CN114813270B - 一种血液促凝剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物材料技术领域，具体公开了一种血液促凝剂及其制备方法和应用。该血液促凝剂包括纳米二氧化硅、乙烯基吡咯烷酮‑醋酸乙烯酯共聚物、聚乙二醇硬脂酸酯和溶剂；其中，纳米二氧化硅：乙烯基吡咯烷酮‑醋酸乙烯酯共聚物：聚乙二醇硬脂酸酯的质量比为1‑5：1：1‑10。本发明制备得到的血液促凝剂凝血时间短、获得的血清质量高；能进行辐照灭菌，且经辐照灭菌和老化等处理后的产品均与处理前的产品性能相当；有效期延长至1年的同时不影响产品性能，存放过程中无沉降、结块现象；能够满足临床上检测的需要。

Description

一种血液促凝剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种血液促凝剂及其制备方法和应用。

背景技术

临床医学检验是临床诊断的主要手段，在临床检验的样本中，80％为静脉血液样本，其中，超过60％是从静脉血中分离出的血清样本。血清标本是指血液凝固后，通过高速离心，将血细胞及纤维蛋白网离至下部后，上部的清液部分。所以，血清获得的前提是血液充分凝固，血液凝固的发生是血液离体后，受外部因素刺激而产生的复杂变异过程。目前在临床检验中的静脉血通常是通过真空采血的方式采集，真空采血管的材质分玻璃和有机高分子两种。常温下，空白的玻璃采血管采集的血液完全凝固大约需要2小时，而高分子采血管则需要4小时以上的时间。一般无法满足实验室检验的需求，尤其是对于急诊病人，获取高质量、无离体变异的血清样本是实现快速、准确诊断的前提。

临床上在进行血清生化检测时，会向血液中加入促凝剂以缩短凝血时间。目前，进口液体促凝剂的凝血效果较好但成本昂贵，无疑会加重患者负担，因此，有必要开发新一代的能达到国际先进水平的血液促凝剂，用以替代进口，节约医疗成本。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种血液促凝剂及其制备方法和应用。本发明制备得到的血液促凝剂在使用时无需与采集样本进行混匀步骤，凝血时间短、获得的血清质量高；能进行辐照灭菌，且经辐照灭菌和老化等处理后的产品均与处理前的产品性能相当；有效期延长至1年的同时不影响产品性能，存放过程中无沉降、结块现象。

本发明的第一方面，提供一种血液促凝剂，包括纳米二氧化硅、乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物、聚乙二醇硬脂酸酯和溶剂。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米二氧化硅：所述乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物：所述聚乙二醇硬脂酸酯的质量比为1-5：1：1-10，例如2-5：1：2-10、3-5：1：3-10、4-5：1：4-10、4-5：1：5-10、4-5：1：6-10、4-5：1：8-10，优选4-5：1：8-10。

在该配比范围下，血液促凝剂可以达到均相乳化的最佳效果，否则可能造成乳化不均或过度乳化的情况。

根据本发明实施方式的血液促凝剂，至少具备如下有益效果：

本发明采用适量的纳米二氧化硅激活血小板，纳米二氧化硅的粒径小，比表面积大，分散性能好，纳米二氧化硅碰撞血小板后，带负电荷的纳米二氧化硅能够与血浆中的纤维蛋白原相结合，使纤维蛋白原展开，缩短凝血酶原时间，发挥促凝作用。另外，纳米二氧化硅可将羟基所带的负电荷快速转移至血小板激活，凝血效率高。凝血过程的进行使得纳米二氧化硅逐步分散，因此无需借助摇匀步骤。此外，也不会造成溶血现象。

聚乙二醇硬脂酸酯作为分散剂使用，可以改善血液促凝剂的沉降性能，防止血液促凝剂久置后出现结块现象，有利于延长血液促凝剂的有效期。另外，聚乙二醇硬脂酸酯与乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物搭配使用，通过引入羟基，提高成膜物的水溶速度，避免游离纤维蛋白丝在此过程中的挂壁悬浮，提高促凝剂的效果。使得制得的血液促凝剂具有优异的耐辐照性能，同时有助于快速复溶均相体系的建立，使得凝血过程在采血管内各处均匀启动，纤维蛋白原转化为纤维蛋白丝与纤维蛋白网络同步快速形成，有效避免挂壁现象，保证了血清质量，且使用过程中无需进行混匀。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米二氧化硅由二氧化硅加水后，通过超声或者均质的方式混匀后再进行研磨得到，所得纳米二氧化硅为单分散形；进一步，所得的纳米二氧化硅还需经环氧乙烷灭菌处理，以防止细菌生增。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米二氧化硅的粒径范围为300-360nm。

