달체로 작용하며 GTP가 본래의 GTP 가수분해 활성 또는 GTP 가수분해를 돕는 단백질인 GAP(GTPase Activating Protein)에 의해서 GDP로 가수분해될 때 비활성화(switch "off")된다(G. Bollag,Ann. Rev. Cell Biol. 7, 601,1991). 라스 단백질의 구조 및 생화학적인 연구에서 라스 단백질의 활성화단계에는 GTP 결합뿐만 아니라, 라스 단백질이 세포막에 위치하는 것이 중요하다는 것이 밝혀졌다. 라스 단백질이 신호전달매체로서의 기능을 하기 위해서는 GTP와 결합한 후 원형질막에 위치하여야 하며, 이 막에 위치하지 못하고 세포질 내에 있을 때는 그 활성을 나타내지 못한다는 것이다. 즉, 라스가 생물학적인 활성을 나타내기 위해서는 C-말단이 번형된 후, 원형질막의 원형질막 표면에 부착되어 있어야 한다. 이를 위해서는 라스가 세포질에서 비활성의 전구체로써 생합성된 다음 스테로이드 생합성과정에서 생성되는 지질과 결합하여야하며, 이러한 일련의 반응을 "번역 후 변형과정(post-translational modification)"이라 한다. 이러한 신호전달 단백질들의 원형질막과의 결합은 라스 단백질을 포함한 대부분의 G 단백질(protein)들에서 발견되며 이 지질화 반응은 C-말단에 있는 시스테인 잔기에서 일어난다. 이들 단백질은 C-말단에 한 개의 시스테인과 두 개의 지방족 레지듀(aliphaticresidue), 그리고 한 개의 카르복실-터미널 "X" 레지듀(carboxyl-terminal "X" residue)를 포함하는 CAAX 모티프(motif)를 가지고 있다. "X" 위치의 아미노산은 Ser, Ala, Met, Glu 등으로 한정되어 있고, 파네실 전달 효소가 단백질 기질를 인식하는데 중요한 잔기이다. 이 잔기의 구성에 따라서 결합되는 지질과 작용하는 효소가 결정된다. 이들 지질화 반응에는 크게 파네실화 반응(Farnesylation)과 제라닐제라닐화 반응(Geranylgeranylation)의 두 가지 형태가 있으며, 라스 단백질의 경우에는 파네실화 반응(farnesylation)이 일어나고, 세포내의 지질 결합 단백질들은 대부분 제라닐제라닐기(geranylgeranyl group)가 결합한다(즉, geranylgeranylation이 5-10배 정도 더 많이 일어난다)(P. J. Casey,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86, 8323, 1989). 이소프레닐화 반응(Isoprenylation)에 참여하는 이소프레닐기(isoprenyl group)는 2-아세틸-CoA(2-acetyl-CoA)로부터 시작하여 콜레스테롤(cholesterol)을 생합성하는 이소프레노이드(isoprenoid)의 생합성과정에서 생기는 산물이다(J. L. Goldstein and M. S. Brown,Nature,343, 425, 1990).
라스 단백질의 원형질막 결합에 필수적인 번역 후 변형 과정을 요약해보면 첫 단계로 파네실기가 카르복시 말단에서 4번째 위치의 시스테인에 도입되고, 두 번째로 시스테인의 카르복시쪽 3개 아미노산들이 단백질 가수분해 효소의 작용으로 떨어져 나가고(proteolytic cleavage), 마지막으로 카르복시 말단으로 노출된 시스테인에 메틸화 반응이 일어나는 일련의 과정이다. 이 과정을 통하여 라스 단백질의 C-말단은 친유성인 성질로 변화되어 원형질막과 강력하게 결합된다. 이 C-말단의 지질은 세포내 신호전달 과정에서 마치 전선을 지지해주는 전주와 같은 역할을 하게 되는 것이다. 이 번역 후 변형과정에는 3가지의 효소, 즉 파네실 전달, 펩타이드 가수분해, 그리고 메칠화 반응 효소가 관여하며, 각각의 효소를 효과적으로 저해할 수 있다면 전선에서 전주를 제거하는 것과 같아 세포내 신호전달을 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 기대되며 이는 곧 새로운 항암제의 개발 가능성을 시사해 주는 것이다. 그 이유는 변형에 의해서 장시간 활성화 상태로 존재하는 라스 단백질이라도 원형질막과 결합하지 못한다면 세포성장과 분화에 필요한 신호를 다음 단계의 신호전달 단백질인 라프단백질(Raf protein)로 전달하지 못하기 때문이다.
