CN114839299A - 一种二糖类化合物分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种二糖类化合物分析方法，它涉及医药检测领域，本发明的目的是提供一种高灵敏度、稳定性佳的乳果糖溶液有关物质分析方法。其色谱条件为：色谱柱采用氨丙基色谱柱；磷酸二氢钠溶液‑乙腈(10：90～30：70)，等度洗脱；柱温为30℃～50℃；流速为0.5mL/min～30mL/min；进样量20μl；采用检测器为示差折光检测器(RID)，检测器温度30℃～50℃；样品浓度1mg/mL～100mg/mL。本发明具有检测灵敏度高、重现性好、稳定性高等优点，适用于乳果糖有关物质检验。
Description
技术领域
本发明涉及医药检测领域，具体涉及一种二糖类化合物分析方法。
背景技术
乳果糖，别名4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖，人工合成化合物，是由半乳糖与果糖组成的二糖。与乳糖是同分异构体。乳果糖成品为淡黄色澄明粘稠体，味甜，其结晶体为白色不规则的粉末。因其能调节结肠的生理节律，故能治疗慢性或习惯性便秘，并能用于治疗和预防肝昏迷或昏迷前状态。
乳果糖的检测方法主要有薄层色谱法(thinlayer chromatography，TLC)、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)、气相色谱法(gaschromatography，GC)、分光光度法(spectrophotometry)以及离子色谱法(ionschromatography，IC)等。其中薄层色谱法具有微量、快速、分离效率高和灵敏度高等优点，但该方法只能作为定性不能作为定量分析，因此不适用于药品质量控制。气相色谱法检测灵敏度低，受检测样品沸点的制约，方法有很大的局限性。离子色谱法灵敏度虽然高，检测限为0.02mg/L，但离子色谱仪的普及程度限制了该方法的应用。气相色谱法检测乳果糖峰型拖尾，分离效果差，影响检测结果。
高效液相色谱法检测乳果糖，有使用蒸发光检测器检测(HPLC-ELSD)，有使用示差折光检测器检测(HPLC-RID)。其中，蒸发光检测器检测(HPLC-ELSD)检测乳果糖含量收到流动相选择的限制，灵敏度不够高，线性范围窄等方面的限制，难以达到药品质控方面的要求。
药品开发过程中质量控制的关键项目为有关物质检测，目前乳果糖有关物质的分离效果不好，依匹乳糖和乳果糖在液相系统中色谱行为相似，保留时间比较接近，分离度为1.0左右，未能有效分离。目前各国药典收载的乳果糖有关物质检测方法检测方法均很难将依匹乳糖与乳果糖进行有效分离，且重现性不好，方法检测灵敏度较低。
发明内容
本发明开发一种二糖类化合物分析方法，以解决目前检测二糖类化合物的杂质分离效果差且重现性差，检测灵敏度低的问题。
本发明的一种二糖类化合物分析方法，它是按照以下步骤进行的：
步骤一，供试品溶液制备
取二糖类化合物，加水溶解，得浓度为1～100mg/mL的供试品溶液；
步骤二，取步骤一制备的供试品溶液，用稀释剂溶解，得浓度为0.1～50mg/mL的溶液；进行高效液相色谱分析：
色谱条件为：采用氨丙基色谱柱；流动相为磷酸二氢钠溶液-乙腈，其中，磷酸二氢钠溶液与乙腈的体积比为10：90～30：70，等度洗脱；柱温为30℃～50℃；流速为0.5mL/min～3.0mL/min；进样量20μL；检测器类型为示差折光检测器，检测器温度30℃～50℃；样品浓度0.1～50mg/mL。
进一步地，所述的二糖类化合物为4E-3-脱氧-2-氧化呋喃戊糖、塔格糖、果糖、半乳糖、乳果糖、乳糖中的一种或几种。
进一步地，所述的配制检测用流动相的缓冲盐溶液为醋酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾中的一种或几种，与甲醇、乙腈的一种或两种混合。
进一步地，所述的供试品溶液浓度5～50mg/mL。
进一步地，所述的色谱柱型号为赛默飞世尔APS-2Hypersil 50×4.6mm，3μm或赛默飞世尔APS-2Hypersil 150×4.6mm，3μm，或沃特世SPHERISORB 4.6×250mm，5μm或CAPCELL PAK 4.6×250mm，5μm氨丙基柱或Agela technologies 4.6×250mm，5μm氨丙基柱的一种或几种联合或单独使用。
进一步地，高效液相色谱的系统适用性溶液制备如下：取二糖类化合物系统适用性对照品，加入果糖，加水稀释至40mg/mL，得到系统适用性溶液。
进一步地，所述的高效液相色谱的系统适用性溶液为注入液相色谱仪后，色谱图中乳果糖峰与乳糖峰分离度大于1.5；依匹乳糖与乳果糖之间的峰谷比不低于5.0，理论塔板数以乳果糖峰计算不低于2000；所述的系统适用性溶液选用的二糖类化合物为4E-3-脱氧-2-氧化呋喃戊糖、塔格糖、果糖、半乳糖、乳果糖、乳糖的混合物。