本发明采用300-360nm范围内的纳米级颗粒，远小于某些免疫诊断试剂包覆的磁微球，便于分析仪器识别，不会对免疫项目的检测造成干扰。该粒径范围为由多次实验得出的能够激发凝血因子的最优选，粒径更小可能会影响钠钾检测值的准确性。

在本发明的一些实施方式中，所述乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物为线性共聚物。其中，乙烯基吡咯烷酮单元与醋酸乙烯酯单元的重量比为4：6-6：4，优选5：5。

在本发明的一些实施方式中，所述乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物的数均分子量为2000-4000，优选2000-3500，更优选2000-3000。

乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物作为成膜物，其在水中的溶解速度与分子量和羟基含量有关。本发明选取数均分子量为2000-4000的乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物，通过添加醋酸乙烯酯单体，其在水解后生成的乙烯醇中含有羟基，羟基结构有助于提高水溶速度，从而建立快速复溶的均相分散体系。

在本发明的一些实施方式中，所述聚乙二醇硬脂酸酯为聚乙二醇400单十八酸酯和/或聚乙二醇400双硬脂酸酯，优选聚乙二醇400单十八酸酯。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米二氧化硅与所述溶剂的重量比为1：10-15。

在本发明的一些实施方式中，所述溶剂为水和/或乙醇。

在本发明的一些实施方式中，在所述溶剂为乙醇水溶液时，其中乙醇的重量百分比为5-10％，优选5-8％。

乙醇为一种极性溶剂，遇热易挥发，在真空采血管及其他非真空容器生产过程中，血液促凝剂是喷涂在采血容器内壁的，喷涂后有一个干燥过程，乙醇遇热快速挥发的属性正好可以满足生产工艺的需求。

本发明的第二方面，提供上述血液促凝剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述纳米二氧化硅、乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物、聚乙二醇硬脂酸酯和溶剂按比例混合。

在本发明的一些实施例中，所述混合后还进行过筛。进一步，所述过筛为过200-300目筛。

本发明的第三方面，提供上述的血液促凝剂在制备血液采集容器中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述血液促凝剂的用量为10-15mg：3000-4000mm²，例如12-15mg：3000-4000mm²、10-15mg：3000-3500mm²、12-15mg：3000-3500mm²。

在本发明的一些实施例中，所述血液采集容器中添加分离胶。

在本发明的一些实施例中，所述分离胶与所述血液促凝剂的质量比为100-200：1，例如100-180：1、100-160：1、100-140：1、120-200：1、120-180：1、120-160：1、120-140：1、140-200：1、140-180：1、140-160：1，优选120-160：1。

本发明的第四方面，提供一种血液采集容器的制备方法，包括以下步骤：

将血液促凝剂涂布于添加有分离胶的血液采集容器内壁，进一步，还包括抽真空，辐照。

有益效果：

本发明的血液促凝剂凝血时间短，耐辐照性能优异，无挂壁和纤维蛋白二次析出现象，存放时间延至1年也不出现沉降、结块现象，有利于长期存放和销售。且为液体状态，可以方便地定量喷雾加至血液采集容器中，干燥后可均匀分布于容器内壁，便于采血后的血液促凝剂复溶。另外，现有的血液促凝剂在使用时，大多都必须进行混匀操作，否则会造成接近试管壁部分与血液中心位置的浓度差，血液凝集不均衡从而导致纤维蛋白的残留，严重影响血清的质量，而本发明的血液促凝剂无需与血液样本进行混匀。本发明制得的血液采集容器在喷涂血液促凝剂前无需进行硅化，在喷涂血液促凝剂后也无需烘干处理。

本发明制备的血液促凝剂除用于通常的生化检验项目之外，还可用于免疫诊断的检验项目。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，其中：

图1为本发明制备的分离胶促凝管于室温放置1年后的临床性能评价结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例

本发明的纳米二氧化硅购自韶关市连邦环保新材料股份有限公司，粒径为800-1000nm，批号210812。

乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物购自韶关市连邦环保新材料股份有限公司，批号210825；分子量为2000-3000，其中，乙烯基吡咯烷酮单元与醋酸乙烯酯单元的重量比为5：5。

