KR100658519B1

KR100658519B1 - 사이클로펜타디온 유도체를 포함하는 항암 조성물

Info

Publication number: KR100658519B1
Application number: KR1020050026815A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 손광희; 한동초; 최성규; 오현미
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2006-12-15
Also published as: KR20060104555A

Abstract

본 발명은 화학식 1의 사이클로펜타디온 (cyclopentadione) 유도체를 포함하는 항암 조성물 및 비목나무 [Lindera erythrocarpa Makino (Lauraceae)]로부터 사이클로펜타디온 화합물을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 라스 발암유전자 활성화에 필수 효소인 파네실 전달효소의 활성 및 인체 암세포주의 성장을 효과적으로 저해함으로써 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

화학식 1

상기 식에서, R₁ 및 R₂는 수소 또는 메톡시이고, R₃은 하이드록시 또는 메톡시이다.

비목나무, 사이클로펜타디온, 라스발암유전자, 암 예방 및 치료

Description

사이클로펜타디온 유도체를 포함하는 항암 조성물{Anti-cancer composition comprising cyclopentadione derivatives}

본 발명은 화학식 1의 사이클로펜타디온 (cyclopentadione) 유도체를 포함하는 항암 조성료물 및 비목나무 [Lindera erythrocarpa Makino (Lauraceae)]로부터 사이클로펜타디온 화합물을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

암의 발생률은 문명이 발달됨에 따라 증가되고 있음에도 불구하고 암환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 40여종의 강한 세포독성을 보이는 항암물질 투여에 의한 화학요법에 의존하고 있는 상태이다. 이들 치료법도 대부분 조기 암환자나 특정 암에만 국한되어 암으로 인한 사망은 계속 증가하고 있는 추세이다.

인간 암의 30% 정도와 관계가 있는 라스 암 유전자가 발현되기 위해서는 라스 단백질이 원형질막에 결합하여야 하며, 이를 위해서는 라스 단백질의 C-말단에 파네실 그룹(Farnesyl group)이 결합되어야한다. 만일 이 과정을 억제할 수 있으면, 상기 유전자의 발현을 억제할 수 있을 것으로 기대되어 이를 통한 새로운 항암 제 개발 노력이 진행되고 있다.

라스 단백질은 세포의 성장에 관여하는 성장조절인자들의 신호전달과정에서 가장 중요한 역할을 하는 단백질로서 분자량이 21kDa이며 188-189개의 아미노산으로 구성되며 구아닌 뉴클레오티드(guanine nucleotide) (GDP와 GTP)와 결합할 수 있다. 라스 단백질은 라스 프로토-온코진(ras proto-oncogene)(전구발암유전자)에 의해서 발현되고 라스 진(ras gene)은 다양한 사람의 종양에서 온코제닉 진(oncogenic gene)(발암유전자)으로서 처음 발견된 유전자이며 사람의 악성종양과 관련이 있다고 알려져 있다. 이 유전자는 하베이-라스(harvey-ras (H-ras)), 컬스텐-라스(kirsten-ras (K-ras)), 및 N-라스(N-ras)로 분류된다. 사람에서 발견되는 대부분의 암의 30%이상이 라스 단백질 (H-Ras, K-Ras, N-Ras)의 생물학적 활성이 비정상적으로 변화된 라스 진(ras gene)을 갖고 있다는 것이 증명되었으며, 특히 췌장암(90%), 직장암(50%), 폐암(50%)등은 높은 빈도로 변이된 라스 진(ras gene)을 갖고 있음이 확인되었다(M. Barbacid, Ann. Rev. Biochem. 56, 779, 1987).

라스 단백질은 세포의 증식과 분화를 조절하는 세포내 신호전달체이며, 많은 G 단백질과 마찬가지로 라스 단백질도 GTP와 결합된 형태(switch "on")일 때 신호전달체로 작용하며 GTP가 본래의 GTP 가수분해 활성 또는 GTP 가수분해를 돕는 단백질인 GAP(GTPase Activating Protein)에 의해서 GDP로 가수분해될 때 비활성화(switch "off")된다(G. Bollag, Ann. Rev. Cell Biol. 7, 601, 1991).

