CN114773448A - 重组κ-酪蛋白及其制备方法和人造乳 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人工设计构建κ‑酪蛋白的方法，通过计算机辅助分析乳蛋白的表面可及性与抗原指数氨基酸区域，结合乳蛋白晶体结构数据与Schema同源结构域重组策略构建低致敏性优良κ‑酪蛋白分子。实验结果表明，本发明获得降低致敏原的优化乳蛋白分子，实现靶标κ‑酪蛋白全局优化与高效合成。

Description

重组κ-酪蛋白及其制备方法和人造乳

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体地，涉及一种重组κ-酪蛋白、编码该重组κ-酪蛋白的基因、插入有该基因的重组表达载体、导入有该重组表达载体的转化体、制备该重组κ-酪蛋白的方法以及一种人造乳。

背景技术

目前，乳制品的需求量不断增加，天然动物奶及其乳制品是最理想的蛋白营养来源，其营养成分主要是乳蛋白，同时还含有生物活性肽、脂肪、乳糖、维生素和矿物质等。

但是，因含有各种致敏原，天然动物奶是婴幼儿群体中排在首位的致敏源食物。牛奶及其乳制品是FAO和WHO认定的导致人类食物过敏的主要食品之一。目前，牛奶中已知的主要致敏原包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β乳球蛋白和β-酪蛋白等。

目前，牛乳过敏人群中约有65％对酪蛋白过敏，野生型的κ-酪蛋白仍然具有较高的致过敏性。

发明内容

本发明的目的在于降低κ-酪蛋白的致过敏性。

本发明的发明人通过对κ-酪蛋白的序列和晶体结构进行分析，基于多序列比对和系统发育分析，利用同源结构元件交叉重组策略对乳蛋白按功能域分割与创建重组蛋白文库，替换或消除致敏序列和表观位点，计算蛋白分子自由能稳定系数，完成乳蛋白进行理性设计与定向进化，实现基于应用属性的乳蛋白序列全局优化，得到了具有较低致过敏性的κ-酪蛋白。

为了实现上述目的，本发明提供了一种重组κ-酪蛋白，所述重组κ-酪蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码如上所述的重组κ-酪蛋白的基因。

可选地，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的重组κ-酪蛋白的表达框。

可选地，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种转化体，所述转化体导入有如上所述的重组表达载体。

可选地，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。

本发明还提供了一种制备如上所述重组κ-酪蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组κ-酪蛋白。

可选地，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括5-20g/L的酵母提取物、10-30g/L的蛋白胨、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。

本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的重组κ-酪蛋白。

通过上述技术方案，本发明得到了致敏性几近消失的重组κ-酪蛋白，可以用于制备具有更高应用价值的人造乳制品。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为κ-酪蛋白致敏表位分析。A，κ-酪蛋白的三级结构；B，κ-酪蛋白的二级结构；C，κ-酪蛋白致敏表位。

图2为乳蛋白表达载体的构建示意图。

图3为κ-酪蛋白的表达纯化结果。M，标准分子量；1，κ-酪蛋白CS3；2，人工κ-酪蛋白AFCS3。

图4为优化κ-酪蛋白的致敏性ELISA检测分析。

序列表说明

SEQ ID NO.1，人工优化κ-酪蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO.2，人工优化κ-酪蛋白的核酸序列；

SEQ ID NO.3，人工优化κ-酪蛋白的重组表达载体核酸序列。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种重组κ-酪蛋白，所述重组κ-酪蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。该重组κ-酪蛋白具有低致敏性。

本发明还提供了编码如上所述的重组κ-酪蛋白的基因。

可选地，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的重组κ-酪蛋白的表达框。

可选地，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种转化体，所述转化体导入有如上所述的重组表达载体。

可选地，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。

本发明还提供了一种制备如上所述重组κ-酪蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组κ-酪蛋白。

可选地，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。

本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的重组κ-酪蛋白。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。表达载体pPIC9K-His：为淼灵生物公司市售产品；酵母表达菌株GS115：为淼灵生物公司市售产品。

实施例1乳蛋白致敏原的删除与结构优化

数据库获取牦牛、水牛、山羊、骆驼等不同物种κ-酪蛋白序列。通过Emini-SurfaceProbability方法进行分析乳蛋白的表面可及性；通过Jameson-Wolf的方法计算抗原指数氨基酸区域。

