CN1265704C - 抑菌霉素及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种抑菌霉素及其应用，该抑菌霉素的分子式为：该抑菌霉素适用于防治螨、蜱和其它昆虫，对鞘翅目和象鼻虫、双翅目害虫、虱目、等翅目、膜翅目、动物寄生虫和由11种真菌引起的植物病害具有很好防治效果。本发明应用制剂的制备工艺简单、易操作，比常规药剂用量少，可以克服小菜蛾等植物病虫害对常规农药的抗药性，使用安全，不污染环境，是一种无公害的生物农药。
Description
技术领域
本发明涉及植物保护和生物农药技术领域，具体是指一种杀虫和抑制植物病原真菌的抑菌霉素及其应用。
背景技术
抗生素是重要的生物农药之一，它是一种天然生物杀虫剂，具有对人畜毒性低、降解迅速等特点，无“三致”作用，符合无公害防治蔬菜等作物害虫的要求，因而成为近年来国内外研究开发的热点之一。大环内酯类抗生素是一类由链霉菌产生的弱碱性抗生素，具有12～22个碳内酯环化学结构。在医学上，以红霉素为代表的大环内酯类抗生素主要作用于细菌的细胞核糖蛋白体50S亚基单位，阻碍细菌蛋白质合成，属于生长期抑制剂。在农业上，以阿维菌素代表的大环内酯类抗生素对多种动物寄生虫及农业害虫害螨具有很高的杀虫活性。但同时具有杀虫活性和抑真菌活性的大环内酯类化合物未见有报道。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述现有技术中存在的不足之处，提供一种具有抑制植物病原真菌和杀虫活性的抑菌霉素及其应用，该抑菌霉素适用于防治昆虫和11种植物病原真菌等，特别是鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)的害虫，而且不污染环境，具有吸引人的杀虫和抑制植物真菌病害的效果。
本发明通过如下技术方案实现：所述抑菌霉素具有如下分子式：
所述抑菌霉素具有很强的杀虫活性，适用于防治螨、蜱和其它昆虫，包括甜菜夜蛾、烟夜蛾、棉铃虫、菜粉蝶、玉米螟、小菜蛾、卷叶蛾、地老虎、亚热带粘虫、谷蛾科、印度谷斑螟、红铃麦蛾；也对鞘翊目和象鼻虫有防治效果，包括马铃薯甲虫、黄瓜十一星叶甲、黄瓜三条叶甲、日本狐丽金龟、棉象虫；还对防治双翅目害虫有效，包括对家蝇、蚊科、果蝇、角蝇以及潜蝇科有效；对虱目、等翅目和膜翅目蚁和螨也有防治效果，包括柑橘红蜘蛛、叶螨；同时对动物寄生虫有防治效果，包括水蚤、中华锚头虱。
所述抑菌霉素适用于防治甘薯软腐病病菌、柑桔酸腐病病菌、桃黑星病病菌、番茄早疫病病菌、番茄芽枝病病菌、莴苣菌核病病菌、荔枝霜霉病病菌、炭疽菌、弯孢霉、拟茎点霉和果腐葡萄孢的植物病害。其中对拟茎点霉的活性最强，抑制中浓度(IC50值)仅为0.1μg/ml。
为了更好地实现本发明，所述抑菌霉素在应用于杀虫时配制成乳油制剂，其重量百分配比为：抑菌霉素1～30％、乳化剂5～20％、溶剂50～94％；其最佳配比为：抑菌霉素5～10％、乳化剂8～15％、溶剂75～87％，配制过程为：把抑菌霉素和乳化剂(表面活性剂)置于反应釜中，在温度28～35℃、转速为300～320转/分钟的条件下反应30～35分钟，然后再加入溶剂，继续搅拌30～35分钟，搅拌均匀后即可。其中，乳化剂包括农乳2201、农乳0203B、YZ960；溶剂包括异丙醇、丙酮、二甲基甲酰胺。
经文献检索，所述抑菌霉素的波谱数据与抗霉素(antimycins)系列中的A2相同。Antimycin系列最早是Dunshee等于1949年从一株未鉴定的链霉菌Streptomyces sp.中分得的，由于当时测试手段落后，只得到其分子式，根据其分子量可知他那时得到的化合物为antimycin A3(分子量548)。在1988年，Abidi等通过HPLC从含有antimycin A3的混合物中共分离出八个Antimycin系列物antimycin A1～A8(通称antimycin A)，并用NMR技术对它们的结构进行了确认。生物活性实验发现，antimycin A3有很强的杀菌活性，抑菌霉素(antimycins)A2也具有很强的抑菌活性，在浓度稀释到1∶800,000,000时，它对球多孢霉(Nigrospora sphaerica)仍然有抑制作用，但是迄今尚未有对抑菌霉素较系统的抑菌活性研究和杀虫活性的报道。
