CN114957198B - 一种抗霉素类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种抗霉素类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗霉素类化合物及其制备方法和用途，特点是该化合物从海洋放线菌的次级代谢产物中分离得到，其结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC NO:M2020953的海洋放线菌Steptomyces sp.4‑7通过发酵培养来获取抗霉素化合物的发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取得粗浸膏，在此基础上将该粗浸膏经正相硅胶柱层析，反向中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，优点是该抗霉素类化合物具有抗灰葡萄孢和桔青霉的作用。

Description

一种抗霉素类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及抗霉素类化合物，尤其是涉及一种抗霉素类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
抗霉素类化合物是一类天然产物，它们拥有一个共同的结构骨架，由一个大环通过酰胺键与3’-甲酰胺水杨酸单元连接而成。这类化合物通常是从放线菌中分离出来的，基于大环 (9、12、15或18元环)的大小不同以及环上的取代基不同，这些化合物具有很大的结构多样性。自1949年首次分离以来，抗霉素类化合物因其强大而多样的生物活性而受到人们的极大关注。特别地，由于其抑制线粒体电子传递链的能力，抗霉素类化合物已被证明具有抗真菌、杀虫、杀线虫和杀鱼的活性。最近，几类抗霉素型化合物也被证明具有良好的抗癌和抗炎活性。
本发明人在对海洋放线菌一株 Steptomyces sp .4-7在YMG培养基发酵下的乙酸乙酯提取物的化学调查中，发现了一个抗霉素类型新天然产物，将其命名为Antimycin A7c，进一步对其次级代谢产物进行分离纯化及活性评价。目前尚未见该化合物的化学结构及活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗霉素类化合物及其制备方法和用途，该抗霉素类化合物对灰葡萄孢和桔青霉具有抑制作用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种抗霉素类化合物，该抗霉素类化合物从海洋放线菌的次级代谢产物中分离得到，其结构式如（I）所示；
（I）。
2、一种抗霉素类化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2020953的海洋放线菌（ Steptomyces sp . 4-7）在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28 ℃培养箱中培养活化7 天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28 ℃、180 rpm/min的转速下置于摇床上培养增菌，培养3 天后收集种子液，然后将种子液按体积比10%的接种量接种到YMG培养基中，于温度28 ℃培养11天，获得发酵物；
（2）浸膏提取
在步骤（1）得到的发酵物中加入与发酵物等体积的乙酸乙酯，反复萃取3次后，合并三次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯提取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；
（3）化合物的分离制备
将步骤（2）得到的粗浸膏首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为（100:1）~（0:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到6个组分；将收集得到的第2个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为30-100%的乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到21个组分；将收集得到的第9个组分采用由乙腈与水按体积比24:76的比例混合而成的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化获得化合物，其结构如（I）所示，
（I）。
步骤（1）中所述的YMG培养基的配制方法如下：将20 g淀粉、10 g葡萄糖、5g酵母提取物、5g麦芽浸膏、0.5g碳酸钙和30g海盐溶于1000 mL海水中配制而成。
步骤（3）中所述的反相中压柱层析（MPLC）梯度洗脱中乙腈从30~100%，洗脱时间150 min。
步骤（3）中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为 2.0 mL/min。
3、上述抗霉素类化合物在制备灰葡萄孢和/或桔青霉抑制剂方面的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种抗霉素类化合物及其制备方法和用途，从海洋放线菌 Steptomyces sp . 4-7的次级代谢产物中分离出一种抗霉素类化合物，通过微生物发酵培养来获取抗霉素类的发酵物，然后通过将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取，得粗浸膏，然后将该粗浸膏经中压正向硅胶柱层析，中压反向柱层析，及反相半制备高效液相色谱分离纯化得到。此外通过抗真菌活性的筛选，发现该化合物具有显著的抗灰葡萄孢和桔青霉活性，可用于抑制由灰葡萄孢和桔青霉引起的相关植物病害的先导药物开发方面的用途。
上述海洋放线菌（ Steptomyces sp . 4-7），该菌保藏编号为CCTCC NO：M2020953，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种海洋放线菌（ Steptomyces sp . 4-7）发酵培养获取的抗霉素类化合物，其结构式如（I）所示：