라스 단백질의 구조 및 생화학적인 연구에서 라스 단백질의 활성화 단계에는 GTP 결합뿐만 아니라, 라스 단백질이 세포막에 위치하는 것이 중요하다고 밝혀졌 다. 라스 단백질이 신호전달매체로서의 기능을 하기 위해서는 GTP와 결합한 후 원형질막에 위치하여야 하며, 이 막에 위치하지 못하고 세포질 내에 있을 때는 그 활성을 나타내지 못한다. 즉, 라스가 생물학적인 활성을 나타내기 위해서는 C-말단이 변형된 후, 원형질막의 원형질막 표면에 부착되어 있어야 한다. 이를 위해서는 라스가 세포질에서 비활성의 전구체로써 생합성된 다음 스테로이드 생합성과정에서 생성되는 지질과 결합하여야하며, 이러한 일련의 반응을 "번역 후 변형과정(post-translational modification)"이라 한다.

이러한 신호전달 단백질들과 원형질막의 결합은 라스 단백질을 포함한 대부분의 G 단백질(G protein)들에서 발견되며 이 지질화 반응은 C-말단에 있는 시스테인 잔기에서 일어난다. 이들 단백질은 C-말단에 한 개의 시스테인과 두 개의 지방족 잔기(aliphatic residue), 그리고 한 개의 카르복실-터미널 "X" 잔기(carboxyl-terminal "X" residue)를 포함하는 CAAX 모티프(motif)를 가지고 있다. "X" 위치의 아미노산은 Ser, Ala, Met, Glu 등으로 한정되어 있고, 파네실 전달 효소가 단백질 기질을 인식하는데 중요한 잔기이다. 이 잔기의 구성에 따라 결합되는 지질과 작용하는 효소가 결정된다. 이들 지질화 반응에는 크게 파네실화 반응(Farnesylation)과 제라닐제라닐화 반응(Geranylgeranylation)의 두 가지 형태가 있으며, 라스 단백질의 경우에는 파네실화 반응(farnesylation)이 일어나고, 세포내의 지질 결합 단백질들은 대부분 제라닐제라닐기(geranylgeranyl group)가 결합한다. 즉, 제라닐제라닐화 반응이 파네실화 반응보다 5-10배 정도 더 많이 일어난다(P. J. Casey, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 8323, 1989). 이소프레닐 화 반응(Isoprenylation)에 참여하는 이소프레닐기(isoprenyl group)는 2-아세틸-CoA(2-acetyl-CoA)로부터 시작하여 콜레스테롤(cholesterol)을 생합성하는 이소프레노이드(isoprenoid)의 생합성과정에서 생기는 산물이다(J. L. Goldstein and M. S. Brown, Nature, 343, 425, 1990).

라스 단백질의 원형질막 결합에 필수적인 번역 후 변형 과정을 요약해보면 첫 단계로 파네실기가 카르복시 말단에서 4번째 위치의 시스테인에 도입되고, 두 번째로 시스테인의 카르복시쪽 3개 아미노산들이 단백질 가수분해 효소의 작용으로 떨어져 나가고(proteolytic cleavage), 마지막으로 카르복시 말단으로 노출된 시스테인에 메틸화 반응이 일어나는 일련의 과정이다. 이 과정을 통하여 라스 단백질의 C-말단은 친유성인 성질로 변화되어 원형질막과 강력하게 결합된다. 이 C-말단의 지질은 세포내 신호전달 과정에서 마치 전선을 지지해주는 전주와 같은 역할을 하게 되는 것이다. 이 번역 후 변형과정에는 3가지의 효소, 즉 파네실 전달, 펩타이드 가수분해, 그리고 메틸화 반응 효소가 관여하며, 각각의 효소를 효과적으로 저해할 수 있다면 전선에서 전주를 제거하는 것과 같아 세포내 신호전달을 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 기대되며 이는 곧 새로운 항암제의 개발 가능성을 시사해 주는 것이다. 그 이유는 변형에 의해서 장시간 활성화 상태로 존재하는 라스 단백질이라도 원형질막과 결합하지 못한다면 세포성장과 분화에 필요한 신호를 다음 단계의 신호전달 단백질인 라프 단백질(Raf protein)로 전달하지 못하기 때문이다.

이들 효소 중 펩타이드 가수분해 효소는 아직 분리 정제되지 못했으며 정확 한 반응 기작도 밝혀지지 않은 상태이고, 파네실 전달 및 메틸화 반응 효소의 저해제 개발을 위한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다. 그러나 라스의 변형과정 중 파네실화 반응이 첫 번째 단계이기 때문에 파네실 전달효소의 저해제 탐색을 통한 항암제 개발 연구가 가장 활발히 진행되고 있다.

