CN116535415A - 一种七元环吲哚萜类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种七元环吲哚萜类化合物及其制备方法和用途，特点是该化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC NO:M2014098的海洋球孢枝孢菌通过发酵培养来获取七元环吲哚萜类化合物的发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取得粗浸膏，在此基础上将该粗浸膏经正相硅胶柱层析，反向中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，优点是该七元环吲哚萜类具有抗白色念珠球菌的作用，可以用于开发预防和治疗由白色念珠球菌所引起的人体上呼吸道真菌感染的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种七元环吲哚萜类化合物，尤其是涉及一种从海洋真菌中提取的七元环吲哚萜类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
吲哚萜类化合物是一类天然产物，它们都拥有一个共同的结构骨架，由一个环二萜与吲哚部分连接而成。这类化合物通常是于真菌中分离出来的，基于大环的大小不同以及环上的取代基不同，这些化合物具有很大的结构多样性。自1975年首次分离以来，吲哚萜类化合物因其强大而多样的生物活性而受到人们的极大关注。吲哚萜类化合物已被证明具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗癌活性。
本发明人在对一株海洋真菌在大米培养基发酵下的乙酸乙酯提取物的化学调查中，发现了一个抗念珠球菌的新天然产物。目前尚未见该化合物的化学结构及抗念珠球菌的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对白色念珠菌具有抑制作用的七元环吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种七元环吲哚萜类化合物，该类化合物的结构式如(I)所示；
2、一种七元环吲哚萜类化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2014098的球孢枝孢菌(CladosporiumsphaerospermumYS3-1-5)在PDA培养基的平板上划线，于28℃培养箱中培养活化7天后，挑取单菌落接种于PDB液体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养增菌，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积百分比10％的接种量接种到大米固体培养基中，于温度28℃培养30天，获得发酵物；
(2)浸膏提取
在步骤(1)得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复萃取3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后获得粗浸膏；
(3)化合物的分离制备
将步骤(2)得到的粗浸膏首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为(100:1)～(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到6个组分；将收集的第2个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积百分比为25-100％的乙腈-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到38个组分；将得到的第8个组分采用乙腈与水按体积比34:66的比例混合的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化，获得化合物，其结构如(I)所示
进一步，步骤(1)中所述的大米培养基的配制方法如下：将90g大米、25g海盐溶于110mL海水中配制而成。
进一步，步骤(1)中所述的PDB液体培养基的配制方法如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蛋白胨5克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克溶于1000ml海水中配制而成；所述的PDA固体培养基的配制方法如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蛋白胨5克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克、琼脂粉18克溶于1000ml海水中配制而成。
进一步，步骤(3)所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1。
进一步，步骤(3)中所述的反相中压柱层析梯度洗脱中乙腈体积百分比从25～100％，洗脱时间200min。
进一步，步骤(3)中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0mL/min。
3、上述七元环吲哚萜类化合物在制备白色念珠球菌和细胞株抑制剂方面的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明分离出一种七元环吲哚萜类化合物，通过微生物发酵培养来获取吲哚萜类的发酵物，然后通过将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取，得粗浸膏，然后将该粗浸膏经中压正向硅胶柱层析，中压反向柱层析，及反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，此外通过抗真菌活性的筛选，发现该化合物具有有效的抗白色念珠球菌活性与对细胞株具有有效的抑制作用，可用于抑制由白色念珠球菌引起的相关人体上呼吸道真菌感染的药物开发方面的用途。
上述球孢枝孢菌YS3-1-5(Cladosporium sphaerospermum YS3-1-5)，于2014年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2014098，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为本发明化合物的核磁共振氢谱；
图2为本发明化合物的核磁共振碳谱
图3为本发明化合物的核磁共振DEPT-135谱；
图4为本发明化合物的核磁共振COSY谱；
图5为本发明化合物的核磁共振HSQC谱；
图6为本发明化合物的核磁共振HSQC谱；
图7为本发明化合物的核磁共振NOESY谱；
图8为本发明化合物的ECD绝对构型拟合曲线图1；
图9为本发明化合物的ECD绝对构型拟合曲线图2。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种七元环吲哚萜类化合物的结构式如(I)所示：
实施例2
如实施例1结构式(I)所示的吲哚萜类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2014098的球孢枝孢菌(CladosporiumsphaerospermumYS3-1-5)在PDA固体培养基的平板上划线，于28℃培养箱中培养活化7天后，挑取单菌落接种于PDB液体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养增菌，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积比10％的接种量接种到大米培养基中，于温度28℃培养30天，获得发酵物，其中大米培养基的配制方法如下：将90g大米、25g海盐溶于110mL海水中配制而成；PDB液体培养基的配制方法如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蛋白胨5克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克溶于1000ml海水中配制而成；PDA固体培养基的配制方法如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蛋白胨5克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克、琼脂粉18克溶于1000ml海水中配制而成；