利用全序列比对法比较等致敏性乳蛋白与致敏原序列相似性，比对牦牛、水牛、山羊、骆驼、乳蛋白的致敏原与构象性表位的结构基序组成与定位，获得κ-酪蛋白致敏原的保守结构域。

结合分子生物学Swissprot数据库中κ-酪蛋白的晶体数据进行结构分析。基于多序列比对和系统发育分析，利用Schema同源结构元件交叉重组策略对κ-酪蛋白按功能域分割与创建重组蛋白文库，替换或消除致敏序列和表观位点，计算蛋白分子自由能稳定系数，完成κ-酪蛋白进行理性设计与定向进化。

基于乳蛋白的性质特征，选择亲水性好、表面可及性和可塑性较高且抗原指数较高的区域作为DNAStar预测的结构，所以通过DNAstar Protean软件预测高原牦牛κ-酪蛋白(图1)的残基表位。研究结果显示，高原牦牛κ-酪蛋白的抗原表位为9-24、37-46、58-78、81-98、138-160。利用同源结构交叉重组策略对乳蛋白进行优化，删除乳蛋白致敏性线性表位，完成人工优化κ-酪蛋白(SEQ ID NO.1)的理性设计与定向进化，得到SEQ ID NO.1所示的重组κ-酪蛋白。

实施例2优质κ-酪蛋白在酵母中的高效生物合成

针对酵母细胞工厂表达特性对优化乳蛋白的DNA编码序列进行密码子优化。利用化学合成法合成优化后κ-酪蛋白编码基因AF-CS3。

将人工优化的乳蛋白基因两端添加限制性内切酶EcoRI与NotI序列连接酵母表达载体pPIC9K-His多克隆位点中。将连接产物热激转化大肠杆菌感受态细胞并涂布含氨苄青霉素抗性的LB平板，筛选含有重组表达质粒的菌株。

利用限制性内切酶SacI切割将验证正确的阳性重组表达载体，制备线性化质粒DNA，电击转化毕赤酵母GS115中。利用遗传霉素抗性平板筛选阳性重组酵母菌株，并利用PCR进行鉴定。研究结果显示，成功构建了优化κ-酪蛋白酵母表达菌株GS-AFCS3。同样方法获得天然κ-酪蛋白表达菌株。

挑取乳蛋白表达菌株至种子液培养基中，30℃培养20h，以2％浓度转接与100mL发酵培养基中，30℃转速220rpm摇瓶发酵72h，每隔24h补加一次甲醇。离心收集发酵上清液，利用人工乳蛋白的His-Tag，Ni-NTA-resin纯化柱纯化乳蛋白，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测靶标乳蛋白的表达情况。

本实施例中，利用化学合成法合成优化后乳蛋白编码基因AF-CS3(序列如SEQ IDNO2)。通过表达载体构建与酵母转化(图2)，成功构建优化的κ-酪蛋白酵母表达菌株和GS-CS3。通过摇瓶发酵诱导蛋白异源表达。研究结果显示，优化κ-酪蛋白在胞外大量表达(图3)。

实施例3优化κ-酪蛋白的ELISA致敏性分析

用CBS溶液将乳蛋白样品稀释至5μg mL^-1，将每种样品100μL置于96孔板中，并在4℃下包被过夜。

用Tween 20/PBS(PBS-T)洗涤4次后，添加350μL 5％脱脂奶粉，并在37℃下孵育1h。再次洗涤，然后添加BSA稀释的变应原血清(1：500)，并在室温下孵育3h。洗涤后，将100μL过氧化物酶标记的山羊抗人/大鼠IgE抗体(1：5000)添加到孔中，然后在室温下孵育板1h。

用PBS-T洗涤5次并用PBS洗涤3次后，将200μL TMB溶液添加至孔中30分钟，然后使用50μL 2M H₂SO₄终止反应。

用分光光度计在450nm下测量值。对非过敏性血清进行相同的步骤，以确定非特异性结合的程度，将其从测试血清数据中减去。对每个样品进行三个平行实验，并将平均值作为最终数据。

通过ELISA体外免疫实验对构建表达的人工优化乳蛋白进行致敏性表征。利用κ-酪蛋白抗体血清对野生型κ-酪蛋白与人工优化κ-酪蛋白进行致敏性分析。研究结果显示，原始κ-酪蛋白具有强的IgE结合能力，而经过结构序列人工优化κ-酪蛋白的结合能力几近消失(图4)。人工优化κ-酪蛋白AF-CS3的IgE结合能力降低了98％，应变反应与阴性空白对照相似，蛋白致敏性几近消失。研究结果显示，人工优化κ-酪蛋白成功地降低了变应原性。