聚乙二醇硬脂酸酯为聚乙二醇(400)单十八酸酯，CAS号：9004-99-3，购自韶关市连邦环保新材料股份有限公司，批号210830。

G5分离胶为南雄阳普医疗科技有限公司生产的分离胶，积水分离胶与BD管均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明研发所需生产设备主要包括：纳米分散研磨机、冷冻机、动力混合机、洁净空调系统、动力锅炉设备、搅拌机、精密天平、TL-2000C自动旋转振荡仪(带定时器)。

本发明研发所需检测设备主要包括：岛津液相色谱仪、旋转粘度计、雷磁精密PHS-3型pH计、离心机、数显恒温水浴锅、电热鼓风恒温干燥箱。

实施例1血液促凝剂的制备

先将6.4g经环氧乙烷灭菌处理的二氧化硅与6.96mL的水采用超声或者均质的方法混合均匀，通过锆珠研磨机系统制备得到单分散形二氧化硅母液。取5g乙醇加入1.36g乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物，搅拌10min，再加入12.8g的聚乙二醇硬脂酸酯，搅拌10min后，加入二氧化硅母液以及67.48mL的水，搅拌30min。经250目筛精细过滤，即得。

实施例2血液促凝剂的分散性检测

经目视法观察，制备得到的血液促凝剂呈悬浮液体，溶质粒子均匀分散在溶液中，无结块，无粗大粒子团聚，经250目过筛后无颗粒残留。

实施例3血液促凝剂的粒度分布检测

量取1mL血液促凝剂溶解到45mL纯净水中，采用马尔文Nano S90激光粒度仪，测得血液促凝剂中颗粒平均粒径在300～360nm范围内。

实施例4血液促凝剂的耐辐照性检测

本发明制备得到的血液促凝剂能耐受26.2kGy-28.8kGy Co60γ射线照射16小时34分钟；将其做成采血管后，经辐照后的采血管在室温进行采血，所得血清呈淡黄透明、无溶血、无纤维蛋白丝挂壁、无二次析出。

实施例5血液促凝剂的长期稳定性试验

通过对3批次生产的血液促凝剂进行稳定性试验，考察血液促凝剂在温度、湿度的影响下随时间变化的规律，为促凝剂的生产、包装、储存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立血液促凝剂的有效期。

稳定性试验抽取的三批生产样品分别为181012、181014、181015，每份样品收取5瓶，每瓶1000mL。且抽取样品批次的生产工艺相同。共取样5次，每次一瓶，周期为12个月，具体取样时间点为0月、3月、6月、9月、12月。

检测项目：根据促凝剂的质量标准的规定，此次稳定性试验的检测项目共4项，分别为：

(1)外观，检测指标为：溶液呈白色悬浮液体；检测方法为：充分搅拌后，目视观察溶液性状；

(2)pH值，检测指标为：25℃，4.0～7.0；检测方法为：充分摇匀待检瓶内的溶液后，取适量样品于烧杯中，调节至25℃，用pH计测定溶液的pH值；

(3)固含量，检测指标为：21％～23％；检测方法为：血液促凝剂充分摇匀后，用移液管取2～3mL悬浮液体，经过105℃±l℃烘箱中干燥2小时后，计算剩余部分占总量的质量百分比；

(4)微生物，检测指标为：菌落数＜100CFU/mL；检测方法为：充分摇匀待检瓶内的溶液后，按照微生物的检验方法，检验溶液的初始污染菌。

血液促凝剂在储存过程中，底部容易产生沉淀导致外观发生改变，结块的出现还会导致分散不均匀，测量时固含量发生改变。且血液促凝剂长期存放易滋生微生物，微生物代谢产物的积累会导致pH值发生改变。因此，检测上述指标的变化情况可用于分析血液促凝剂的质量和有效性。

血液促凝剂长期稳定性试验数据变化趋势及评估结果见表1。

表1

结果表明，三批次血液促凝剂的外观在长期稳定性试验期内未发生变化，经充分搅拌后，溶液呈白色悬浮液体，无结块；固含量在长期稳定性试验期内的变化较小，且都符合促凝剂固含量标准；pH值在长期稳定性试验期内的变化较小，且都符合pH值检测标准，总体范围在4～7之间；微生物在长期稳定性试验期内的变化较小，且都符合微生物检测标准；说明血液促凝剂的物理性质比较稳定。

实施例6血液促凝剂的加速老化稳定性试验

通过对生产的3批次血液促凝剂进行加速老化60天稳定性试验，以考察血液促凝剂在温度、湿度的影响下随时间变化的规律，为促凝剂的生产、包装、储存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立血液促凝剂的有效期。