이들 효소중 펩타이드 가수분해 효소는 아직 분리 정제되지 못했으며 정확한 반응 기작도 밝혀지지 않은 상태이고, 파네실 전달 그리고 메칠화 반응 효소의 저해제개발을 위한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다. 그러나, 라스의 변형과정중 파네실화 반응이 첫 번째 단계이기 때문에 파네실 전달효소의 저해제 탐색을 통한 항암제 개발 연구가 가장 활발히 진행되고 있다.
1990년 처음으로 쥐로부터 순수 분리된 파네실 전달 효소가 라스의 C-말단의 펩타이드와 유사한 구조를 갖고 있는 화합물들에 의해서 경쟁적으로 저해된다는 사실이 알려지면서, 이들 구조를 모방한 저해제들이 합성되기 시작하였다(Y. Reiss,Cell,62, 81, 1990). 이들 펩티도미메틱 화합물 중에서 멀크사(Merck Co.) 연구소에서 개발한 L-731,734와 L-731,735(N. E. Kohlet al,Science,260, 1934, 1993), 그리고 제네텍(Genentech)사의 벤조다이아제핀등은 라스가 과발현된 세포주에서도 좋은 활성을 보여준다고 발표되었다(G. L. Jameset al,Science,260, 1937, 1993). 그리고 멀크사(Merck Co.) 연구소에서 개발한 L-744,822는 누드마우스(nude mouse)에 라스 발암유전자를 이식하여 유발시킨 종양을 강력하게 억제시킨다는 것이 발표된 바 있다(N. E. Kohlet al,Nature Med.,1, 792, 1995). 이들 이외의 합성저해제로는 히드록시파네실 포스폰산(hydroxyfarnesyl phosphonic acid) 유도체 및 미국 세링플라우사에서 발표한 트리사이클릭(tricyclic) 화합물인 SCH 44,342등이 있다(W. R. Bishop,et al,J. Biol. Chem.,270, 30661, 1995).
효소학적인 방법에 의한 많은 시료의 탐색으로 파네실 전달 효소를 저해시키는 다양한 천연물 유래 화합물들이 발표되었다. 처음으로 발견된 천연물 유래 저해제는 식물체로부터 분리한 리모닌(limonene), 페릴릭(perillic), 디히드로페릭산(dihydroperillic acid) 등이며, 미생물 유래 저해제는 1992년에 방선균으로부터 분리한 스트렙도니그린(Streptonigrin)의 유도체인 10'-데스메톡시 스트렙토니그린(10'-desmethoxy streptonigrin)이 최초의 저해제이다. 두개의 새로운 디카르복시산(dicarboxylic acid) 유도체 케토멜릭산(chaetomellic acid) A와 케토멜릭산(chaetomellic acid) B는 케토멜라 어큐티세타(Chaetomella acutiseta)의 발효액으로부터 분리되어 졌다. 자라조즈산(Zaragozic acid) A와 B는 스쿠알렌 합성효소(squalene synthase)의 강력한 저해제로 보고되었던 화합물이며 이들 물질이 파네실 전달효소에 경쟁적 저해제라는 것이 확인되었다. 이들 이외에도 펩티시나민(pepticinnamins) 등이 파네실전달효소 저해제로 발표되었다(V. Manne,et al,Drug Devep. Res.,34, 121, 1995, S. Omuraet al,Drug Future,19, 751, 1994,J. K. Buolamwini, Curr. Opinion Chem. Biol. 3, 500, 1999).