1990년 처음으로 쥐로부터 순수 분리된 파네실 전달 효소가 라스의 C-말단의 펩타이드와 유사한 구조를 갖고 있는 화합물들에 의해서 경쟁적으로 저해된다는 사실이 알려지면서, 이들 구조를 모방한 저해제들이 합성되기 시작하였다(Y. Reiss, Cell, 62, 81, 1990). 이들 펩티도미메틱 화합물 중에서 머크사(Merck Co.) 연구소에서 개발한 L-731,734와 L-731,735(N. E. Kohl et al, Science, 260, 1934, 1993), 및 제네텍(Genentech)사의 벤조다이아제핀 등은 라스가 과 발현된 세포주에서도 좋은 활성을 보여준다고 발표되었다(G. L. James et al, Science, 260, 1937, 1993). 그 중 머크사(Merck Co.) 연구소에서 개발한 L-744,822는 누드마우스(nude mouse)에 라스 발암유전자를 이식하여 유발시킨 종양을 강력하게 억제시킨다는 것이 발표된 바 있다(N. E. Kohl et al, Nature Med. 1, 792, 1995). 이들 이외의 합성저해제로는 히드록시파네실 포스폰산(hydroxyfarnesyl phosphonic acid) 유도체 및 미국 세링플라우사에서 발표한 트리사이클릭(tricyclic) 화합물인 SCH 44,342등이 있다(W. R. Bishop, et al, J. Biol. Chem. 270, 30661, 1995).

효소학적인 방법에 의한 많은 시료의 탐색으로 파네실 전달 효소를 저해시키는 다양한 천연물 유래 화합물들이 발표되었다. 처음으로 발견된 천연물 유래 저해제는 식물체로부터 분리한 리모넨(limonene), 페릴릭(perillic), 디히드로페릭산 (dihydroperillic acid) 등이며, 미생물 유래 저해제는 1992년에 방선균으로부터 분리한 스트렙도니그린(Streptonigrin)의 유도체인 10'-데스메톡시 스트렙토니그린(10'-desmethoxy streptonigrin)이 최초의 저해제이다. 두개의 새로운 디카르복시산(dicarboxylic acid) 유도체 케토멜릭산(chaetomellic acid) A와 케토멜릭산(chaetomellic acid) B는 케토멜라 어큐티세타(Chaetomella acutiseta)의 발효액으로부터 분리되어 졌다. 자라고즈산(Zaragozic acid) A와 B는 스쿠알렌 합성효소(squalene synthase)의 강력한 저해제로 보고 되었던 화합물이며 이들 물질이 파네실 전달효소에 경쟁적 저해제라는 것이 확인되었다. 이들 이외에도 펩티신나민(pepticinnamins) 등이 파네실전달효소 저해제로 발표되었다(V. Manne, et al, Drug Devep. Res. 34, 121, 1995, S. Omura et al, Drug Future, 19, 751, 1994, J. K. Buolamwini, Curr. Opinion Chem. Biol. 3, 500, 1999).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 비목나무의 잎과 열매로부터 분리, 정제된 메틸린더론 (methyllinderone), 메틸루시돈 (methyllucidone), 루시돈 (lucidone), 린더론 (linderone)을 분리하고 이러한 화합물이 라스 발암유전자 활성화에 필수 효소인 파네실 전달효소의 활성 및 암세포주에 대해 성장 저해 활성을 나타낸다는 사실을 밝혀내어, 상기 사이클로펜타디온 유도체를 암을 예방하고 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1의 사이클로펜타디온 유도체를 포함하는 항암 조 성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비목나무로부터 화학식 1의 사이클로펜타디온 유도체를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 사이클로펜타디온 유도체를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁ 및 R₂는 OCH₃ 또는 H이고, R₃은 OCH₃ 또는 OH이다.

상기 화학식 1의 화합물의 항암 효과는 본 발명 이전에는 밝혀진 바 없는 새로운 용도로서, 본 발명자는 파네실 전달 효소의 활성을 억제하고 인간 암 세포주의 성장을 저해함으로써 발암 유전자의 발현 및 암전이를 억제하는 항암 효과를 확 인하였다. 쥐로부터 분리한 파네실 전달 효소 및 파네실파이로포스페이트를 이용한 활성 측정 결과 33 내지 125 uM 의 IC₅₀ 값을 나타내었으며, 결장암, 유방암, 폐암 등의 인간 암 세포주에 대해 WST-1 검정한 결과 0.2 내지 15 ㎍/㎖에서 50%의 성장 억제 효과(GI₅₀)를 나타내었다.