本发明采用一种新的链霉菌属菌种的菌株GAAS7310，它是从采于新疆天山的土壤样品中分离所得，该菌株于2003年7月7日在位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 203058Streptmyces sp.GAAS7310。
所述抑菌霉素可以通过下述方法制得：
第一步将GAAS7310营养培养基接种入营养培养基，在28℃和250rpm的振荡下生长48小时；取成熟的第一阶段营养培养物接种营养培养基，取得二次营养培养物，在28℃和300rpm条件下培养48小时，将成熟的菌种发酵培养，在28℃和300rpm下保持培养4天。可用合适的溶剂提取成熟的发酵物并通过色谱分离而获得代谢物；
第二步发酵完毕，用板框压滤的方法分离获取菌丝，将菌丝用1∶2的丙酮溶液浸取10小时，将浸取液浓缩去丙酮，再用乙酸乙酯萃取有效物，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩获取油状物，提取浓缩液拌硅胶过柱，用乙酸乙酯、石油醚多次硅胶柱层析和浓缩，获得油状物质纯品。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1、本发明的化合物为杀虫和防治植物真菌病害的抗生素，其制剂制备工艺简单、易操作、易制备。
2、本发明的抑菌霉素对小菜蛾等害虫防治效果好，比常规药剂用量少，可以克服小菜蛾等害虫对常规农药的抗药性，同时可以抑制11种植物病原真菌。
3、本发明的抑菌霉素使用安全，不污染环境，是一种无公害的生物农药。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
实施例一
本发明抑菌霉素是从Streptmyces sp.GAAS7310的菌丝体提取出来的，具体过程为将菌株Streptmyces sp.GAAS7310在500L在发酵罐上进行发酵培养，发酵液与菌丝分离后，菌丝用丙酮浸提。将丙酮提取物经大孔树脂吸附后，依次用水和乙酸乙酯洗脱，将乙酸乙酯洗脱液减压浓缩后，进行硅胶柱层析分离。采用生物活性跟踪测试，从30％EtOAc的部位中分得强活性成分的抑菌霉素，白色针状晶体，mp 140-142℃，[α]D 20+114.7(c 0.002，acetone)。13CNMR显示分子中有7个季碳，10个次甲基，5个亚甲基和5个甲基。结合FABMS谱中分子离子峰为535[M+1]+，确定分子式为C27H38N2O9，不饱和度U＝10。13CNMR谱图中可以看到分子中有5个羰基[δ175.7(C)，174.1(C)，170.9(C)，170.3(C)，160.7(CH)]，6个烯碳[δ151.6(C)，128.6(C)，125.2(CH)，122.6(CH)，119.3(CH)，114.5(C)]，3个连氧次甲基(δ76.3，74.8，72.2)，3个次甲基(δ54.7，51.1，41.8)，5个亚甲基(δ36.7，29.7，28.6，27.2，23.1)和5个甲基(δ18.2，15.4，2×17.0，11.9)。化合物共有10个不饱和度，除去上述5个羰基和1个苯环，化合物中还应有1个环。1HNMR谱显示分子中存在一个连三取代苯环[δ8.47(dd，8，1.5Hz)，7.77(dd，8，1.5Hz)和6.92(dd，8，8Hz)]，三个活泼氢[δ12.83(s)，9.09(s)，8.31(d，8Hz)]，1R谱上存在3350cm-1峰，δ12.83(s)提示分子中存在与羰基螫合的酚羟基。由于1H-1HCOSY中可观察到δ9.09(s)与δ8.52(d，1.5Hz)相关，而DEPT显示δH8.52连在δC160.7上，因此可以推断δ9.09(s)为NH，与甲酰基相连。另外一个活泼氢(δ8.31)与δ5.41偶合，说明这个活泼氢也为NH，而且它与羰基(δ170.9)相关，提示它也是酰胺基。分子中还剩下六个氧，除去三个羰基，13C NMR谱显示分子中有三个烷基碳直接与氧原子相连[δ4.9(m)，5.0(m)，5.70(dq，7，7Hz)]，说明另外三个羰基为酯基。通过二维1H-1HCOSY、HMQC和HMBC技术，推导出抑菌霉素化合物的结构如下：
