CN114751951B - 一种露水草中β-蜕皮激素的规模化制备方法 - Google Patents
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Abstract
为了解决现有技术中β‑蜕皮激素纯化方法工艺复杂、成本较高，无法大规模制备高品质β‑蜕皮激素的问题，同时进一步开发β‑蜕皮激素的药理性质和实际应用，本发明公开了一种低成本适合规模化生产高纯度β‑蜕皮激素的分离纯化方法。与水浸提露水草相比，碱化可以得到浓度更高的游离β‑蜕皮激素；与大孔吸附树脂分离提纯相比，用乙酸乙酯操作简单、成本低，适合规模性生产；同时采用酸化和丙酮‑二氯甲烷混合溶剂溶解除杂，缩短了生产周期，纯度和回收率更高。通过本发明可以得到纯度为98％以上的β‑蜕皮激素，达到降低生产成本的目的，更适合规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分提取分离技术领域，具体涉及从露水草中提取β-蜕皮激素的规模化制备方法。
背景技术
露水草为鸭跖草科兰耳草属多年生植物，又称蛛丝毛蓝耳草、珍珠露水草、鸡冠参、鸡出头草、蓝耳草等。主要分布于陕西、甘肃、河南、广西、四川、贵州、云南等地。具有祛风活络，利湿消肿的功效。
β-蜕皮激素是从露水草中提取得到的一种具有昆虫蜕皮活性的天然甾体化合物，具有抗氧化、防衰老、抗炎抗病毒、抗心律失常、降血糖和降胆固醇、促进体内蛋白的合成以及促进免疫力等一系列作用，广泛用于养殖、保健、化妆品、医药等行业。
专利CN201010039119.1中提到了一种从露水草中分离纯化蜕皮激素的方法。露水草粉末采用水煮，或甲醇、乙醇提取，调节pH至6-10，正丁醇∶乙酸乙酯混合溶剂萃取，浓缩，强碱型阴离子交换树脂分离，经洗脱、减压浓缩干燥可得到蜕皮激素。该工艺采用水提或甲醇、乙醇提取，导致提取液杂质太多，给后期分离带来很大压力，需要采用混合溶剂萃取、离子交换树脂纯化，虽然较传统的收率提高1.16-1.38％，但是含量仅能纯化至93％，且工艺复杂，生产周期长，成本高，不适合规模化生产。
专利CN201210370685.X中提到了一种富含β-蜕皮激素的露水草提取物及其制备方法，以露水草根为露水草粉末，水提取、离心分离、树脂吸附、洗脱、重结晶制得含β-蜕皮激素87.8-90.0％的露水草提取物。该工艺采用大孔树脂吸附，醇耗高，生产周期长，得到的β-蜕皮激素含量低，回收率仅52％-62％，生产成本太高，不利于规模化生产。
专利CN202011453768.6中开发了一种高纯度蜕皮激素的分离纯化方法，以露水草根为露水草粉末，加入诱导剂，通过高效液相色谱仪进行分离，然后采用一种磁性纳米粒子澄清剂进行吸附，得到高纯度蜕皮激素。磁性纳米粒子澄清剂配制工艺复杂，难以回收利用，仅可适合实验室制备，不适合工业化生产。
发明内容
为了解决β-蜕皮激素纯化方法工艺复杂、成本较高，无法大规模制备高品质的问题，同时进一步开发β-蜕皮激素的药理性质和实际应用，本发明提出了一种低成本适合规模化生产高纯度蜕皮激素的分离纯化方法，关键技术在于通过碱化使得β-蜕皮激素充分游离，采用乙酸乙酯提取、酸化和混合溶剂溶解进行除杂、结晶、重结晶得到含量在98％以上的β-蜕皮激素，该方法显著提高了回收率，从而达到降低生产成本的目的，更利于工业化生产，具体技术方案如下：
(1)露水草全草进行清洗、晾晒、干燥，将干燥后的露水草粉碎至40-60目，得到露水草粉末；