1970년대 초 하버드의대의 폴크만(Folkman)박사에 의해 암세포가 신생혈관을 유도하기 위해서 특정인자를 분비한다는 가설이 제안되었으며, 이후 폴크만(Folkman) 연구그룹을 포함하는 여러 연구 팀의 노력으로 이러한 암세포 전이과정에 혈관형성(angiogenesis) (신생 혈관 유도)가 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀지고, 혈관형성(angiogenesis)을 저해하는 혈관형성인자(angiogenic factor)의 존재도 밝혀졌다(J. Folkman,et al., Science, 235, 442, 1987). 1985년도에는 하버드의대의 발리(Vallee) 박사 팀에 의해 신생혈관 유도인자, 엔지오게닌(angiogenin)이 인간의 결정선암세포의 분비액으로부터 최초로 발견되었다. 그리고 고형암(solid tumor)은 자기 주위로 유도된 새로운 혈관을 이용하여 영양분을 공급받고 노폐물을 배설함으로써, 계속 성장할 수 있고 또 이 암세포가 순환기에 연결되어 폐, 간 등의 다른 부위로 암이 전이된다는 사실도 밝혀지게 되었다(L. A. Liotta,et al., Cell, 64, 327, 1991). 그리고 혈관형성인자(angiogenic factor) 중의 하나인 엔지오스테틴(angiostatin)은 폐암세포의 전이와 성장을 막는다는 것이 1994년에 발표되었다( M. S. O'Relly,et al., Cell, 79, 715, 1994). 이와 같은 사실들은 암연구의 초기에는 암세포는 혐기성 호흡을 하는 조직으로서 이해되기도 한 것과는 달리, 암세포의 성장에는 산소와 영양소 공급이 절대적이라는 것을 보여주는 것이다. 그리고 신생 혈관의 유도와 라스 단백질의 활성과 밀접한 관계가 있음이 제이. 폴크맨(J. Folkman) 박사팀에 의해서 밝혀졌다(J. Folkman, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 861,1997).
1993년 독일 과학자들은 신생 혈관의 유도를 저해하는 화학물질을 콩에서 분리하였다고 발표하였다(T. Fotsis,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2690, 1993). 이 물질은 게니스테인(genistein)이라고 명명되었는데, 작은 악성종양이 크게 자라는 것을 억제할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 일본인의 경우, 콩을 많이 섭취하므로 프로스테트(prostate cancer)를 갖는 빈도가 서구인에 비해 매우 낮다. 그러나 일본인이 서구로 이민간 후 단 몇 년 동안이라도 콩을 많이 먹지 않으면, 프로스테트(prostate cancer)를 갖는 빈도가 급격히 증가한다고 보고되고 있다. 그리고 1995년, 미국 미네소타대학의 훼이스 엠. 욱쿤(Faith M. Uckun)박사 팀은 인간 BCP 백혈병 세포(leukemia cell)을 이식한 쥐에 단일항체에 게니스테인(genistein)을 가교 결합시킨 약을 투여한 결과 놀랍게도 인간 BCP 백혈병 세포(leukemia cell)이 99.999% 정도 소멸됨을 보고하였다(F. M. Uckun,et al.,Science, 267, 886 (1995).
그러므로 새로운 혈관형성억제물질 (angiogenesis inhibitor)의 발견은 암의 성장기작을 밝히는 단서가 되고, 암의 조기진단 및 예방, 치료에 응용될 수 있을 뿐만 아니라 혈관형성(angiogenesis)와 관련된 질병인 류마티스성 관절염, 만성염증, 당뇨병성 망막증, 혈관종 등의 질병 치료에도 광범위하게 사용될 것이다. 이런 이유로 인해, 그 동안 학계 및 산업계는 이것에 대해 계속적으로 관심을 두고 연구 및 개발에 노력을 하고 있다(W. Auerbach,et al., Pharmac. Ther. 61, 265, 1994).
따라서, 본 발명의 목적은 그늘쑥의 잎으로부터 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)을 추출하여 이를 함유하는 발암유전자 발현억제제, 암전이 억제제와 같은 암 유전자 발현억제 약학조성물을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 다른 목적은 그늘쑥의 잎으로부터 파네실 전달효소의 활성 및 신생혈관 형성유도를 저해하는 물질인 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)의 분리, 정제하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 상기 목적은 그늘쑥을 메탄올로 추출하고, 상기 추출액을 농축하여 실리카겔 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 고속 액체 크로마토그래피로 정제하여 상기의 플라본들을 분리 정제하였으며, 상기 단일성분으로 분리된 화합물은 각종 기기 분석을 통하여 그 구조식을 확립하여, 이들 화합물을 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)으로 확인하였으며, 이 화합물은 라스 발암유전자 활성화에 필수적인 효소인 파네실 전달효소의 활성 및 신생혈관유도현상(angiogenesis)을 저해함으로 발암유전자 발현억제제, 항암제, 암전이 억제, 당뇨병성 망막증, 각막이식시 생기는 신생혈관에 의한 실명 예방제를 제공함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 본 발명의 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)의 화학구조를 나타낸 구조식이다.