本发明利用合成生物学方法人工设计构建了无致敏性和低致敏性的优化κ-酪蛋白，提高乳蛋白的应用性能，实现靶标乳蛋白全局优化与生物合成，能够用于食品、保健品、医疗、饲料及蛋白产品等领域。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 重组κ-酪蛋白及其制备方法和人造乳

<130> 26011CAAS-B-ZW

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Glu Gln Asn Gln Glu Gln Pro Ala Cys His Glu Asn Asp Glu Arg

1 5 10 15

Pro Phe Tyr Gln Lys Thr Ala Pro Tyr Ile Pro Ile Gln Tyr Val Leu

20 25 30

Ser Arg Tyr Pro Tyr Tyr Gly Thr Asn Leu Tyr Gln Arg Arg Pro Val

35 40 45

Ala Leu Ile Asn Asn Gln Phe Leu Pro Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Pro

50 55 60

Ala Val Val Arg Pro His Ala Gln Ile Pro Gln Arg Gln Tyr Leu Ser

65 70 75 80

Asn Ser His Pro Pro Thr Val Val Arg Arg Pro His Pro His Leu Ser

85 90 95

Phe Met Ala Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro

100 105 110

Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr

115 120 125

Glu Pro Thr Val Asp Ser Val Val Thr Pro Glu Ala Phe Ser Glu Ser

130 135 140

Ile Ile Thr Ser Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala

145 150 155 160

Val

<210> 2

<211> 483

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggaacaaa atcaagagca gccagcttgc catgagaatg acgagagacc attctatcag 60

aaaaccgcac catatatccc tatccaatat gttttatcaa ggtaccccta ctacggtaca 120

aatctgtacc aaagaagacc agttgctttg ataaataatc aattccttcc aagaacctat 180

tatgctaatc cagctgttgt gagaccacac gctcaaattc cacaacgtca atacctttct 240

aattcccatc caccaaccgt ggtgcgaaga ccacaccctc acctgtcttt tatggcaatt 300

ccccccaaga agaaccagga taagacagag attccaacca ttaacacaat tgcttccgga 360

gaaccaacta gtactcctac taccgaacca actgtggatt ctgttgttac ccctgaagcc 420

ttctccgagt ctattattac ctcccctgag attaacaccg ttcaggtgac ctctactgca 480

gtc 483

<210> 3

<211> 9771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct 960

tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact 1020

acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 1080

gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 1140

tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa 1200

agagaggctg aagcttacgt agaattccag gaacaaaatc aagagcagcc agcttgccat 1260

gagaatgacg agagaccatt ctatcagaaa accgcaccat atatccctat ccaatatgtt 1320

ttatcaaggt acccctacta cggtacaaat ctgtaccaaa gaagaccagt tgctttgata 1380

aataatcaat tccttccaag aacctattat gctaatccag ctgttgtgag accacacgct 1440

caaattccac aacgtcaata cctttctaat tcccatccac caaccgtggt gcgaagacca 1500

caccctcacc tgtcttttat ggcaattccc cccaagaaga accaggataa gacagagatt 1560

ccaaccatta acacaattgc ttccggagaa ccaactagta ctcctactac cgaaccaact 1620

gtggattctg ttgttacccc tgaagccttc tccgagtcta ttattacctc ccctgagatt 1680

aacaccgttc aggtgacctc tactgcagtc gcggccgcga atcatcatca ccatcaccat 1740

taattcgcct tagacatgac tgttcctcag ttcaagttgg gcacttacga gaagaccggt 1800

cttgctagat tctaatcaag aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc 1860

atttttgata cttttttatt tgtaacctat atagtatagg attttttttg tcattttgtt 1920

tcttctcgta cgagcttgct cctgatcagc ctatctcgca gctgatgaat atcttgtggt 1980

aggggtttgg gaaaatcatt cgagtttgat gtttttcttg gtatttccca ctcctcttca 2040

gagtacagaa gattaagtga gaagttcgtt tgtgcaagct tatcgataag ctttaatgcg 2100

gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcaggcacc gtgtatgaaa tctaacaatg 2160