(2)将露水草粉末放入提取罐中，加入质量浓度为0.5％-1.5％，露水草粉末质量0.5-1.0倍量的碱水搅拌均匀，水循环下温度在50-60℃静置2-3h；所述碱水为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾中的任一种；
(3)在碱水浸泡后的露水草粉末中加入乙酸乙酯和活性炭，水循环下温度保持在40℃-60℃，静置2h，过滤得到提取液，重复3次，将提取液合并，浓缩得到浓缩液的比重为1.02-1.05；所述乙酸乙酯用量为露水草粉末质量的6-10倍量；所述活性炭用量在露水草粉末质量2％-3％；
(4)将浓缩液酸化pH至4-5，用硅藻土过滤除去不溶性杂质，得到滤液，将滤液浓缩成浸膏，浸膏比重1.10-1.15；所述酸化用的酸为盐酸、硫酸、磷酸中的任一种；
(5)用浸膏质量3-5倍量的丙酮-二氯甲烷溶解浸膏，过滤，将滤液再次浓缩，至原体积的1/2-1/3，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用有机溶剂漂洗，得到粗结晶；所述丙酮-二氯甲烷体积比为1:1-2；所述有机溶剂为石油醚、正己烷或二氯甲烷中的任一种；
(6)用体积浓度为50％-70％，用量为粗结晶质量5-8倍量的乙醇或甲醇，在60-70℃下热溶粗结晶，将未溶解的结晶过滤，滤液浓缩至结晶析出，将析出的结晶放置冷藏、过滤、干燥，得到β-蜕皮激素。
上述步骤(2)中，在露水草粉末中加入质量浓度为0.5％，露水草粉末质量0.9倍量的碳酸钠搅拌均匀，水循环下温度在60℃，静置2h。
上述步骤(3)中，在碱水浸泡后的露水草粉末中加入露水草粉末质量9倍量的乙酸乙酯，露水草粉末质量2.5％的活性炭，45℃下静置2h，过滤得到提取液，重复3次，将提取液合并，浓缩得到浓缩液的比重为1.03。
上述步骤(4)中，浓缩液用盐酸酸化pH至4-5，用硅藻土过滤除去不溶性杂质，得到滤液，将滤液浓缩成浸膏，浸膏比重为1.12。
上述步骤(5)中，在浸膏中加入浸膏3倍量，体积比为1:1的丙酮-二氯甲烷溶解浸膏，过滤，将滤液再次浓缩至原体积的1/2，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用二氯甲烷漂洗，得到粗结晶。
上述步骤(6)中，用粗结晶质量6倍量，70％的乙醇，65℃下热溶粗结晶，将未溶解的结晶过滤，滤液浓缩至结晶析出，将析出的结晶放置冷藏、过滤、干燥，得到β-蜕皮激素。
与现有技术相比，本发明有以下有益效果：
1、露水草中除了含有较高含量的β-蜕皮激素外，还含有其他植物甾酮类化合物，本专利通过氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾试剂中的任一种，对露水草粉末进行碱化，可将β-蜕皮激素充分游离，从而提高β-蜕皮激素含量，进一步提高回收率。
2、本专利采用碱水对露水草粉末处理，在水循环加热条件下利于纤维素结构的断裂，提高生物质有效组分利用率。
3、在水循环加热条件下，用乙酸乙酯提取β-蜕皮激素，可解决乙酸乙酯溶解性低、提取不完全的问题，显著提高回收率。
4、丙酮-二氯甲烷的体积比为1:1-2时为最佳的混合比例，既可以实现蜕皮激素活性成分的溶解，同时可除去部分杂质，浓缩后的体系环境更利于蜕皮激素结晶的脱离，简化工艺流程，缩短生产周期。
5、本专利工艺简单，可操作性强，回收率可达到85％，成本低，适合规模化生产。
附图说明
图1本发明实施例1中β-蜕皮激素含量高效液相色谱图
图2本发明实施例2中β-蜕皮激素含量高效液相色谱图
图3本发明实施例3中β-蜕皮激素含量高效液相色谱图
图4本发明实施例4中β-蜕皮激素含量高效液相色谱图
图5本发明实施例5中β-蜕皮激素含量高效液相色谱图