稳定性试验抽取的三批生产样品分别为190812、190814、190815，每份样品收取4瓶，每瓶200mL。且抽取样品批次的生产工艺相同。共取样4次，每次一瓶，周期为60天，具体取样时间点为0天、20天、40天、60天。

检测项目：根据血液促凝剂的质量标准的规定，此次稳定性试验的检测项目共4项，分别为：

(1)外观，检测指标为：溶液呈白色悬浮液体；检测方法为：充分搅拌后，目视观察溶液性状；

(2)固含量，检测指标为：21％～23％；检测方法为：血液促凝剂充分摇匀后，用移液管取2～3mL悬浮液体，经过105℃±l℃烘箱中干燥2小时后，计算剩余部分占总量的质量百分比；

(3)pH值，检测指标为：25℃，4.0～7.0；检测方法为：充分摇匀待检瓶内的溶液后，取适量样品于烧杯中，调节至25℃，用pH计测定溶液的pH值；

(4)微生物，检测指标为：菌落数＜100CFU/ml；检测方法为：充分摇匀待检瓶内的溶液后，按照微生物的检验方法，检验溶液的初始污染菌。

血液促凝剂在储存过程中，底部容易产生沉淀导致外观发生改变，结块的出现还会导致分散不均匀，测量时固含量发生改变。且血液促凝剂长期存放易滋生微生物，微生物代谢产物的积累会导致pH值发生改变。因此，检测上述指标的变化情况可用于分析血液促凝剂的质量和有效性。

血液促凝剂的加速老化稳定性试验数据变化趋势及评估结果见表2。

表2

以上结果表明，血液促凝剂的外观在加速老化60天稳定性试验期内未发生变化，经充分搅拌后，溶液呈白色悬浮液体，无结块；固含量在加速老化60天稳定性试验期内的变化较小，且都符合促凝剂固含量标准；pH值在加速老化60天稳定性试验期内的变化较小，且都符合pH值检测标准，总体范围在4～7之间；微生物在加速老化60天稳定性试验期内的变化较小，且都符合微生物检测标准；说明血液促凝剂的物理性质比较稳定。

实施例7分促管临床生化检测对比实验

为了检测本发明制备的促凝剂在不同分离胶的组合下，是否有挂壁、溶血等情况出现，对比了搭配不同分离胶时的效果。设置以下5组分组：(1)空白玻璃管(空白管)；(2)添加G5分离胶、本发明血液促凝剂，辐照后室温放置12个月的玻璃采血管(G5-12管)；(3)添加G5分离胶、本发明血液促凝剂，辐照后室温放置0个月的玻璃采血管(G5-0管)；(4)添加积水分离胶、本发明血液促凝剂，辐照后室温放置0个月的玻璃采血管(积水管)；(5)辐照后室温放置0个月的BD分促管(BD管)。

以G5-12管为例，上述各分组中的采血管的制备方法为：

将玻璃管洗净烘干后，使用加胶机器将分离胶加入玻璃管内，分离胶的量与玻璃管的表面积的比为2mL：3367.65mm²，再使用促凝剂喷涂机器进行管内促凝剂喷涂，促凝剂的喷涂量与玻璃管的表面积的比为15mg：3367.65mm²，最后压塞、抽真空，对采血管进行26.2kGy-28.8kGy Co60γ射线照射16小时34分钟，即得。

分别检测上述各组采血管中34项生化免疫指标：

包括25项生化项目：总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白A1(APOA1)、载脂蛋白B(APOB)、尿素(Urea)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、尿酸(UA)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、离子钙(ICa)、钾(K)、钠(Na)、氯化物(Cl)、总钙(Ca)、无机磷(P)、镁(Mg)。

以及9项特异性免疫检测项目：甲胎蛋白定量(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)、绒毛膜促性腺素(ThCG)、总三碘甲状腺原氨酸(T3)、总甲状腺素(T4)、游离三碘甲状腺原氨酸(F-T3)、游离甲状腺素(F-T4)、促甲状腺激素(TSH)。

具体步骤如下：(1)五管平行采集(每个分组各采集一管样本，共5个标本)放置30分钟后，3500转、5分钟离心；(2)取上清，2小时内检测生化免疫项目；(3)选取各塑料管，进行上述34项生化免疫项目的检测，所用仪器、方法名称见表3，记录检测值，统计各种平均相对偏差。