进一步地，高效液相色谱的检测系统灵敏度溶液制备：取供试品溶液，加水稀释，得浓度为0.005～0.5mg/mL的溶液。
进一步地，灵敏度溶液注入液相色谱仪后，色谱图中乳果糖峰的信号与噪声比值大于10，以表明系统灵敏度符合检测要求。
进一步地，所述的样品浓度1～30mg/mL。
本发明包含以下有益效果：
本发明针对一种二糖类化合物中可能产生的降解杂质及部分工艺杂质进行分离，具体包括以下杂质：4E-3-脱氧-2-氧化呋喃戊糖(C5H10O4)、塔格糖(C6H12O6)、果糖(C6H12O6)、半乳糖(C6H12O6)、乳果糖(C12H22O11)、乳糖(C12H22O11)。本发明优化一种二糖类化合物的分析方法，具有检测灵敏度高、重现性好、分离效果好等优点，适用于二糖类有关物质检验。
附图说明
图1系统适用性图谱；
图2为采用沃特斯色谱柱的检测图谱；
图3为采用安捷伦色谱柱的检测图谱；
图4为采用艾杰尔色谱柱的检测图谱；
图5为25℃柱温的检测图谱；
图6为30℃柱温的检测图谱；
图7为35℃柱温的检测图谱；
图8为45℃柱温的检测图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
1)系统适用性溶液的制备
取乳果糖EP系统适用性对照品约1g，置25mL量瓶中，加入果糖对照品约20mg，加水溶解并稀释至刻度，混匀。
2)供试品溶液制备
取乳果糖溶液约2g，置25mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀(约含乳果糖浓度为40mg/mL)。
3)对照溶液制备
精密量取对照品溶液5mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，混匀(约含乳果糖浓度2mg/mL)。
4)灵敏度溶液制备
取上述对供试品溶液0.5mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，混匀(约含乳果糖浓度0.2mg/mL)。
实施例2
本实施例为乳果糖的分析方法采用的色谱条件的优化与测定
(1)检测器(RID)温度
检测器(RID)温度40℃时，检测基线比较稳定，能获得稳定的检测结果，该温度条件下检测，灵敏度溶液信噪比大于10，符合要求。
(2)最佳色谱条件
色谱柱：CAPCELL PAK卡赛帕克(4.6×250mm，5μm)氨丙基柱与Agelatechnologies博纳艾杰尔(4.6×250mm，5μm)氨丙基柱串联，加鬼峰捕集柱(品牌为：色谱先生，50mm)；流动相为磷酸二氢钠(1.15g→1000mL)：乙腈(20：80)。柱温40℃，检测器类型为示差折光检测器(RID)，检测器温度为40℃，进样量20μL，样品浓度40mg/mL，流速为1.5mg/mL。
通过图1至图8可以确定出上述最佳的检测柱温，以及最佳色谱条件。
(3)方法学验证
采用上述最佳色谱条件对实施例1的供试品进行验证。
1)检测限和定量限取乳果糖溶液约2g(含乳果糖约1g)，置25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；取出适量，逐级稀释至样品溶液信噪比大于10为定量限，结果为2ng，信噪比大于3为检测限，结果为1ng。
2)线性取乳果糖对照品约250mg，精密称定，置25mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液，精密量取0.1mL、1mL、2mL、3.6mL、6mL，分别置10mL量瓶中，用水稀释至刻度，作为线性溶液，采用本实施例所述的色谱条件进行测定，以浓度C为横坐标，以峰面积A为纵坐标进行线性回归，回归方程为A＝114291C+17210，相关系数R＝0.9995。
3)精密度分别于不同日期、由不同分析人员、用不同设备按上述检测条件测定精密度，进行6次测定，计算12次供试品溶液各个单杂及总杂质的相对标准偏差，结果见表1，精密度小于10.0％。
4)系统适用性按系统适用性试验要求，在本实施例所述的色谱条件下测定系统适用性溶液，出峰顺序依次为杂质F、塔格糖、果糖、半乳糖、杂质G、依匹乳糖、乳果糖、乳糖和杂质H，乳果糖峰与依匹乳糖之间分离度大于1.0，乳果糖峰与乳糖峰的峰谷比大于5.0，其余各杂质之间分离度均大于1.5，理论塔板数以乳果糖峰计算不低于2000。
5)室温溶液稳定性在本实施例所述的色谱条件下，加水制成供试品溶液，在室温下放置，每间隔2小时进样检查，结果见表2，通过表2可以看出，乳果糖溶液在室温条件下放置28小时后，依匹乳糖峰面积的RSD为14.7％，超过10.0％，说明乳果糖供试品溶液在室温条件放置28小时内检测完毕。
6)5℃溶液稳定性在本实施例所述的色谱条件下，加水制成供试品溶液，在5℃下放置，每间隔2小时进样检查，结果见表3，通过表3可以看出，乳果糖供试品溶液在5℃条件下放置28小时后，其单个杂质峰面积的RSD均小于10.0％，说明，乳果糖供试品溶液在5℃条件下放置28小时稳定。