发明人经过长期的试验、研究，有很多成功制备制剂的实施例，下面举例列于下表所示：
表1
| 39％ | |||
| 制备 | 把抑菌霉素和乳化剂置于反应釜中、在温度35℃反应釜的转速为320转/分钟的条件下反应35分钟，然后再加入所选用有机溶剂继续搅拌35分钟即可。 | 把抑菌霉素和乳化剂置于反应釜中、在温度30℃反应釜的转速为300转/分钟的条件下反应30分钟，然后再加入所选用有机溶剂继续搅拌30分钟即可。 | 把抑菌霉素和乳化剂置于反应釜中、在温度28℃反应釜的转速为310转/分钟的条件下反应32分钟，然后再加入所选用有机溶剂继续搅拌32分钟即可。 |
| 效果 | 使用浓度较高，用量较大，杀灭害虫效果较好。 | 使用浓度较低，用量较少，杀灭害虫效果很好。 | 使用浓度很低，用量很少，杀灭害虫效果很好 |
表2
| 入所选用有机溶剂继续搅拌35分钟即可。 | 选用有机溶剂继续搅拌30分钟即可。 | 选用有机溶剂继续搅拌32分钟即可。 | |
| 效果 | 使用浓度较高，用量较大，杀灭害虫效果较好。 | 使用浓度较低，用量较少，杀灭害虫效果很好。 | 使用浓度很低，用量很少，杀灭害虫效果很好 |
实施例八
本发明所述抑菌霉素适用于防治昆虫、螨和蜱，包括在昆虫、螨和蜱的场所使用昆虫、螨和蜱抑制量。昆虫、螨和蜱的场所表示这样的环境：其中，昆虫、螨和蜱的幼虫、成虫和卵，包括空气、食物和所接触的物体。例如，食植物的昆虫或螨可通过将所述活性化合物适用到昆虫和螨食或寄生的植物部分(特别是叶子)来控制。通过本发明所述抑菌霉素来防治昆虫的效果与使用次数和使用方法有关，同时与被防治的昆虫的种有关。
将小白菜盆栽，长至5片叶时，每盆接入低龄抗性小菜蛾幼虫50～60头，待试虫活动稳定后喷本发明制剂，处理两天后开始调查死亡虫数量、死亡状态。每个处理设4次重复，计算死亡率，使用结果如下表所示。
表3 抑菌霉素对抗性小菜蛾的防治效果
| 药剂及浓度 | 供试虫数(头/盆) | 处理2天后死亡率 | |
| 本发明制剂 | 75ppm | 52 | 97.62％ |
| 30ppm | 49 | 88.64％ | |
| 15ppm | 50 | 78.23％ | |
实施例九
用池塘里自然繁殖生长的水蛛作为参照物，来检测本发明制剂的杀虫效果。取含有水蛛的池塘水，分别加入不同浓度的本发明制剂及晶体敌百虫，同时设不加药物的对照组，连续观察3天，统计计算本发明对水蛛的杀灭效果。使用结果如下表所示。
表4 抑菌霉素对水蛛的杀灭效果
| 药物 | 浓度(ppm) | 杀灭效果(％) | ||
| 24hr | 48hr | 72hr | ||
| 本发明制剂 | 0.021 | 89 | 100 | 100 |
| 0.013 | 83 | 90 | 93 | |
| 0.004 | 63 | 77 | 83 | |
| 敌百虫 | 0.5 | 88 | 90 | 93 |
抑菌霉素对家蝇还具有很强的击倒作用，供试家蝇在取食混有抑菌霉素的白糖后于3h内就被麻痹，不能正常飞行，仰卧瓶底，有些翻身后企图飞行，但无力飞起，六足表现无力，不能支撑虫体，接着试虫基本不动，进入昏迷阶段，偶有翅颤，用毛笔轻轻触碰，试虫的足才抖动，在24h后处理浓度为50和25ug/ml的试管内死亡虫体已超过了90％。取24h后的观察数据进行数据分析，计算出抑菌霉素对家蝇的毒力回归方程为Y＝4.7695+1.1884X，r＝0.9866，LC50值为1.56μg/ml，结果表明抑菌霉素对家蝇成虫具有很高的毒杀活性，可用于防治卫生害虫。
实施例十