도 2는 유파티린(eupatilin)의 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 3은 자세오시딘(jaceosidin)의 NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 그늘쑥 (Artemisia sylvaticaMaximowicz)의 잎으로부터 분리, 정제된 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)의 추출방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이들 화합물은 라스 발암유전자 발현에 필수적인 효소인 파네실 전달효소의 활성 그리고 신생혈관유도를 억제하는 활성 등을 저해함으로 발암유전자 발현억제제, 암전이억제 등의 항암제로서 뿐만 아니라 당뇨성 망막증 치료제로도 개발 가능한 유용한 선도물질이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1의 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)을 제공한다.
상기 식에서, R = CH3(eupatilin), R = H (jaceosidin)
본 발명에 그늘쑥의 잎으로부터 분리 정제된, 파네실전달 효소 억제, 세포주기 조절 그리고 신생혈관 형성 유도 억제 활성을 갖는 상기 화학식 1의 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)로 확인하였다.
파네실 전달 효소 억제, 세포주기 조절 그리고 신생혈관 유도현상 억제활성을 갖는 상기 구조식(I)의 프라보노이드를 약용 그늘쑥의 잎을 메탄올로 추출한 후 활성을 검증한 결과 활성을 보여 주었다. 농축액을 실리카젤 크로마토 그래프를 포함하는 다양한 컬럼크로마토법으로 분리하고 최종적으로 HPLC를 이용하여 활성을 보여주는 화합물 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)을 분리 정제 하였다.
상기의 방법으로 확보한 저해제를 쥐의 뇌로부터 분리한 효소와 파네실파이로포스페이트를 이용하여 활성을 측정한 결과 IC50(50% 활성 저해농도) 값이 50-100 microM 이었다.
수정란의 융모막(chorioallantoic membrane, CAM)을 이용하여 혈관형성을 직접 육안으로 확인할 수 있는 CAM assay법으로 상기의 화합물을 대상으로 신생혈관 형성(angiogenesis) 저해정도를 측정한 결과 10 ㎍/ml 농도에서 30-50% 신생혈관 형성을 저해하였다.
본 발명의 플라보노이드는 파네실전달 효소 저해 그리고 신생혈관형성(angiogenesis) 저해 활성을 가지므로, 발암유전자 억제제를 통한 항암제, 암전이 억제제, 그리고 당뇨성 망막증의 예방제 등으로 이용될 수 있다.
이상과 같이 쑥의 꽃으로부터 분리 정제된 플라보노이드는 통상적인 방법에 의해 정제하여, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형 제제로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 플라보노이드들을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 kg당 10 mg 내지 30 mg의 양을 1회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시에 의하여 보다 상세히 설명하고자 한다.
실시예 1 : 플라본들의 추출 및 분리 정제법
본 발명에 사용한 그늘쑥의 잎은 대한민국 중부지방에 자생하는 것을 채취하여 사용하였다. 2 kg의 잎을 잘게 분쇄하여 10L의 메탄올을 넣어 상온에서 48시간 방치한 후 교반하여 여과지를 이용 액상과 고체부분을 분리하였다. 액상을 모아서 감압하에서 농축한 후 2L의 메탄올을 가하여 용해되는 부분만을 모아서 파네실전달 효소 저해 활성을 측정한 결과 활성물질이 함유되어 있음을 확인하였다. 활성물질을 함유하고 있는 유기용매층을 모아 감압하에 농축 하였다. 실리카겔 (Merck, Art No.9385)에 메칠렌클로라이드에 녹인 활성물질을 흡착시킨 후 메칠렌클로라이드와 메탄올의 비율을 99 : 1에서 95 : 5로 변화시키면서 일차 실리카겔 컬럼 크로마토 그래프하여 활성분획을 분리하였다. 분리된 활성 혼합물을 C18 컬럼에 흡착시킨 후 메탄올과 물로 용출시켜서 부분정제한 활성 물질을 얻었다. 이 활성성분 함유 물질을 박막 크로마토 그래프로 몇가지의 분획으로 나눈 후 가장 좋은 활성을 보이는 분획을 최종적으로 HPLC를 이용하여 순수한 화합물 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)을 정제하였다. 이때 HPLC 컬럼으로는 페노메넥스(phenomenex)사의 화합물 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)을 울트라카브(ultracarb) 10 ODS(250 x 21.2 mm)를 사용하였으며, 활성물질들은 50%-70% 메탄올과 50%-30% 물로 용출시켰다. 최종적으로 순수한 화합물 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)을 잎 2kg 당 각각 100 mg 과 20mg의 수율로 얻었다.