7)杂质回收率在本实施例所述的色谱条件下，供试品溶液中分别加入约相当于限度浓度50％、100％、120％的杂质储备液，每一浓度平行配制3份，考察各杂质回收率，结果见表4，通过表4可以看出，各杂质的回收率均在90.0％～108.0％范围内，回收率良好。
8)耐用性取乳果糖供试品溶液，通过将本实施例所述的色谱条件的柱温、流动相中乙腈比例、流速及色谱柱品牌进行小的变动，考察该色谱条件的耐用性，结果表明，上述色谱条件的微小变动不影响乳果糖有关物质检测。
表1精密度结果
表2室温溶液稳定性结果
| 时间 | 杂质F | 半乳糖 | 依匹乳糖 | 乳糖 |
| 0h | 117738.846 | 498469.312 | 70166.242 | 274100.270 |
| 2h | 116957.340 | 507013.363 | 73260.667 | 275308.441 |
| 4h | 118074.045 | 503819.010 | 73987.239 | 275269.846 |
| 6h | 116073.445 | 505684.392 | 77859.200 | 274175.470 |
| 8h | 114369.101 | 505923.753 | 80859.569 | 270565.934 |
| 10h | 114754.890 | 503994.538 | 76912.423 | 270858.457 |
| 12h | 111900.264 | 504427.549 | 75310.812 | 268604.435 |
| 14h | 110853.609 | 502414.833 | 77611.183 | 261708.516 |
| 16h | 113182.679 | 505464.796 | 79419.045 | 264317.735 |
| 18h | 114348.825 | 504282.793 | 72168.992 | 267639.920 |
| 20h | 109453.629 | 504893.658 | 71440.477 | 258048.823 |
| 22h | 94420.162 | 505066.544 | 68420.057 | 238721.427 |
| 24h | 94078.644 | 493493.382 | 62561.170 | 230056.739 |
| 26h | 94233.701 | 498440.933 | 48895.204 | 221134.914 |
| 28h | 91972.110 | 500204.816 | 46513.936 | 219645.373 |
| 平均值 | 108827.419 | 502906.245 | 70359.081 | 258010.420 |
| RSD | 9.0％ | 0.8％ | 14.7％ | 7.9％ |
表3 5℃溶液稳定性结果
| 时间 | 杂质F | 半乳糖 | 依匹乳糖 | 乳糖 |
| 0h | 123893.006 | 427843.150 | 113458.211 | 267683.085 |
| 2h | 128069.518 | 422240.427 | 137222.377 | 279667.326 |
| 4h | 128646.365 | 423643.844 | 128460.264 | 292815.042 |
| 6h | 132036.401 | 441047.697 | 126197.589 | 274515.676 |
| 8h | 132874.149 | 452984.164 | 124748.861 | 281879.682 |
| 10h | 130495.896 | 437058.312 | 141295.792 | 288558.712 |
| 12h | 128351.426 | 432443.351 | 143134.790 | 289262.175 |
| 14h | 122250.134 | 439188.166 | 139272.273 | 295926.521 |
| 16h | 130937.722 | 457153.878 | 126331.339 | 289134.331 |
| 18h | 128475.160 | 452854.078 | 138968.603 | 298904.730 |
| 20h | 130173.445 | 454039.538 | 120868.786 | 287005.732 |
| 22h | 125939.390 | 454264.269 | 123261.279 | 298322.792 |
| 24h | 126001.702 | 456771.341 | 122673.449 | 279353.559 |
| 26h | 132621.298 | 459110.019 | 115130.921 | 279582.417 |