病菌抑制实验方法为，配成抑菌霉素的浓度为100μg/ml的带毒培养基。用无菌水作为对照。每个组分做12个处理，每个处理设5个重复，5个对照。于28℃培养，每12小时测量菌丝直径，十字型量取菌落直径，取其平均值减去原菌丝块直径，连续测定一周。观察这两种活性组分分别对哪几种病原菌的菌丝生长具有抑制作用。
在定性分析的基础上设定各组分对各个供试菌的处理浓度梯度，对具有抑制作用的病原菌进行定量分析，数据处理方法为：
试验在培养室(温度：28℃；相对湿度70％～80％)内进行，调查结果后求出回归方程及IC50值。
定性试验结果表明抑菌霉素在浓度为100μg/ml时对供试病原真菌中的甘薯软腐病病菌、柑桔酸腐病病菌、桃黑星病病菌、番茄早疫病病菌、番茄芽枝病病菌、莴苣菌核病病菌、荔枝霜霉病病菌、炭疽菌、弯孢霉、拟茎点霉和果腐葡萄孢的菌丝生长有明显的抑制作用。
在此基础上对各个病原真菌进行抑制试验，结果如表5所示。试验结果表明抑菌霉素的抑菌谱较广，对田间果蔬的常见真菌性病害病原菌均有较好的抑制作用，抑制活性相对最高的为拟茎点霉，IC50值仅为0.1μg/ml，IC50值在100μg/ml以下的有炭疽病病菌、荔枝霜霉病病菌等7种菌，IC50值在100μg/ml～200μg/ml之间的有甘薯软腐病病菌和番茄芽枝病病菌2种菌，活性相对最弱的为果腐葡萄孢，IC50值为398.07μg/ml。各个处理除了直径明显小于对照外，菌丝的密度也明显小于对照。
表5 抑菌霉素对11种病原真菌的毒力测定
| IC50值(μg/ml) | 回归方程 | 相关系数 | |
| 甘薯软腐病病菌柑桔酸腐病病菌桃黑星病病菌番茄早疫病病菌番茄芽枝病病菌莴苣菌核病病菌荔枝霜霉病病菌果腐葡萄孢炭疽病病菌弯孢霉拟茎点霉 | 108.3690.5296.1670.34137.5582.5935.33398.0723.3468.570.1 | Y＝2.5805+1.1890XY＝3.9646+0.5291XY＝3.8957+0.5569XY＝4.1612+0.4541XY＝3.1668+0.8572XY＝2.3926+1.3602XY＝3.1277+1.2094XY＝2.8469+0.8281XY＝4.3846+0.4498XY＝3.9696+0.5612XY＝5.2352+0.2316X | 0.97550.94120.91980.98290.97280.98180.98020.99670.99300.99160.9740 |
从试验结果看出，本发明对昆虫和植物真菌病害的防治效果很好，对环境没有污染。可以克服病虫害对药剂的抗药性。作为病虫害的防治剂，将有利于农业的稳产和高产，从而产生较大的经济和社会效益。
如上所述，即可较好地实现本发明。
Claims (7)
1、抑菌霉素，其特征是，它具有如下分子式：
2、权利要求1所述的抑菌霉素的应用，其特征是，它适用于防治螨、蜱、甜菜夜蛾、棉铃虫、菜粉蝶、玉米螟、小菜蛾、卷叶蛾、地老虎、亚热带粘虫、印度谷斑螟、红铃麦蛾、家蝇、蚊、果蝇、角蝇。
3、权利要求1所述的抑菌霉素的应用，其特征是，它适用于防治植物病害，包括适用于防治甘薯软腐病病菌、柑桔酸腐病病菌、桃黑星病病菌、番茄早疫病病菌、番茄芽枝病病菌、莴苣菌核病病菌、荔枝霜霉病病菌、炭疽菌、弯孢霉、拟茎点霉和果腐葡萄孢的植物病害。
4、根据权利要求2或3所述的抑菌霉素的应用，其特征是，在应用于杀虫时配制成乳油制剂，配制过程为：把重量百分配比为1～30％的抑菌霉素和5～20％的乳化剂置于反应釜中，在温度28～35℃、转速为300～320转/分钟的条件下反应30～35分钟，然后再加入重量百分配比为50～94％的溶剂，继续搅拌30～35分钟，搅拌均匀后即可。
5、根据权利要求4所述的抑菌霉素的应用，其特征是，其应用的重量百分配比为：抑菌霉素5～10％、乳化剂8～15％、溶剂75～87％。
6、根据权利要求4所述的抑菌霉素的应用，其特征是，所述乳化剂包括农乳2201、农乳0203B、YZ960。
7、根据权利要求4所述的抑菌霉素的应用，其特征是，所述溶剂包括异丙醇、丙酮、二甲基甲酰胺。
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