CN114716578B - 一种可溶性裸藻多糖的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可溶性裸藻多糖的制备方法，所述方法为方法一或为方法二，其中，所述方法一包括以下步骤：(1)碱溶解；(2)酸交联；(3)氧化断键；(4)调pH；所述方法二包括以下步骤：(1)高温断键；(2)碱溶解；(3)调pH，得到可溶性裸藻多糖。本发明方法制得的可溶性裸藻多糖产品应用范围广，对环境无污染，所制备的可溶性β葡聚糖在化妆品与医药领域中具备良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其是一种可溶性裸藻多糖的制备方法和应用。
背景技术
裸藻多糖，是由纤细裸藻胞内合成积累的一种线性β-1,3-葡聚糖晶体颗粒，这种晶体由线性β-1,3-葡聚糖分子形成的三螺旋结构折叠后形成。此晶体颗粒不溶于水，不溶于弱碱至酸性的溶液，但溶于强碱溶液，在强碱中溶解后，pH一旦调节至弱碱性或酸性范围内即形成胶状沉淀。多糖的溶解性关系到其是否可以注射液、护肤液等形式使用。无法获得不受pH影响的可溶性裸藻多糖，是限制裸藻多糖在化妆品、药品等领域应用的主要因素。关于裸藻多糖的研究已经有47年的历史，早在1976年就有关于裸藻多糖抑制肿瘤发展的论文。随后，达20多篇论文研究了其免疫调节、抗病毒、消除机体炎症，如关节炎、脂肪肝炎、肾炎、痛风导致的关节肿胀等，还有增强精子活力、降低器官中胆固醇含量等研究报道。最新研究发现裸藻多糖可添加到创可贴中，不仅可促进伤口愈合，还能提高细胞免疫活性，因此作为医用敷料具有天然的优势，其本身就具有消炎作用。因此，制备可溶性裸藻多糖对于拓展裸藻多糖的应用领域非常重要。
β-1，3-葡聚糖的分子结构式如下：
经专利检索发现，大部分可溶性β-1，3-葡聚糖是酵母葡聚糖，采用机械化学法得到可溶性葡聚糖，虽然简单快速，但是得率都不高(如CN103524638B、N102838688A、CN102838688B、CN103524638A、CN109852647A、CN104017104A、N104017104B)。还有的可溶性β-1，3-葡聚糖的制备着重点在发酵工艺(如CN111909886A)，只是金藻产β-1，3-葡聚糖的发酵工艺，没有具体的可溶性制备方法。还有一些是不溶性的β-1，3-葡聚糖的制备方法(如CN101117356A、CN101748172A)，由于不可溶，大大限制了应用范围。
目前的裸藻多糖存在在非极端pH溶液中溶解性低的问题，因此亟需一种或多种可溶性裸藻多糖的制备方法。
发明内容
本发明目的在于克服裸藻多糖在非极端pH溶液中溶解性低的问题，提供一种可溶性裸藻多糖的制备方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种可溶性裸藻多糖的制备方法，所述方法为方法一或为方法二，其中，所述方法一包括以下步骤：
(1)碱溶解：使用pH＞12的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液或氢氧化钡溶液溶解裸藻多糖，机械搅拌至裸藻多糖固体消失；
(2)酸交联：滴加酸液，随着pH下降，溶液中出现胶絮状沉淀，滴加酸液至溶液pH≤7；
(3)氧化断键：加氧化剂过氧化氢或过氧化钠或过氧化钙溶液或次氯酸或次氯酸钠，至溶液中过氧根浓度为0.01g/L～0.1g/L或有效氯含量为0.1g/L～1g/L，搅拌至方法一中步骤(2)中形成的胶絮状沉淀消失，使得糖苷键部分断裂；
(4)调pH：滴加酸液或碱液，调pH至低于12的任一值，得到可溶性裸藻多糖；
所述方法二包括以下步骤：
(1)高温断键：105℃至240℃烘烤裸藻多糖10秒至2分钟；
(2)碱溶解：使用pH＞12的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液或氢氧化钡碱液溶解裸藻多糖，机械搅拌至裸藻多糖固体消失；
(3)调pH：滴加酸液，调pH至低于12的任一值，得到可溶性裸藻多糖。
进一步地，所述裸藻多糖为：裸藻粉或裸藻活细胞或从裸藻中提取的裸藻多糖或副淀粉。