유파티린(Eupatilin)의 이화학적 성질을 표 1에 나타내었고, 자세오시딘(Jaceosidin)의 이화학적 성질을 표 2에 나타내었다.
외형(appearance) 옆은 노란색
분자식 C18H16O7
분자량 344
융점(℃) 233
가용성 Alcohols, DMSO
불용성 Hexane, H2O
외형(appearance) 옆은 노란색
분자식 C17H14O7
분자량 330
융점(℃) 223
가용성 알코올, DMSO
불용성 헥산, H2O
실시예 2 : 활성저해물질의 구조분석
UV 흡광도 분석은 시마쥬(Shimadzu) UV-265 스펙트로포토미터(spectrophotometer)로 측정하였으며, IR 흡광도는 바이오-라드 디지랩 디비존 FTS-80 스펙트로포미터(Bio-Rad Digilab Division FTS-80 spectrophometer)로 측정하였고, VG70-SEQ 매스 스펙트로메트리(mass spectrometry)를 이용하여 하이 레졸루션(High resolution) MS를 측정하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한 핵자기공명기(Varian 300 MHz, 500 MHz NMR)를 이용하여1H,13C, Cosy, HMQC, HMBC, NOESY spectrum을 얻었으며, 이들 스펙트라(spectra)를 종합적으로 분석하여 구조를 결정하였다.
실시예 4 : 파네실 단백질 전달효소 저해활성 검색
파네실 단백질 전달효소의 효소원으로는 흰쥐(male Spraguo Dowley 100 - 150g)의 뇌를 분리하여 생리식염수로 세척하고 균질화한 후 이 균질액을 원심분리와 큐 세파로제 훼스트 플로우 컬럼(Q Sepharose Fast Flow column)을 이용하여 부분정제하여 사용하였다.
또한, 효소의 활성은3H-파네실 파이로포스페이트(3H-Farnesyl pyrophosphate, FPP)를 기질로 하여 신틸레이션 프록시미티 에세이(Scintillation Proximity Assay, SPA) 방법을 이용하여 측정하였다.
즉, FPP를 기질로하여 브로우(Blow) 등의 방법을 일부 수정하여 사용하였는데, 10㎕ 시료액, 10㎕ assay 완충용액(50mM Tris-HCL pH 7.5, 25mM MgCl2, 2mM KCL, 5mM DTT, 5mM Na2HPO4, 0.01% Triton X-100), 20㎕ 희석된3H-FPP, 20㎕ biotin-lamin B peptide, 40㎕ 파네실 단백질 전달효소를 잘 섞은 후, 상온에서 30분간 반응시키고 150㎕의 SPA 구슬과 반응용액(bead/stop reagent solution)를 가한 다음 액체 섬광계수기(scintillation counter)를 이용하여 biotin lamin B peptide에 파네실화 정도를 CPM(count per minute)단위로 측정하여 파네실 단백질 전달효소의 저해활성을 다음과 같이 계산하였다.
CPM(시료) - CPM(공시료)
활성저해도(%) = 100 ×[ 1 - -------------------------------- ]
CPM(대조용시료) - CPM(공시료)
상기 식에서, 공시료는 효소 및 저해제 시료가 없는 경우이고, 대조시료는 저해제 시료가 없는 상태에서 최적조건으로 반응시킨 후 CPM을 측정한 것이다.
실시예 5 : Angiogenesis 저해 활성 검색
수정란은 풀무원(주)에서 구입했다. 시료 로딩(loading)을 위한 더마녹스 커버슬립(Thermanox coverslips)은 넌크(Nunc)사에서, 관찰시 필요한 10% 인트라리포즈(Intralipose)(fat emulsion)와 1mL, 5mL syringe는 녹십자사에서 각각 구입했다. 필요한 실험기자재는 수정란을 부화시키기 위해 습도를 90%이상 유지시켜 줄 수 있는 배양기(Incubator), 수정란의 감염을 방지하기 위한 깨끗한 벤치(Clean bench), 그리고 결과의 관찰 및 촬영을 위해서 필요한 카메라가 장착된 해부현미경이다.
실험단계
1일째(0일배): 수정란을 배양기(incubator)에서 부화시킨다. 이때 배양기(incubator)의 온도는 37-38℃로, 습도는 90%이상 유지되도록 수시로 확인한다. 여기에서 0일배란 수정란이 산란되어 18℃에서 보관된지 3-4일 이내의 것을 말한다.