본 발명에서 사용된 용어 “항암”은 암의 예방 및 치료 모두를 일컫는다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 라스 단백질의 과발현에 기인한 암, 예를 들어 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 췌장암 등의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으며 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 포함되는 화학식 1의 화합물은 또한 이의 염의 형태로도 사용될 수 있으며, 이러한 염은 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 다양한 유기 또는 무기염을 포함한다. 바람직한 화학식 1의 화합물은 화학식 2의 메틸린더론 (methyllinderone), 화학식 3의 메틸루시돈 (methyllucidone), 화학식 4의 루시돈 (lucidone), 화학식 5의 린더론 (linderone)이다:

본 발명의 조성물은 상기한 화학식 1의 화합물 이외에 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유 화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 체중 ㎏당 1 내지 100㎎의 양, 바람직하게는 5 내지 20㎎의 양을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

화학식 1의 사이클로펜타디온 유도체는 천연 물질로부터 분리하거나 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 화학식 1의 화합물을 분리할 수 있는 천연물질로서 비목나무가 바람직하게 사용될 수 있다.

비목나무(Lindera erythrocarpa)는 녹나무과(Lauraceae) 식물로 세계적으로 45속 1,500여종이 분포하고 우리나라에는 6속 12종이 자생하고 있는 것으로 알려져 있다(Sun, B. Y. and Chung, Y. H. (1988) Monographic study of the Lauraceae in Korea. Kor. J. Plant Tax. 18, 133-151). 보얀목, 백목이라고도 하며 높이 10m, 지름 30㎝에 달하는 비목나무는 자웅이주로 4월에서 5월에 연한 황색의 꽃이 피고 9월에 지름 8㎜ 정도의 둥근 적색열매를 맺는다. 한국의 남부지방을 비롯하여 일본, 중국의 따뜻한 지역에 자생하는 높이 5m의 낙엽수이다.

비목나무의 건조된 열매는 특이한 방향과 쓴맛을 가지고 있어 일본에서는 위장약과 신경통의 진통제로 사용되고 있다. 또한, 비목나무의 잎과 열매의 추출물이 항진균 활성을 나타낸다고 보고 된 바 있었으나, 비목나무로부터 분리된 테르펜 계 화합물이 항암 효과를 갖는다는 것에 대해서는 개시된 바 없었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) 비목나무를 알코올 추출하는 단계; (2) 단계 (1)의 추출물을 실리카겔 크로마토그래피하는 단계; (3) 단계 (2)의 용출물을 박막 크로마토그래피하는 단계 및 (4) 단계 (3)의 분획물을 고속 액체 크로마토그래피하는 단계를 포함하여, 메칠린더론, 메칠루시돈, 루시돈 또는 린더론을 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서 알코올 추출은 비목나무의 잎, 열매 또는 이둘 모두를 사용할 수 있다. 알코올 추출에 사용되는 알코올은 메탄올이 바람직하게 사용된다. 바람직하게는, 단계 (2)의 크로마토그래피는 메틸렌클로라이드와 메탄올의 구배를 사용하여 수행하고, 단계 (4)의 크로마토그래피는 메탄올과 물의 구배를 사용하여 수행한다.

구체적 실시에서, 비목나무의 잎과 열매를 메탄올로 추출하고 이 추출물을 실리카겔 크로마토그래피 칼럼에 로딩하여 메틸렌클로라이드와 메탄올의 구배, 바람직하게는 99 : 1에서 95 : 5의 구배로 용출시켜 활성분획을 분리한 후, 분리된 활성 혼합물을 다시 일련의 크로마토그래피, 즉 C18 크로마토그래피 칼럼에 흡착시킨 후 메탄올과 물로 용출시켜서, 박막 크로마토그래피를 수행하고 고속 액체 크로마토그래피 칼럼에 로딩하여 메탄올과 물의 구배, 바람직하게는 50 : 50에서 70 : 30의 구배로 용출시켜 순수하게 분리하였다. 상기한 바와 같이 정제된 화합물을 UV 흡광도 측정, IR 흡광도 측정, 고 해상도 질량분석 및 NMR 분석을 통해 그 화합 물이 항암 활성을 갖는 메칠린더론, 메칠루시돈, 루시돈 또는 린더론임을 확인하였다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 비목나무로부터 사이클로펜타디온 화합물의 추출 및 분리 정제