(2)浸膏提取
在步骤(1)得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复浸泡3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，获得粗浸膏；
(3)化合物的分离制备
首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为(100:1)～(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液(石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1)为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到6个组分；将收集的第2个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积百分比为25-100％的乙腈-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到38个组分；将得到的第8个组分采用乙腈与水按体积比34:66的比例混合的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化获得化合物，其结构如(I)所示：
实施例3
化合物的结构鉴定及核磁信号归属
本发明化合物Ⅰ为白色粉末，正离子模式下的高分辨质谱(HR-ESI-MS)给出其准分子离子峰m/z 536.3376[M+H]+。结合13C NMR谱确定其分子式为C33H45NO5，通过对化合物I的1H-1H偶合常数和NOESY数据的分析，见图1至图7。确定3，4，9，12与18，20的相对构型，绝对构型通过NMR进行模拟计算，最后用ECD模拟计算数据与实际ECD数据验证一致，见图8和9。因此化合物I的绝对构型归属为3S,4R,9S,12S,18R,20S。
该化合物的1H和13C NMR谱数据见表1：
表1.化合物I的1D NMR数据(DMSO-d6,δin ppm,J in Hz)
注1：s—单重峰、d—二重峰、t—三重峰、q—四重峰、m—多重峰；
注2：1H在600MHz NMR获得；13C在150MHz NMR获得。
实施例4
实施例1所述吲哚萜类化合物抗真菌活性及应用
(1)实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物Ⅰ纯品，精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液供测试抗真菌活性。该实验使用的指示菌为白色念珠球菌(ATCC10231)。
(2)实验方法
牛津杯法抗真菌测试方法：将100μL的孢子悬浮液均匀涂在PDA板上，在板中央放置牛津杯。牛津杯中分别加入100μL的不同浓度的化合物溶液，浓度为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL。以DMSO为阴性对照，同时以相同浓度的咪鲜胺作阳性对照。在28℃下培养5d后观察真菌生长情况，每个处理设4个培养板，整个实验重复3次。
(3)实验结果
牛津杯法抗真菌测试中，化合物Ⅰ对白色念珠球菌(ATCC10231)的MIC被确定为64μg/mL。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种七元环吲哚萜类化合物，其特征在于该吲哚萜类化合物的结构式如(I)所示；
2.一种权利要求1所述的七元环吲哚萜类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2014098的球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum
YS3-1-5)在PDA固体培养基的平板上划线，于28℃培养箱中培养活化7天后，挑取单菌落接种于PDB液体培养基中，于温度28℃、180rpm/min的转速下置于摇床上培养増菌，培养3天后收集种子液，然后将种子液按体积比10％的接种量接种到大米固体培养基中，于温度28℃培养30天，获得发酵物；
(2)浸膏提取
在步骤(1)得到的发酵物加入等量乙酸乙酯，反复浸泡3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后，获得粗浸膏；
(3)化合物的分离制备
将步骤(2)得到的粗浸膏首先用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为(100:1)～(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按馏分极性由小到大排列，合并得到6个组分；将收集的第2个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为25-100％的乙腈-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按馏分极性由大到小排列，合并得到38个组分；将得到的第8个组分采用乙腈与水按体积比34:66的比例混合的溶液为流动相，经半制备反相高效液相色谱分离纯化，获得化合物，其结构如(I)所示：
3.根据权利要求2所述的一种七元环吲哚萜类化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的大米培养基的配制方法如下：将90g大米、25g海盐溶于110mL海水中配制而成。
4.根据权利要求2所述的一种七元环吲哚萜类化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的PDB液体培养基的配制方法如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蛋白胨5克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克溶于1000ml海水中配制而成；所述的PDA固体培养基的配制方法如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蛋白胨5克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克、琼脂粉18克溶于1000ml海水中配制而成。
5.根据权利要求2所述的一种七元环吲哚萜类化合物的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1。
6.根据权利要求2所述的一种七元环吲哚萜类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的反相反相中压柱层析梯度洗脱中乙腈体积百分比从25～100％，洗脱时间200min。
7.根据权利要求2所述的一种七元环吲哚萜类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0mL/min。
8.一种权利要求1所述的七元环吲哚萜类化合物在制备白色念珠球菌抑制剂的用途。
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