| 28h | 125658.191 | 449030.941 | 100994.953 | 277977.857 |
| 平均值 | 128428.254 | 443978.212 | 126801.299 | 285372.642 |
| RSD | 2.5％ | 2.9％ | 9.3％ | 3.2％ |
表4收率结果
Claims (10)
1.一种二糖类化合物分析方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
步骤一，供试品溶液制备
取二糖类化合物，加水溶解，得浓度为1～100mg/mL的供试品溶液；
步骤二，取步骤一制备的供试品溶液，用稀释剂溶解，得浓度为0.1～50mg/mL的溶液；进行高效液相色谱分析：
色谱条件为：采用氨丙基色谱柱；流动相为磷酸二氢钠溶液-乙腈，其中，磷酸二氢钠溶液与乙腈的体积比为10：90～30：70，等度洗脱；柱温为30℃～50℃；流速为0.5mL/min～3.0mL/min；进样量20μL；检测器类型为示差折光检测器，检测器温度30℃～50℃；样品浓度0.1～50mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于所述的二糖类化合物为4E-3-脱氧-2-氧化呋喃戊糖、塔格糖、果糖、半乳糖、乳果糖、乳糖中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于配制流动相的缓冲盐溶液为醋酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾中的一种或几种，与甲醇、乙腈的一种或两种混合。
4.根据权利要求1所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于所述的供试品溶液浓度5～50mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于所述的色谱柱型号为赛默飞世尔APS-2Hypersil 50×4.6mm，3μm或赛默飞世尔APS-2Hypersil 150×4.6mm，3μm，或沃特世SPHERISORB 4.6×250mm，5μm或CAPCELL PAK 4.6×250mm，5μm氨丙基柱或Agela technologies 4.6×250mm，5μm氨丙基柱的一种或几种联合或单独使用。
6.根据权利要求1所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于高效液相色谱的系统适用性溶液制备如下：取二糖类化合物系统适用性对照品，加入果糖，加水稀释至40mg/mL，得到系统适用性溶液。
7.根据权利要求6所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于所述的高效液相色谱的系统适用性溶液为注入液相色谱仪后，色谱图中乳果糖峰与乳糖峰分离度大于1.5；依匹乳糖与乳果糖之间的峰谷比不低于5.0，理论塔板数以乳果糖峰计算不低于2000；所述的系统适用性溶液选用的二糖类化合物为4E-3-脱氧-2-氧化呋喃戊糖、塔格糖、果糖、半乳糖、乳果糖、乳糖的混合物。
8.根据权利要求1所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于高效液相色谱的检测系统灵敏度溶液制备：取供试品溶液，加水稀释，得浓度为0.005～0.5mg/mL的溶液。
9.根据权利要求8所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于灵敏度溶液注入液相色谱仪后，色谱图中乳果糖峰的信号与噪声比值大于10。
10.根据权利要求1所述的一种二糖类化合物分析方法，其特征在于所述的样品浓度1～30mg/mL。
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| CN102166216A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-08-31 | 四川健能制药有限公司 | 一种乳果糖口服溶液及其质量控制方法 |
| CN104597171A (zh) * | 2013-10-31 | 2015-05-06 | 江苏万邦生化医药股份有限公司 | 阿卡波糖及其制剂的高效液相色谱分析方法 |
| CN107315053A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-11-03 | 南京威尔药业股份有限公司 | 一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法 |
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2022
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