비목나무(대한민국 중부지방에 자생하는 것을 채취) 잎 또는 열매를 잘게 분쇄하여 메탄올을 넣어 상온에서 48시간 방치한 후 교반하여 여과지를 이용해서 액상과 고체부분을 분리하였다. 액상을 모아서 감압 하에서 농축한 후 메탄올을 가하여 용해시켰다. 활성물질을 함유하고 있는 유기용매 층을 모아 감압 하에 농축하였다. 농축된 추출물을 메틸렌클로라이드에 녹인 후 실리카겔(Merck, Art No. 9385)에 가하여 활성물질을 흡착시킨 다음, 메틸렌 클로라이드와 메탄올의 비율을 99 : 1에서 95 : 5로 변화시키면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하여 활성분획을 분리하였다. 수득한 분획물을 C18 칼럼에 흡착시킨 다음 메탄올과 물로 용출시켜 부분 정제한 활성 물질을 얻었다. 이 활성 물질을 박막 크로마토그래피한 후, 활성 분획을 최종적으로 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)(HPLC 칼럼: Phenomenex사의 ODS (250 x 21.2 ㎜), 메탄올 : 물(50 : 50에서 70 : 30으로 구배 용출)하여 하기 화합물을 순수하게 분리하였다.

최종적으로 잎 1.68㎏을 메탄올로 추출하여 추출물 75.32g를 얻었으며, 이로부터 순수한 화합물 메틸린더론 (methyllinderone)과 메틸루시돈 (methyllucidone)을 각각 0.43g 과 1.45g의 수율로 얻었다. 열매 163g를 메탄올로 추출하여 추출물 8.91g를 얻었고, 메틸린더론 (methyllinderone), 메틸루시돈 (methyllucidone), 루시돈 (lucidone), 린더론 (linderone)을 각각 0.21g, 0.91g, 0.06g 및 0.04g를 분리하였다

실시예 2 : 사이클로펜타디온 화합물의 구조분석

UV 흡광도 분석, IR (infrared) 흡광도 분석 및 고해상도 질량분석기 분석을 실시하여 상기 순수 정제된 화합물의 분자량 및 분자식을 결정하였다. 구체적으로, UV 흡광도 분석은 시마주사의 UV-265 분광광도계(Shimadzu UV-265 spectrophotometer)로 측정하였으며, IR 흡광도는 바이오-라드사의 디지랩 디비존 FTS-80 분광광도계(Bio-Rad Digilab Division FTS-80 spectrophotometer)로 측정하였고, 분자량 및 분자식은 VG70-SEQ 질량 분광계(mass spectrometry; MS)를 이용한 고해상도(High resolution) MS를 측정하여 결정하였다. 또한 핵자기공명기(Varian 300 ㎒, 500 ㎒ NMR)를 이용하여 ¹H, ¹³C-NMR 스펙트럼(spectrum)을 얻었으며, 이들 스펙트럼을 종합적으로 분석하여 구조를 결정하였다.

메틸린더론 (methyllinderone)

외형(appearance)		엷은 노란색
분자식		C₁₇H₁₆O₅
분자량		300.31
융점(℃)		84-85
용해성	가용성	Alcohols, DMSO
	불용성	Hexane, H₂O

메틸루시돈 (methyllucidone)

외형(appearance)		엷은 노란색
분자식		C₁₆H₁₄O₄
분자량		270.09
융점(℃)		126-128
용해성	가용성	Alcohols, DMSO
	불용성	Hexane, H₂O

루시돈 (lucidone)

외형(appearance)		엷은 노란색
분자식		C₁₅H₁₂O₄
분자량		256.07
융점(℃)		166.5-168.5
용해성	가용성	Alcohols, DMSO
	불용성	Hexane, H₂O

린더론 (linderone)

외형(appearance)		엷은 노란색
분자식		C₁₆H₁₄O₅
분자량		286.08
융점(℃)		92-94
용해성	가용성	Alcohols, DMSO
	불용성	Hexane, H₂O

실시예 3 : 사이클로펜타디온 화합물의 파네실 전달효소 저해활성 측정

파네실 전달효소의 효소원으로는 흰쥐(Sprague Dawley 수컷, 체중 100 내지 150g)의 뇌를 적출하여 생리식염수로 세척하고 균질화한 후, 이 균질액을 원심분리한 다음, Q 세파로즈 고속 칼럼(Q Sepharose Fast Flow column)을 이용하여 부분 정제한 것을 사용하였다.

효소의 활성은 ³H-파네실파이로포스페이트(³H-Farnesyl pyrophosphate, FPP)를 기질로 사용하는 브로우(Blow) 등의 방법을 일부 수정하여 SPA(Scintillation Proximity Assay) 방법으로 측정하였다.