（I）。
实施例2
如实施例1结构式（I）所示的抗霉素类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
1、发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2020953的海洋放线菌（ Steptomyces sp . 4-7）在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28 ℃培养箱中培养活化7 天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28 ℃、180 rpm/min的转速下置于摇床上培养增菌，培养3 天后收集种子液，然后将种子液按体积比10%的接种量接种到YMG培养基中，于温度28 ℃培养11 天，获得发酵物；
2、浸膏提取
在步骤1得到的发酵物中加入与发酵物等体积的乙酸乙酯，反复萃取3次后，合并三次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯提取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；
3、化合物的分离制备
将步骤2获得的粗浸膏首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为（100:1）~（0:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到6个组分；将收集的第2个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为30-100%的乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到21个组分；将得到的第9个组分采用由乙腈与水按体积比24:76的比例混合而成的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化，获得化合物，其结构如（I）所示：
（I）。
本发明化合物Ⅰ为白色粉末，正离子模式下的高分辨质谱(HR-ESI-MS)给出其准分子离子峰m/z 521.2480 [M + H]+。结合13C NMR谱确定其分子式为C26H37N2O9，该化合物的1H和13C NMR谱数据见表1：
表1. 化合物Ⅰ的1D NMR 数据 (DMSO- d 6)
 注1：s—单重峰、d—二重峰、t—三重峰、q—四重峰、 m—多重峰。
注2：1H 在600 MHz NMR获得；13C 在150 MHz NMR获得。
 实施例2
实施例1所述抗霉素类化合物活性及应用
1、实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物Ⅰ纯品，精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液供测试抗真菌活性。该实验使用的指示菌为灰葡萄孢( CGMCC 3.3789 )和桔青霉（ATCC 1109）。
2、实验方法
牛津杯法抗真菌测试方法：将100μL的孢子悬浮液均匀涂在PDA板上，在板中央放置牛津杯。牛津杯中分别加入100μL的不同浓度的化合物溶液，浓度为32 µg/mL、16 µg/mL、8 µg/mL、4 µg/mL、2 µg/mL、1 µg/mL、0.5 µg/mL。以DMSO为阴性对照，同时以相同浓度的咪鲜胺作阳性对照。在28◦C下培养5d后观察真菌生长情况，每个处理设4个培养板，整个实验重复3次。
3、实验结果
牛津杯法抗真菌测试中，化合物Ⅰ对灰葡萄孢( CGMCC 3.3789 )的最低抑制浓度（MIC）被确定为2 µg/ml，对桔青霉（ATCC 1109）的MIC被确定为4 µg/ml。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种抗霉素类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M 2020953的海洋放线菌Steptomyces sp.4-7在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28℃培养箱中培养活化7天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养增菌，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积比10％的接种量接种到YMG培养基中，于温度28℃培养11天，获得发酵物，其中所述的YMG培养基的配制方法如下：将20g淀粉、10g葡萄糖、5g酵母提取物、5g麦芽浸膏、0.5g碳酸钙和30g海盐溶于1000mL海水中配制而成；
(2)浸膏提取
在步骤(1)得到的发酵物中加入与发酵物等体积的乙酸乙酯，反复萃取3次后，合并三次萃取所得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯提取液减压浓缩蒸干后，获得粗浸膏；
(3)化合物的分离制备
将步骤(2)得到的粗浸膏首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为(100:1)～(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到6个组分；将收集得到的第2个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积百分比为30-100％的乙腈-水为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱时间150min，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到21个组分；将收集得到的第9个组分采用由乙腈与水按体积比24:76的比例混合而成的溶液为流动相，流速为2.0mL/min，经半制备反相高效液相色谱分离纯化，获得化合物，其结构如(I)所示，
Figure FDA0004071232850000021
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