CN111690075A - 一种水溶性β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和保健品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶性β‑葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和保健品中的应用。本发明首先配制碱性脲水溶液并冷冻保存，然后加入不溶性β‑葡聚糖，搅拌溶解后冷冻，然后加热至适当温度，搅拌下滴加过氧化氢水溶液，调节pH至中性后进行透析，透析内液经减压浓缩、冷冻干燥，得到水溶性β‑葡聚糖。该方法通过在碱性脲水溶液中均相降解解决了不溶性β‑葡聚糖难以降解的技术难题。使用该方法得到的水溶性β‑葡聚糖能够显著增强巨噬细胞RAW 264.7的免疫活性并且有效拮抗肿瘤细胞。本发明制备的β‑葡聚糖，具有原料易得、制备工艺简单、生物活性强、易于产业化生产等优点，具有开发成为免疫增强和抗肿瘤药物的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种水溶性β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和保健品中的应用。
背景技术
β-葡聚糖是一类由β-构型的葡萄糖残基以不同连接方式组成的多糖，包括线性β-1，3-葡聚糖、线性β-1，4-葡聚糖、线性β-1，6-葡聚糖、混合排列的线性β-1，3 与β-1，4-葡聚糖，以及具有分支结构的β-1，3/1，4-葡聚糖和β-1，3/1，6-葡聚糖等，β- 葡聚糖类化合物在自然界中广泛存在，且不同结构的β-葡聚糖有不同的生物活性。例如，β-1，3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖可以通过激活巨噬细胞、自然杀伤细胞等发挥抗肿瘤作用，或通过增强免疫活性起到抗炎、抗病毒作用，还可以用作膳食纤维，能抑制胆固醇的吸收、改善肠道微生态等。来源于酵母、裂褶菌、小核真菌、金藻、角毛藻、裸藻和拟球藻的β-葡聚糖往往因分子量较大而于不溶于水，这就给β-葡聚糖生物活性的研究开发带来极大的困难。如酵母来源的β-葡聚糖，因来源丰富、生物活性良好引起了人们的关注，但由于其分子量大和特殊的螺旋结构而溶解性极差，给β-葡聚糖构效关系的研究带来了很多不便。因此，寻找有效制备水溶性β-葡聚糖的方法极为重要。
常见的β-葡聚糖降解方法有化学法、酶法和物理法等。无论哪种降解方法，都需要将原料溶解在适当的反应体系中，以保证降解的有效进行。目前，对于不溶于热水和强酸强碱的β-葡聚糖，还缺乏有效的方法对其进行高效率降解。
发明内容
为了解决不溶性β-葡聚糖难以降解的问题，本发明的目的是提供了一种水溶性β-葡聚糖及其制备方法和在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和保健品中的应用，本发明利用低温强碱脲水溶液将不溶性β-葡聚糖先溶解，再利用过氧化氢将其降解为水溶性β-葡聚糖。
本发明的目的还在于提供了水溶性β-葡聚糖在制备提高免疫力和抗肿瘤的药物或保健品中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种水溶性β-葡聚糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)配制强碱脲水溶液，使用前放入冰箱中冷冻；
(2)将不溶性β-葡聚糖加到所述强碱脲水溶液中得到混合溶液，搅拌至无沉淀，放入冰箱冷冻，得到透明、均匀的β-葡聚糖溶液；
(3)将上述β-葡聚糖溶液加热，搅拌下缓慢滴加过氧化氢水溶液进行降解；
(4)反应结束后，冷却至室温，调节pH至中性，加入饱和亚硫酸钠水溶液或者过氧化氢酶除去剩余的过氧化氢；离心后上清液经透析、减压浓缩、冷冻干燥，得到的产物即为水溶性β-葡聚糖。
进一步的：所述步骤(1)强碱脲水溶液中强碱为氢氧化钠或氢氧化钾，强碱重量占溶液总重量的1～40％，脲占溶液总重量的5～30％，使用前需将强碱脲水溶液在-20℃冰箱冷冻2～12h。
进一步的：所述步骤(2)中β-葡聚糖在混合溶液中的质量比为0.1～10％。