进一步地，为获得溶解彻底的裸藻多糖，所述方法一中步骤(1)与方法二中步骤(2)中碱液的体积≥5倍裸藻多糖固体体积。
进一步地，为使得胶状裸藻多糖糖苷键部分断裂至胶状沉淀消失成可溶状态，方法一中步骤(3)中加入的氧化剂的量为每克裸藻多糖使用2至10毫升的氧化剂。
进一步地，所述方法一中步骤(4)调pH至低于12的任一值后，再加入终浓度≥0.01g/L的抗坏血酸以终止氧化反应。
进一步地，所述方法一中步骤(4)或方法二中步骤(3)后，再添加三倍原溶液体积的乙醇或一倍原溶液体积的异丙醇静置至絮状沉淀析出，获得沉淀的裸藻多糖，干燥后，获得可溶性裸藻多糖粉。
进一步地，所述酸液为含有氢离子的酸液。
进一步地，所述酸液为盐酸或柠檬酸或苹果酸；
或者，所述碱液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液或氢氧化钡溶液。
如上所述的可溶性裸藻多糖的制备方法制得的可溶性裸藻多糖在化妆品、医药领域中的应用。
较优地，所述化妆品为润肤霜、面膜。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法制得的可溶性裸藻多糖产品应用范围广，对环境无污染，所制备的可溶性β葡聚糖在化妆品与医药领域中具备良好的应用前景。
2、本发明方法在制备可溶性裸藻多糖时，通过控制氧化剂氧化的时间或高温处理的时间长短来控制可溶性裸藻多糖的葡萄糖残基链的长度，而获得不同粘度的可溶性裸藻多糖。
3、本发明方法制得的可溶性裸藻多糖颜色澄清透明(如图1所示)，悬浮性极佳，静置48小时才出现分层现象，而非可溶裸藻多糖置于水中几分钟便出现的分层现象(如图2所示)。添加到润肤霜或者加入到创可贴中，均具有显著的消炎效果，实验表明，添加本发明制备的可溶性裸藻多糖的润肤霜相比未添加可溶性裸藻多糖的润肤霜对照组，可明显缓解5％DNFB诱发的皮炎，降低IL-6、IL-7、INF-γ炎症因子的水平达2倍以上(如图3所示)，HE染色显示，显著缓解伴灶性海绵水肿、真皮血管扩张充血伴炎性细胞浸润与毛囊结构减少症状(如图4所示)。
4、本发明提供了两种策略来破坏阻碍裸藻多糖溶解的障碍，第一种方法为使用碱打断分子间氢键溶解裸藻多糖，进而加酸调节pH，伴随裸藻多糖沉淀，后加入氧化剂在酸性条件下断裂部分糖苷键而实现裸藻多糖的溶解，同时使用还原剂阻断氧化剂的过度断键。第二种方法为，直接使用严格控制的温度条件破坏分子间氢键与分子内糖苷键，然后使用碱液打断分子间氢键溶解裸藻多糖，随后使用酸液或碱液调整pH而获得任意pH下的可溶性裸藻多糖。
附图说明
图1为本发明方法制得的可溶性裸藻多糖的一种溶液图；
图2为现有技术中非可溶裸藻多糖的溶液图；
图3为本发明中润肤霜中添加的可溶性裸藻多糖对皮炎小鼠的细胞因子水平的影响图；
图4为本发明中润肤霜中添加的可溶性裸藻多糖对皮炎小鼠皮炎部位影响的HE组织染色图；
图5为本发明中市售面膜中添加的可溶性裸藻多糖对皮炎小鼠的皮炎部位的影响图；
图6为本发明中不同烘干时间后形成的可溶性裸藻多糖的光密度值；
图7为本发明中可溶性裸藻多糖的制备方法的一种工艺流程图；
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种可溶性裸藻多糖的制备方法，所述方法为方法一或为方法二，其中，所述方法一包括以下步骤：
(1)碱溶解：使用pH＞12的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液或氢氧化钡碱液溶解裸藻多糖，机械搅拌至裸藻多糖固体消失；
(2)酸交联：滴加酸液，随着pH下降，溶液中出现胶絮状沉淀，滴加酸液至溶液pH≤7；
(3)氧化断键：加氧化剂过氧化氢或过氧化钠或过氧化钙溶液或次氯酸或次氯酸钠，至溶液中过氧根浓度为0.01g/L～0.1g/L或有效氯含量为0.1g/L～1g/L，搅拌至方法一中步骤(2)中形成的胶絮状沉淀消失，使得糖苷键部分断裂；
(4)调pH：滴加酸液或碱液，调pH至低于12的任一值，得到可溶性裸藻多糖；
所述方法二包括以下步骤：
(1)高温断键：105℃至240℃烘烤裸藻多糖10秒至2分钟；