cgctcatcgt catcctcggc accgtcaccc tggatgctgt aggcataggc ttggttatgc 2220

cggtactgcc gggcctcttg cgggatatcg tccattccga cagcatcgcc agtcactatg 2280

gcgtgctgct agcgctatat gcgttgatgc aatttctatg cgcacccgtt ctcggagcac 2340

tgtccgaccg ctttggccgc cgcccagtcc tgctcgcttc gctacttgga gccactatcg 2400

actacgcgat catggcgacc acacccgtcc tgtggatcta tcgaatctaa atgtaagtta 2460

aaatctctaa ataattaaat aagtcccagt ttctccatac gaaccttaac agcattgcgg 2520

tgagcatcta gaccttcaac agcagccaga tccatcactg cttggccaat atgtttcagt 2580

ccctcaggag ttacgtcttg tgaagtgatg aacttctgga aggttgcagt gttaactccg 2640

ctgtattgac gggcatatcc gtacgttggc aaagtgtggt tggtaccgga ggagtaatct 2700

ccacaactct ctggagagta ggcaccaaca aacacagatc cagcgtgttg tacttgatca 2760

acataagaag aagcattctc gatttgcagg atcaagtgtt caggagcgta ctgattggac 2820

atttccaaag cctgctcgta ggttgcaacc gatagggttg tagagtgtgc aatacacttg 2880

cgtacaattt caacccttgg caactgcaca gcttggttgt gaacagcatc ttcaattctg 2940

gcaagctcct tgtctgtcat atcgacagcc aacagaatca cctgggaatc aataccatgt 3000

tcagcttgag acagaaggtc tgaggcaacg aaatctggat cagcgtattt atcagcaata 3060

actagaactt cagaaggccc agcaggcatg tcaatactac acagggctga tgtgtcattt 3120

tgaaccatca tcttggcagc agtaacgaac tggtttcctg gaccaaatat tttgtcacac 3180

ttaggaacag tttctgttcc gtaagccata gcagctactg cctgggcgcc tcctgctagc 3240

acgatacact tagcaccaac cttgtgggca acgtagatga cttctggggt aagggtacca 3300

tccttcttag gtggagatgc aaaaacaatt tctttgcaac cagcaacttt ggcaggaaca 3360

cccagcatca gggaagtgga aggcagaatt gcggttccac caggaatata gaggccaact 3420

ttctcaatag gtcttgcaaa acgagagcag actacaccag ggcaagtctc aacttgcaac 3480

gtctccgtta gttgagcttc atggaatttc ctgacgttat ctatagagag atcaatggct 3540

ctcttaacgt tatctggcaa ttgcataagt tcctctggga aaggagcttc taacacaggt 3600

gtcttcaaag cgactccatc aaacttggca gttagttcta aaagggcttt gtcaccattt 3660

tgacgaacat tgtcgacaat tggtttgact aattccataa tctgttccgt tttctggata 3720

ggacgacgaa gggcatcttc aatttcttgt gaggaggcct tagaaacgtc aattttgcac 3780

aattcaatac gaccttcaga agggacttct ttaggtttgg attcttcttt aggttgttcc 3840

ttggtgtatc ctggcttggc atctcctttc cttctagtga cctttaggga cttcatatcc 3900

aggtttctct ccacctcgtc caacgtcaca ccgtacttgg cacatctaac taatgcaaaa 3960

taaaataagt cagcacattc ccaggctata tcttccttgg atttagcttc tgcaagttca 4020

tcagcttcct ccctaatttt agcgttcaac aaaacttcgt cgtcaaataa ccgtttggta 4080

taagaacctt ctggagcatt gctcttacga tcccacaagg tggcttccat ggctctaaga 4140

ccctttgatt ggccaaaaca ggaagtgcgt tccaagtgac agaaaccaac acctgtttgt 4200

tcaaccacaa atttcaagca gtctccatca caatccaatt cgatacccag caacttttga 4260

gttgctccag atgtagcacc tttataccac aaaccgtgac gacgagattg gtagactcca 4320

gtttgtgtcc ttatagcctc cggaatagac tttttggacg agtacaccag gcccaacgag 4380

taattagaag agtcagccac caaagtagtg aatagaccat cggggcggtc agtagtcaaa 4440

gacgccaaca aaatttcact gacagggaac tttttgacat cttcagaaag ttcgtattca 4500

gtagtcaatt gccgagcatc aataatgggg attataccag aagcaacagt ggaagtcaca 4560

tctaccaact ttgcggtctc agaaaaagca taaacagttc tactaccgcc attagtgaaa 4620

cttttcaaat cgcccagtgg agaagaaaaa ggcacagcga tactagcatt agcgggcaag 4680

gatgcaactt tatcaaccag ggtcctatag ataaccctag cgcctgggat catcctttgg 4740

acaactcttt ctgccaaatc taggtccaaa atcacttcat tgataccatt attgtacaac 4800

ttgagcaagt tgtcgatcag ctcctcaaat tggtcctctg taacggatga ctcaacttgc 4860

acattaactt gaagctcagt cgattgagtg aacttgatca ggttgtgcag ctggtcagca 4920

gcatagggaa acacggcttt tcctaccaaa ctcaaggaat tatcaaactc tgcaacactt 4980

gcgtatgcag gtagcaaggg aaatgtcata cttgaagtcg gacagtgagt gtagtcttga 5040

gaaattctga agccgtattt ttattatcag tgagtcagtc atcaggagat cctctacgcc 5100

ggacgcatcg tggccgacct gcaggggggg ggggggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa 5160

ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa agtgagggag 5220

ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt 5280

gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa 5340

gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt 5400

acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt 5460

tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag 5520

aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga 5580

ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg 5640

agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagctta tgcatttctt 5700

tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca 5760

aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag 5820

gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa 5880

tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg 5940

cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag 6000

gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc 6060

tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga 6120

ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat 6180

ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa 6240

caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgat gatatatttt 6300

tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt gagacacaac gtggctttcc cccccccccc 6360

tgcaggtcgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca 6420

ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta 6480

tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc 6540

ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt 6600

cgcataaggg agagcgtcga gtatctatga ttggaagtat gggaatggtg atacccgcat 6660

tcttcagtgt cttgaggtct cctatcagat tatgcccaac taaagcaacc ggaggaggag 6720

atttcatggt aaatttctct gacttttggt catcagtaga ctcgaactgt gagactatct 6780

cggttatgac agcagaaatg tccttcttgg agacagtaaa tgaagtccca ccaataaaga 6840

aatccttgtt atcaggaaca aacttcttgt ttcgaacttt ttcggtgcct tgaactataa 6900

aatgtagagt ggatatgtcg ggtaggaatg gagcgggcaa atgcttacct tctggacctt 6960

caagaggtat gtagggtttg tagatactga tgccaacttc agtgacaacg ttgctatttc 7020

gttcaaacca ttccgaatcc agagaaatca aagttgtttg tctactattg atccaagcca 7080

gtgcggtctt gaaactgaca atagtgtgct cgtgttttga ggtcatcttt gtatgaataa 7140

atctagtctt tgatctaaat aatcttgacg agccaaggcg ataaataccc aaatctaaaa 7200

ctcttttaaa acgttaaaag gacaagtatg tctgcctgta ttaaacccca aatcagctcg 7260

tagtctgatc ctcatcaact tgaggggcac tatcttgttt tagagaaatt tgcggagatg 7320

cgatatcgag aaaaaggtac gctgatttta aacgtgaaat ttatctcaag atctctgcct 7380

cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 7440

agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 7500

tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg 7560

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 7620

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 7680

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 7740

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 7800

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 7860

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 7920

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 7980

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc 8040

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 8100

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 8160

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 8220

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 8280

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 8340

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 8400

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 8460

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 8520

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 8580

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 8640

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 8700

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 8760

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 8820

actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 8880

ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 8940

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 9000

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 9060

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 9120

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 9180

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 9240

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 9300

atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 9360

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 9420

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 9480

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 9540

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 9600

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 9660

cttcaagaat taattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctgact catgttggta 9720

ttgtgaaata gacgcagatc gggaacactg aaaaataaca gttattattc g 9771

Claims (10)

1.一种重组κ-酪蛋白，其特征在于，所述重组κ-酪蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的重组κ-酪蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体插入有权利要求2或3所述的基因并形成表达权利要求1所述的重组κ-酪蛋白的表达框。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

6.一种转化体，其特征在于，所述转化体导入有权利要求4或5所述的重组表达载体。

7.根据权利要求5所述的转化体，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。

8.一种制备权利要求1所述重组κ-酪蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6或7所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组κ-酪蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括5-20g/L的酵母提取物、10-30g/L的蛋白胨、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。

10.一种人造乳，其特征在于，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括权利要求1所述的重组κ-酪蛋白。

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