图6本发明实施例6中β-蜕皮激素含量高效液相色谱图
图7对比本发明实施例1中β-蜕皮激素含量高效液相色谱图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
实施例1：
(1)露水草全草进行清洗、晾晒、干燥、粉碎至40-60目。
(2)取粉碎后露水草粉末50Kg，加入露水草粉末质量0.5倍量0.5％氢氧化钠水溶液拌匀，水循环下60℃保温2h。
(3)加入露水草粉末质量2％的活性炭，6倍量的乙酸乙酯，水循环下60℃静置2h，过滤得到提取液，重复3次，合并提取液，浓缩至比重至1.043。
(4)用盐酸酸化浓缩液pH至4-5，硅藻土过滤除去不溶性杂质，滤液继续浓缩成浸膏，比重至1.105。
(5)加入浸膏质量3倍量的丙酮-二氯甲烷(1:1)溶解，过滤，滤液浓缩至原体积的1/3，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用二氯甲烷漂洗，得到粗结晶。
(6)用5倍量70％乙醇60℃热溶粗结晶，过滤，滤液减压浓缩至结晶析出后放置冷藏、过滤、干燥结晶，称量重量为685.4g，其中β-蜕皮激素含量98.33％。
实施例2：
(1)露水草全草进行清洗、晾晒、干燥、粉碎至40-60目。
(2)取粉碎后露水草粉末50Kg，加入露水草粉末质量等倍量1％碳酸钠水溶液拌匀，水循环下50℃保温3h。
(3)加入露水草粉末质量2％活性炭，10倍量乙酸乙酯水循环下40℃静置2h，过滤得到提取液，重复3次，合并提取液，浓缩至比重1.028。
(4)用硫酸酸化浓缩液pH至4-5，硅藻土过滤除去不溶性杂质，滤液继续浓缩成浸膏，比重至1.141。
(5)加入浸膏质量5倍量的丙酮-二氯甲烷(1:2)溶解，过滤，滤液浓缩至原体积的1/2，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用正己烷漂洗，得到粗结晶。
(6)用8倍量50％乙醇70℃热溶，过滤，滤液减压浓缩至结晶析出后冷藏，过滤，干燥结晶，称量重量为680.0g，其中β-蜕皮激素含量98.50％。
实施例3：
(1)露水草全草进行清洗、晾晒、干燥、粉碎至40-60目。
(2)取粉碎后露水草粉末50Kg，加入露水草粉末质量0.8倍量0.6％氢氧化钾水溶液拌匀，水循环下55℃保温2h。
(3)加入露水草粉末质量2.5％活性炭，8倍量乙酸乙酯水循环下50℃静置2h，过滤得到提取液，重复3次，合并提取液，浓缩至比重1.032。
(4)用磷酸酸化浓缩液pH至4-5，硅藻土过滤除去不溶性杂质，滤液继续浓缩成浸膏，比重1.137。
(5)加入浸膏质量4倍量丙酮-二氯甲烷(2:3)溶解，过滤，滤液浓缩至原体积的1/2，冷藏结晶，过滤过滤得到结晶体，用石油醚漂洗，得到粗结晶。
(6)用7倍量60％乙醇70℃热溶，过滤，滤液减压浓缩至结晶析出后冷藏，过滤，干燥结晶，称量重量为689.3g，其中β-蜕皮激素含量98.29％。
实施例4：
(1)露水草全草进行清洗、晾晒、干燥、粉碎至40-60目。
(2)取粉碎后露水草粉末50Kg，加入露水草粉末质量0.6倍量0.8％碳酸钾水溶液拌匀，水循环下50℃保温3h。
(3)加入露水草粉末质量3％活性炭，7倍量乙酸乙酯55℃静置2h，过滤得到提取液，重复3次，合并提取液，浓缩至比重1.047。
(4)用盐酸酸化浓缩液pH至4-5，硅藻土过滤除去不溶性杂质，滤液继续浓缩成浸膏，比重1.145。