(2)碱溶解：使用pH＞12的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液或氢氧化钡碱液溶解裸藻多糖，机械搅拌至裸藻多糖固体消失；
(3)调pH：滴加酸液，调pH至低于12的任一值，得到可溶性裸藻多糖。
较优地，所述裸藻多糖为：裸藻粉或裸藻活细胞或从裸藻中提取的裸藻多糖或副淀粉。
较优地，为获得溶解彻底的裸藻多糖，所述方法一中步骤(1)与方法二中步骤(2)中碱液的体积≥5倍裸藻多糖固体体积。
较优地，为使得胶状裸藻多糖糖苷键部分断裂至胶状沉淀消失成可溶状态，方法一中步骤(3)中加入的氧化剂的量为每克裸藻多糖使用2至10毫升的氧化剂。
较优地，所述方法一中步骤(4)调pH至低于12的任一值后，再加入终浓度≥0.01g/L的抗坏血酸以终止氧化反应。
较优地，所述方法一中步骤(4)或方法二中步骤(3)后，再添加三倍原溶液体积的乙醇或一倍原溶液体积的异丙醇静置至絮状沉淀析出，获得沉淀的裸藻多糖，干燥后，获得可溶性裸藻多糖粉。
较优地，所述酸液为含有氢离子的酸液。
较优地，所述酸液为盐酸或柠檬酸或苹果酸；
或者，所述碱液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液或氢氧化钙溶液或氢氧化钡溶液。
如上所述的可溶性裸藻多糖的制备方法制得的可溶性裸藻多糖在化妆品、医药领域中的应用。
较优地，所述化妆品为润肤霜、面膜。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
实施例1
取10g裸藻多糖，用100mL浓度为1mol/L的NaOH(pH＝12.5)进行溶解，通过磁力搅拌器搅拌使裸藻多糖粉末消失，完全溶解。然后滴加5％的盐酸边继续搅拌，pH降低后便出现块状与絮状凝胶沉淀析出，继续加酸至pH为6。然后加15ml的30％(质量分数)的过氧化氢氧化，使其断键，此时溶液产生大量气泡，辅以磁力搅拌器搅拌，大约几分钟内凝胶块消失，溶液变澄清，此时溶液体积为120ml，滴加1mol/L的NaOH溶液，pH升高至7后加入2mg的抗坏血酸终止过氧化氢的氧化作用。
静置24后，溶液未出现与图2中非可溶裸藻多糖静置几分钟便沉淀的现象，说本实例中制备的裸藻多糖可溶性良好，可溶性裸藻多糖制备成功。使用SBA-50B葡萄糖分析仪测定溶液中单糖浓度，测定结果表明，葡萄糖单糖浓度低于检测限，说明该发明方法制备不会导致多糖的过度水解产生单糖分子，溶液中主要为可溶性裸藻多糖分子。
补充220ml去离子水至以上可溶性裸藻多糖溶液中，终体积为500ml，此时裸藻多糖浓度20g/L。取该可溶性裸藻多糖25μL与50μL，分别加入到两瓶50ml润肤霜中，可溶性裸藻多糖的终浓度为10μg/ml与20μg/ml，将此润肤霜涂抹于5％二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠皮炎上，使用未添加可溶性裸藻多糖的润肤霜作为未施药对照。结果表明，添加本发明制备的可溶性裸藻多糖的润肤霜相比未添加可溶性裸藻多糖的润肤霜对照组，可明显缓解5％DNFB诱发的皮炎，降低IL-6、IL-7、INF-γ炎症因子的水平达2倍以上(图3)，HE染色显示，显著缓解伴灶性海绵水肿、真皮血管扩张充血伴炎性细胞浸润与毛囊结构减少症状(图4)。说明本实例制取的可溶性裸藻多糖加入到润肤霜中后，具有显著缓解皮肤炎症的作用。
取100ml以上方法中制备的可溶性裸藻多糖，加入200ml 95％的乙醇，轻微搅拌混匀后，室温静置10小时后，底部出现白色絮凝沉淀，说明溶液中存在可溶性大分子多糖，离心收集沉淀，置于真空干燥箱中干燥后获得白色粉末，加入蒸馏水，白色粉末复溶后重新消失溶解，说明本方法制备的可溶性裸藻多糖具有良好的可溶性。
本实例中也曾尝试跳过碱溶解一步，直接加酸，结果表明裸藻多糖粉末不溶于酸液(形态同图2)。
本实例中也曾尝试跳过加酸调节pH一步，直接加入氧化剂破坏糖苷键，结果表明氧化剂的在碱性溶液中断键效率低，随后加入酸液后有凝胶沉淀出现(形态同图2)，说明在加入氧化剂前调节pH至中性或酸性范围的必要性。