3일째(2일배) : 수정란의 뾰족한 끝 부분에 칼로 흠을 낸다. 이후, 수평으로 뉘어 놓고 5mL 주사기(syringe)로 구멍을 낸 다음 알부민(albumin)을 2mL 정도 뽑아낸다. 수정란이 건조되지 않고 또 감염되지 않도록 구멍을 유리 테잎으로 봉한 후 구멍이 아래로 향하도록 놓고 다시 배양(incubation)시킨다.
4일쩨(3일배) : 수정란의 기낭(air sac)이 있는 쪽(주사기 구멍의 반대 쪽)으로 직경 2-3cm크기의 원형 창(window)을 내고 수정란으로 확인된 것만 넓은 유리 테잎으로 막고 다시 배양(incubation)시킨다. 참고로, 원형 창(window)을 내는 방법은 날카로운 칼로 수정란의 껍질 위에 원형으로 흠을 낸 뒤 핀셋으로 껍질을 뜯어낸다. 이 때 껍질가루가 안쪽으로 떨어지지 않도록 주의한다. 수정란이란 창(window)를 냈을 때 십자가형의 가는 혈관이 보이는 것을 의미한다.
5일째(4.5일배) : 이 시기가 되면 CAM이 생성되며, 그 직경이 2-5mm정도 된다. 시료(Sample)을 적당한 용매(증류수, ethanol 등)에 녹인 다음 4등분된 더마녹스 커버슬립(Thermanox coverslip)위에 10㎕씩 떨어뜨리고 깨끗한 벤치(clean bench) 안에서 말린다. 여기서 더마녹스 커버슬립(Thermanox coverslip)은 가위로 잘라 4등분하여 깨끗한 벤치(clean bench)의 UV 아래에서 하루밤 동안 정치시킨 것이다. 수정란의 유리테잎을 칼로 뜯어내고 CAM을 찾아 확인한 후, 핀셋으로 시료(sample)이 처리된 더마녹스(Thermanox)를 뒤집어 조심스럽게 올려놓고 다시 유리 테잎으로 막는다. 이 때 사용하는 가위, 칼, 핀셋 등은 70% 에탄올(ethanol)로 소독하여 사용하고, 핀셋은 시료(sample)를 하나하나 로딩(loading)할 때마다 소독하여 사용한다.
7일째(6.5일배): 유리 테잎을 칼로 뜯어낸다. 주사기(Syringe)로 인트라리포즈(Intralipose)(fat emulsion)를 1ml 취하고, 기포를 제거한 뒤 CAM의 바로 아래 부분에 주입한다. 이때 흰색 바탕에 뚜렷한 혈관을 관찰할 수 있다. 주사기(Syringe)로 인트라리포즈(Intralipose)를 주입할 때는 혈관이 다치지 않도록 주의한다. 상기의 방법으로 신생혈관의 형성 및 저해를 관찰 측정하였다. 다음의 방법으로 저해도를 계산하였다.
CAM 위에 혈관 형성이 억제된 수
저해도(%) = --------------------------------- × 100
CAM 위에 시료를 처리한 갯수
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 그늘쑥을 메탄올로 추출하고, 상기 추출액을 농축하여 실리카겔 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 고속 액체 크로마토그래피로 정제하여 상기의 플라본들을 분리 정제하였으며, 이들 화합물은 유파티린과 자세오시딘으로 확인하였으며, 이 화합물은 라스 발암유전자 활성화에 필수적인 효소인 파네실 전달효소의 활성 및 신생혈관형성을 저해함으로 발암유전자 발현억제제, 항암제, 암전이 억제, 당뇨병성 망막증, 각막이식시 생기는 신생혈관에 의한 실명 예방제로 유용하게 사용될 수 있는 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 그늘쑥에서 추출되며 하기 구조식 1로 표시되는 유파티린(eupatilin) 또는 자세오시딘(jaceosidin)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 라스 암유전자 발현 억제 및 혈관형성(Angiogenesis) 억제를 통한 항암용 조성물.
    [화학식 1]
    상기 식에서, R = CH3(eupatilin), R = H (jaceosidin)
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 2항의 유파티린(eupatilin) 또는 자세오시딘(jaceosidin)을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막증 예방제.
  6. 제 2항의 유파티린(eupatilin) 또는 자세오시딘(jaceosidin)을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 각막이식시 생기는 신생혈관에 의한 실명 예방제.
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