(5)加入浸膏质量5倍量丙酮-二氯甲烷(2:3)溶解，过滤，滤液浓缩至原体积的1/3，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用石油醚漂洗，得到粗结晶。
(6)用7倍量65％乙醇65℃热溶，过滤，滤液减压浓缩至结晶析出后冷藏，过滤，干燥结晶，称量重量为690.8g，其中β-蜕皮激素含量98.13％。
实施例5:(1)露水草全草进行清洗、晾晒、干燥、粉碎至40-60目。
(2)取粉碎后露水草粉末50Kg，加入露水草粉末0.9倍量0.5％碳酸钠水溶液拌匀，水循环下60℃保温2h。
(3)加入露水草粉末质量2.5％活性炭，9倍量乙酸乙酯45℃提取静置2h，过滤得到提取液，重复3次，浓缩至比重1.030。
(4)用盐酸酸化浓缩液pH至4-5，硅藻土过滤除去不溶性杂质，滤液继续浓缩成浸膏，比重1.129。
(5)加入浸膏质量3倍量丙酮-二氯甲烷(1:1)溶解，过滤，滤液浓缩至原体积的1/2，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用二氯甲烷漂洗，得到粗结晶。
(6)用6倍量70％乙醇65℃热溶，过滤，滤液减压浓缩至结晶析出后冷藏，过滤，干燥结晶，称量重量为677.3g，其中β-蜕皮激素含量98.76％。
实施例6:
(1)露水草全草进行清洗、晾晒、干燥、粉碎至40-60目。
(2)取粉碎后露水草粉末50Kg，加入露水草粉末0.5倍量1.5％氢氧化钠水溶液拌匀，水循环下50℃保温2h。
(3)加入露水草粉末质量2％活性炭，6倍量乙酸乙酯40℃提取静置2h，过滤得到提取液，重复3次，浓缩至比重1.035。
(4)用盐酸酸化浓缩液pH至4-5，硅藻土过滤除去不溶性杂质，滤液继续浓缩成浸膏，比重1.126。
(5)加入浸膏质量4倍量丙酮-二氯甲烷(1:1)溶解，过滤，滤液浓缩至原体积的1/3，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用二氯甲烷漂洗，得到粗结晶。
(6)用8倍量55％甲醇70℃热溶，过滤，滤液减压浓缩至结晶析出后冷藏，过滤，干燥结晶，称量重量为683.6g，其中β-蜕皮激素含量98.46％。
对比实施例1：
(1)露水草全草清洗、晾晒、干燥、粉碎至40-60目。
(2)取粉碎后原料50Kg，加入露水草粉末质量2％活性炭，6倍量乙酸乙酯60℃提取静置2h，过滤得到提取液，重复3次，浓缩至比重1.05。
(3)用盐酸酸化pH至4-5，硅藻土过滤除去不溶性杂质，滤液继续浓缩成浸膏，比重1.10。4)加入浸膏质量3倍量丙酮-二氯甲烷(1:1)溶解，过滤，滤液浓缩至原体积的1/3，冷藏结晶，过滤，二氯甲烷漂洗，得到粗结晶。
(5)加入浸膏质量5倍量70％乙醇60℃热溶，过滤，滤液减压浓缩至结晶析出后放置冷藏，过滤，结晶干燥670.6g，β-蜕皮激素含量93.20％。
经过大量实验结果可以得出，该从露水草中提取β-蜕皮激素的方法所得产品中β-蜕皮激素含量不低于98％；因此，该方法产品含量高，适合于工业化生产。
本发明与现有技术进行实验结果对比，并得出如下结果：
| CN201010039119.1 | CN201210370685.X | 本发明 | |
| 原料部位 | - | 根部 | 全草 |
| 收率 | 2.01-2.15％ | 0.9-0.99％ | 1.35％以上 |
| 含量 | 90-93％ | 50-90％ | 98％ |
| 有效成分回收率 | - | - | 85％ |
| 是否使用柱分离 | 是，离子交换树脂 | 是，大孔吸附树脂 | 否 |
| 步骤 | 8 | 8 | 6 |