本实例中也曾尝试跳过碱溶与加酸过程，而是直接往裸藻多糖粉末中加入氧化剂，结果表明在24小时内底部沉淀的裸藻多糖粉末量没有明显减少(形态同图2)，说明裸藻多糖粉末难溶解于氧化剂溶液。
因此，可以看出，本发明方法一中同时添加碱液、酸和氧化剂这三步操作是缺一不可的，只有按照本发明方法的这三步操作的顺序，才能获得本发明可溶性裸藻多糖，方法一中碱液处理、酸处理和氧化剂处理使用时具有协同效果。
实施例2
取10g裸藻多糖，用100mL浓度为1mol/L的NaOH(pH＝12.5)进行溶解，通过磁力搅拌器搅拌，裸藻多糖粉末一分钟内便完全消失，完全溶解。然后边滴加5％的盐酸边继续搅拌，pH低于13后便出现凝胶析出，继续加酸至pH为6。再加100ml的30％(质量分数)的次氯酸钠，使其氧化断键，此时溶液产生大量气泡，磁力搅拌器搅拌至凝胶完全消失，溶液变澄清，滴加5％(质量分数)的盐酸，调pH至6后加入2mg的抗坏血酸终止次氯酸钠的氧化作用。
使用SBA-50B葡萄糖分析仪测定溶液中单糖浓度，测定结果表明，葡萄糖单糖浓度低于检测限，说明该发明方法制备不会导致多糖的过度水解产生单糖分子，溶液中主要为可溶性裸藻多糖分子。此时溶液体积为280ml；用加入原溶液体积二倍的95％的乙醇(560ml)，搅拌混匀后静置醇沉10小时，底部出现白色絮状沉淀，说明溶液中存在可溶性大分子多糖；轻轻将上部清液倒出弃，下部沉淀置于其上清液后在低温真空冻干机中冻干24h，得可溶性裸藻多糖干粉。将获得的可溶性多糖干粉置于100ml去离子水中，轻轻搅拌后，粉末即消失溶解，证明本实例中制备的可溶性裸藻多糖干粉具有良好的溶解性。
实施例3
取7份裸藻多糖，每份10g，分别置于90、100、105、150、180、240、250摄氏度的烘箱中干燥30秒，取出后加入100mL浓度为1mol/L的NaOH(pH＝12.5)，轻微搅拌，裸藻多糖粉末几分钟内便消失，完全溶解后滴加5％的盐酸调节溶液的pH至低于12，结果表明，250摄氏度烘烤30秒的裸藻多糖出现颜色发黄的糊化现象，加酸后黄色依然存在，90与100摄氏度30秒处理的裸藻多糖在低于pH12后出现胶状沉淀，而105、150、180与240摄氏度热处理后的裸藻多糖随着pH的降低到2，全程无胶状沉淀出现，静置24后，以上三个处理温度的溶液未出现与图2中非可溶裸藻多糖静置几分钟便沉淀的现象，说本实例中经105摄氏度以上处理后制备的裸藻多糖可溶性良好。使用SBA-50B葡萄糖分析仪测定溶液中单糖浓度，测定结果表明，葡萄糖单糖浓度低于检测限，说明该发明方法制备不会导致多糖过度水解产生单糖分子，溶液中主要为可溶性裸藻多糖分子。
取180摄氏度30秒处理后的裸藻多糖溶液继续后续试验，此时溶液终体积为110ml；用加入原溶液体积二倍的95％的乙醇(220ml)，搅拌混匀后静置醇沉10h小时以上，底部出现白色絮状沉淀，说明溶液中存在可溶性大分子多糖；轻轻将上部清液倒出弃，下部沉淀经过离心浓缩后置于真空干燥机中干燥1h，得可溶性裸藻多糖干粉。将此干粉置于10ml蒸馏水中，粉末溶解消失，说明本方法制备的裸藻多糖具有良好的可溶性。
该方法制取的可溶性裸藻多糖加入到面膜中，具有良好的可溶性，同样使用实施例1中5％二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠皮炎模型，每天使用普通面膜与添加10μg/ml与20μg/ml的面膜每天敷皮炎处半小时，连续敷用5天。结果表明该实例中制作的可溶性裸藻多糖可明显缓解小鼠皮炎症状，皮炎表面的平滑度等明显改善(图5)。
本实施例中也曾尝试将180摄氏度的烘箱中干燥30秒后裸藻多糖取出后置于pH低于12的溶液中，该种裸藻多糖不能溶解，搅拌24h后，溶解性无改变(形态同图2)。说明本发明中加热处理后的裸藻多糖依然需要置于碱液中才能溶解。
因此，可以看出，本发明方法二中同时使用加热、碱液溶解这两步操作是缺一不可的，只有按照本发明方法的这两步操作的顺序，才能获得本发明可溶性裸藻多糖，方法二中使用加热处理、碱液溶解处理使用时具有协同效果。
实施例4