表3各检测项目方法条件记录表

临床生化34项检测结果比较如下，其中，常规生化检测结果见表4。

表4

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特异性免疫检测定量结果见表5。

表5

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表4、5的结果表明，辐照后常温放置0或12个月的添加了G5分离胶与本发明血液促凝剂的采血管，与积水管、BD管、空白玻璃管进行常规生化免疫检测比对后，其相对偏差均小于CLIA’88和卫生部临床检验中心室间质控可接受标准，即在临床生化和免疫检测上实质等同。

实施例8分离胶促凝管室温放置1年临床性能评价

取添加了G5分离胶和本发明血液促凝剂的采血管(采血管已室温放置1年)进行临床采血血清质量(分离效果、胶内夹血、血清油滴等)的稳定性考察，确保添加分离胶-血液促凝剂的采血管在标示的条件下，符合质量标准(如凝血时间、血清质量等)。

采血时间：采血管室温放置，分别取样品进行采血实验检测；采血过程在室温下进行，选择23G(8#)软连接采血针按组别交替的顺序规范采血，采血后在室温静置，观察每支管的全凝时间并记录，待静置约30min，待凝血效果更为稳定后进行上机离心，离心条件为室温，3200rpm，5min，离心后观察血清标本的质量(挂壁、溶血、胶体等情况)并做好记录，具体结果见表6。

表6

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记录采血时间并在采血后观察采血管的凝血情况，结果见表7。其中，DM096为本发明制备得到的血液促凝剂。

表7

采血管全凝后静置30min上机离心，离心条件为3500rpm，5min，具体观察结果见图1和表8。

表8

由表7以及表8中的数据可以看出，通过添加G5分离胶以及本发明血液促凝剂制作而成的分离胶促凝管，常温下可放置12个月，平均凝血时间6分23秒。静置30分钟后上机离心，得到得血清质量良好，无纤维蛋白或血细胞挂壁，无溶血现象，无二次析出，分离胶能很好的隔离血细胞与血清。

一般来说，普通玻璃管pH值较大，容易引起溶血，拉管工艺制作的玻璃管线性沟密布，容易导致细胞挂壁。塑料管通常在管内壁注塑时经过特殊处理，能有效降低血细胞与管壁粘合度，减少纤维蛋白丝的产生。但表7以及表8中的数据证明了本申请制备得到的血液促凝剂无论在采用玻璃管还是塑料管时，均能实现很好的促凝效果，即无挂壁现象以及溶血现象产生。

图1也证实了上述结论，由图1中可以看出，B9、B10、B16、B17、C16、D16、D17管中均可见最上层的血清无纤维蛋白或血细胞挂壁，中间的分离胶与底层的血细胞明显分层。C17管中由于采血量较少，故红细胞较少，且均沉降在底部。

综上，可以认为，添加G5分离胶以及本发明血液促凝剂制成的分离胶促凝管，常温放置12个月仍能满足临床要求。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种血液促凝剂，其特征在于，包括纳米二氧化硅、乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物、聚乙二醇硬脂酸酯和溶剂；

其中，所述纳米二氧化硅：所述乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物：所述聚乙二醇硬脂酸酯的质量比为1-5：1：1-10；

所述乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物的数均分子量为2000-4000。

2.根据权利要求1所述的血液促凝剂，其特征在于，所述纳米二氧化硅的粒径范围为300-360nm。

3.根据权利要求1所述的血液促凝剂，其特征在于，所述乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物中的乙烯基吡咯烷酮单元与醋酸乙烯酯单元的重量比为4：6-6：4。

4.根据权利要求1所述的血液促凝剂，其特征在于，所述聚乙二醇硬脂酸酯为聚乙二醇400单十八酸酯和/或聚乙二醇400双硬脂酸酯。

5.根据权利要求1所述的血液促凝剂，其特征在于，所述纳米二氧化硅与所述溶剂的重量比为1：10-15。

6.根据权利要求1所述的血液促凝剂，其特征在于，所述溶剂为乙醇水溶液。

7.根据权利要求1所述的血液促凝剂，其特征在于，所述溶剂中，乙醇的重量百分比为5-10％。

8.权利要求1-7中任一项所述的血液促凝剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述纳米二氧化硅、乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物、聚乙二醇硬脂酸酯和溶剂按比例混合。

9.如权利要求1-7中任一项所述的血液促凝剂在制备血液采集容器中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述血液促凝剂的用量为10-15mg/3000-4000mm²。