상기 실시예 1에서 분리 정제한 화합물의 시료액 10㎕, 분석용 완충용액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 25mM MgCl₂, 2mM KCl, 5mM DTT, 5mM Na₂HPO₄, 0.01% Triton X-100) 10㎕, 희석된 ³H-FPP 20㎕, 비오틴-라민 B 펩티드(biotin-lamin B peptide) 20㎕, 파네실 단백질 전달효소 40㎕를 잘 섞은 후, 상온에서 30분간 반응시키고 150㎕의 SPA 구슬과 반응용액(bead/stop reagent solution)을 가한 다음 액체 섬광계수기(scintillation counter)를 이용하여 비오틴-라민 B 펩티드의 파네실화 정도를 CPM(count per minute) 단위로 측정하였으며, 하기 수학식 1에 따라 파네실 단백질 전달효소의 저해활성을 계산하였다.

CPM(T) : 저해제 시료와 효소를 넣었을 때의 CPM

CPM(C1) : 저해제 시료는 넣지 않고, 효소는 넣었을 때의 CPM

CPM(B) : 저해제 시료와 효소를 넣지 않았을 때의 CPM

그 결과, IC₅₀ (50% 활성 저해농도) 값을 하기 표 5에 나타내었다.

Compounds	IC₅₀ (mM)
Methyllinderone	43.3
Methyllucidone	40.7
Lucidone	125
Linderone	33.3

실시예 4 : 암세포주의 성장 억제

실시예 1에서 분리 정제한 화합물의 인간 암세포주 성장 억제를 WST-1을 사용하여 측정하였다. 인간 암세포주를 10% FBS가 포함된 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소를 유지하며 배양하였고, 0.05% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 이용하여 세포를 떼어내었다. 96 웰 플레이트(96 well plate)의 각 웰에 헤마토사이토미터(hematocytometer)로 계산한 4,000개(A549, MDA-MB-231), 5,000개(HEK293, NCI-H23) 또는 6,000개(HCA-7, HCT116, SW620, DU145)의 세포를 각각 넣었다. 5% 이산화탄소를 포함한 37℃ 배양기에서 10% FBS가 포함된 배지에서 배양하고, 24시간 후에 대조군(0.1% DMSO)과 실시예 1에서 분리 정제한 각각의 화합물을 농도별로 포함(DMSO에 녹인 화합물을 배지로 희석)한 새로운 배지로 바꾸었다. 48시간동안 처리한 후에 각 웰에 WST-1(Roche) 10㎕씩을 첨가하고 2시간동안 배양한 다음, ELISA 리더(ELISA Reader, Bio-Rad)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 0.2 내지 15 ㎍/㎖ 농도에서 50% 성장 억제 효과가 관찰되었으며, 각각의 화합물 마다 특정 암세포주에 민감하게 나타났다. 그 중 메틸루시돈은 인간의 대장암세포 HCT116과 HCA-7에서 GI₅₀ 이 각각 0.26 ㎍/㎖과 0.39 ㎍/㎖로 가장 효과적인 저해를 보였다. 반면, 다른 대장암세포인 SW620, 폐암세포 NCI-H23과 A549, 전립선암세포 DU145, 유방암세포 MDA-MB-231, 신장암세포 HEK293에 대해서 GI₅₀ 이 각각 2, 1, 15, 1.8, 3.5 및 4.8 ㎍/㎖로 측정되었다. 메틸린더론은 대장암세포 HCT116, HCA-7, SW620, 폐암세포 NCI-H23과 A549, 유방암세포 MDA-MB-231, 신장암세포 HEK293에 대해서 GI₅₀ 이 각각 0.45, 0.52, 3.5, 1.1, 3.2, 3.8 및 3 ㎍/㎖로 측정되었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 화학식 1의 사이클로펜타디온 유도체는 라스 발암유전자 활성화에 필수적인 효소인 파네실 전달효소의 활성 및 인체 암세포주의 성장을 저해함으로써, 암을 치료 및 예방하는데 유용하다.

Claims

하기 화학식 3으로 표시되는 메칠루시돈을 유효성분으로 하는 대장암, 전립선암, 유방암, 신장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물.

<화학식 3>
하기 화학식 4로 표시되는 루시돈을 유효성분으로 하는 대장암, 전립선암, 유방암, 신장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물.

<화학식 4>
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물은 비목으로부터 추출·분리·정제하여 얻은 것임을 특징으로 하는 대장암, 전립선암, 유방암, 신장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물.
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