| 检测方法 | 紫外分光光度法 | 高效液相色谱法 | 高效液相色谱法 |
Claims (6)
1.一种露水草中β-蜕皮激素的规模化制备方法，其特征在于：
（1）露水草全草进行清洗、晾晒、干燥，将干燥后的露水草粉碎至40-60目，得到露水草粉末；
（2）将露水草粉末放入提取罐中，加入质量浓度为0.5%-1.5%，露水草粉末质量0.5-1.0倍量的碱水搅拌均匀，水循环下温度在50-60℃静置2-3h；所述碱水为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾中的任一种；
（3）在碱水浸泡后的露水草粉末中加入乙酸乙酯和活性炭，水循环下温度保持在40-60℃，静置2h，过滤得到提取液，重复3次，将提取液合并浓缩，得到浓缩液的比重为1.02-1.05；所述乙酸乙酯用量为露水草粉末质量的6-10倍量；所述活性炭用量为露水草粉末质量2%-3%；
（4）将浓缩液酸化pH至4-5，用硅藻土过滤除去不溶性杂质，得到滤液，将滤液浓缩成浸膏，浸膏比重1.10-1.15；所述酸化用的酸为盐酸、硫酸、磷酸中的任一种；
（5）用浸膏质量3-5倍量的丙酮-二氯甲烷溶解浸膏，过滤，将滤液再次浓缩，至原体积的1/2-1/3，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用有机溶剂漂洗，得到粗结晶；所述丙酮-二氯甲烷体积比为1:1-2；所述有机溶剂为石油醚、正己烷或二氯甲烷中的任一种；
（6）用体积浓度为50%-70%，用量为粗结晶质量5-8倍量的乙醇或甲醇，在60-70℃下热溶粗结晶，将未溶解的结晶过滤，滤液浓缩至结晶析出，将析出的结晶放置冷藏、过滤、干燥，得到β-蜕皮激素。
2.根据权利要求1所述的一种露水草中β-蜕皮激素的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，在露水草粉末中加入质量浓度为0.5%，露水草粉末质量0.9倍量的碳酸钠搅拌均匀，水循环下温度在60℃，静置2 h。
3.根据权利要求2所述的一种露水草中β-蜕皮激素的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，在碱水浸泡后的露水草粉末中加入露水草粉末质量9倍量的乙酸乙酯，露水草粉末质量2.5%的活性炭，45℃下静置2h，过滤得到提取液，重复3次，将提取液合并，浓缩得到浓缩液的比重为1.03。
4.根据权利要求3所述的一种露水草中β-蜕皮激素的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，浓缩液用盐酸酸化pH至4-5，用硅藻土过滤除去不溶性杂质，得到滤液，将滤液浓缩成浸膏，浸膏比重为1.12。
5.根据权利要求4所述的一种露水草中β-蜕皮激素的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中，在浸膏中加入浸膏3倍量，体积比为1:1的丙酮-二氯甲烷溶解浸膏，过滤，将滤液再次浓缩至原体积的1/2，冷藏结晶，过滤得到结晶体，用二氯甲烷漂洗，得到粗结晶。
6.根据权利要求5所述的一种露水草中β-蜕皮激素的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中，用粗结晶质量6倍量，70%的乙醇，65℃下热溶粗结晶，将未溶解的结晶过滤，滤液浓缩至结晶析出，将析出的结晶放置冷藏、过滤、干燥，得到β-蜕皮激素。
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