取6份裸藻多糖，每份10g，置于180摄氏度的烘箱中分别干燥8、10、30、80、120与150秒，后取出，后加入100mL浓度为1mol/L的NaOH(pH＝12.5)，轻微搅拌，干燥裸藻多糖粉末10、30、80、120与150秒的裸藻多糖粉末均在几分钟内消失溶解，溶解速度上没有显著差异，完全溶解后滴加5％的盐酸调节溶液的pH至7.0，结果表明，8秒烘干处理的裸藻多糖溶于碱再加入盐酸后仍然出现少些凝胶沉淀，而10、30、80、120与150秒干燥处理的裸藻多糖溶于碱再加入盐酸无沉淀出现，随着pH的降低到2，全程无胶状沉淀出现，静置24后，以上三个处理温度的溶液未出现与图2中非可溶裸藻多糖静置几分钟便沉淀的现象，且随着烘干时间的延长，加酸液后形成的可溶性裸藻多糖溶液透明度更高，但120秒烘干与150秒烘干在透光度值上没有显著性差异(图6)，因此本温度下最佳烘干时间为10～120秒。使用SBA-50B葡萄糖分析仪测定溶液中单糖浓度，测定结果表明，葡萄糖单糖浓度低于检测限，说明该发明方法制备不会导致多糖过度水解产生单糖分子，溶液中主要为可溶性裸藻多糖分子。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (2)
1.一种可溶性裸藻多糖的制备方法，其特征在于：所述方法为方法一或为方法二，其中，所述方法一包括以下步骤：
（1）碱溶解：使用pH＞12的碱液氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液溶解裸藻多糖，机械搅拌至裸藻多糖固体消失，为获得溶解彻底的裸藻多糖，其中碱液的体积≥5倍裸藻多糖固体体积；
（2）酸交联：滴加酸液，随着pH下降，溶液中出现胶絮状沉淀，滴加酸液至溶液pH=6；
（3）氧化断键：加氧化剂过氧化氢或过氧化钠或过氧化钙溶液或次氯酸或次氯酸钠，至溶液中过氧根浓度为0.01g/L~0.1 g/L或有效氯含量为0.1 g/L~1 g/L，搅拌至方法一中步骤（2）中形成的胶絮状沉淀消失，使得糖苷键部分断裂；
（4）调pH：滴加酸液或碱液，调pH至≤7的任一值，加入终浓度≥0.01 g/L的抗坏血酸以终止氧化反应，得到可溶性裸藻多糖；
（5）添加三倍原溶液体积的乙醇或一倍原溶液体积的异丙醇静置至絮状沉淀析出，获得沉淀的裸藻多糖，干燥后，获得可溶性裸藻多糖粉；
所述方法二包括以下步骤：
（1）高温断键：105℃至240℃烘烤裸藻多糖10秒至2分钟；
（2）碱溶解：使用pH＞12的碱液氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液溶解裸藻多糖，机械搅拌至裸藻多糖固体消失，为获得溶解彻底的裸藻多糖，其中碱液的体积≥5倍裸藻多糖固体体积；
（3）调pH：滴加酸液，调pH至≤7的任一值，期间不出现沉淀，得到可溶性裸藻多糖；
（4）再添加三倍原溶液体积的乙醇或一倍原溶液体积的异丙醇静置至絮状沉淀析出，获得沉淀的裸藻多糖，干燥后，获得可溶性裸藻多糖粉。
2.如权利要求1所述的可溶性裸藻多糖的制备方法制得的可溶性裸藻多糖在润肤霜、面膜中的应用。
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| CN102812048A (zh) * | 2010-03-09 | 2012-12-05 | 优瑞纳股份有限公司 | 过敏抑制物质 |
| CN111690075A (zh) * | 2019-03-15 | 2020-09-22 | 中国海洋大学 | 一种水溶性β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和保健品中的应用 |
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| "可德兰多糖-阿魏酸接枝共聚物的功能特性及其稳定β-胡萝卜素研究";蔡吴丹;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》(第2期);B024-314 * |
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