进一步的：所述步骤(2)中需在0～4℃下搅拌至无沉淀，然后在-20℃冰箱冷冻12～24h，得到透明、均匀的β-葡聚糖溶液。
进一步的：所述步骤(3)中将β-葡聚糖溶液在水浴中加热至20～80℃，搅拌下缓慢滴加过氧化氢水溶液，至过氧化氢质量浓度为0.5％～10％，反应时间控制在1～5h。
进一步的：所述步骤(4)中透析袋的截留分子量为1kDa。
进一步的：所述不溶性β-葡聚糖来源于：酵母、裂褶菌、小核真菌、金藻、角毛藻、裸藻、拟球藻、燕麦以及微生物发酵产物中的β-葡聚糖，且不溶于热水。其化学结构式如下：
本发明还提供了所述制备方法制得的水溶性β-葡聚糖。
进一步的：所述水溶性β-葡聚糖的分子量范围为1kDa-1500kDa。
本发明还提供了所述的水溶性β-葡聚糖在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和保健品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明提供了一种在强碱脲水溶液中以溶解状态进行均匀降解制备水溶性β-葡聚糖的方法。所述强碱脲溶液可以打破葡聚糖分子内及分子间的氢键，使三螺旋结构解聚，有助于它的溶解，这种强碱脲水溶液可以使多糖均匀分散在水溶液中，使多糖分子舒展；本发明进一步采用氧化能力强的羟自由基(·OH)进行降解，羟自由基反应速率常数大但寿命极短，降解效率高且没有二次污染，尤其反应条件温和、容易控制，有利于产业化放大。利用本发明方法得到的产物颜色洁白，水溶性强，克服了不溶性β- 葡聚糖因无法溶解而难以大规模应用的难题。大大扩大了其在制备提高免疫力和抗肿瘤的药物和保健品中的应用范围。
而且，本发明得到的水溶性酵母β-葡聚糖经细胞实验证明可以提高巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力并促进其释放细胞因子(NO和TNF-α)，而且具有拮抗肝癌细胞HepG2的作用，可用于制备提高免疫力和抗肿瘤的药物或保健品。
附图说明
图1为实施例1中制备的水溶性酵母β-葡聚糖13C-NMR分析图。
图2为实施例1中制备的水溶性酵母β-葡聚糖与刚果红结合实验图。
图3为运用高效凝胶渗透色谱与十八角激光光散射仪联用(HPGPC-MALLS) 测定的实施例1中水溶性酵母β-葡聚糖HPGPC图。
图4为运用高效凝胶渗透色谱与十八角激光光散射仪联用(HPGPC-MALLS) 测定的实例3中水溶性裸藻β-葡聚糖的HPGPC图。
图5为水溶性酵母β-葡聚糖对巨噬细胞RAW264.7存活率的影响。
图6为水溶性酵母β-葡聚糖刺激巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的作用。
图7为水溶性酵母β-葡聚糖刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO的作用。
图8为水溶性酵母β-葡聚糖刺激巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α的作用。
图9为水溶性酵母β-葡聚糖拮抗肝癌细胞HepG2免疫抑制活性的作用。
图10为水溶性酵母β-葡聚糖抑制肝癌细胞HepG2增殖的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例以啤酒酵母为原料提取不溶性酵母β-葡聚糖，按照本发明的技术方案制备水溶性酵母β-葡聚糖，具体步骤如下：
(1)酵母β-葡聚糖的提取：取新鲜啤酒酵母泥，置100目纱绢中水洗除去水溶性成分，沉淀物离心(5000r/min)10min，用去离子水洗涤三次，收集沉淀物。沉淀物按质量比1∶10加入1M的醋酸钠水溶液，用醋酸调pH值至5.5，再加入质量分数为3％的氯化钠，55℃搅拌24h，用2M氢氧化钠溶液中和至pH为 7后离心(5000r/min)10min，收集沉淀，按质量比1∶10加入0.5M氢氧化钠溶液，80℃加热搅拌2h，离心(5000r/min)10min，收集沉淀，用去离子水洗涤三次，即得到不溶于水和强酸强碱的酵母β-葡聚糖，该多糖以β-(1，3)-葡萄糖为主链，在主链C6位羟基具有分支，其化学结构式如下：
(2)配制氢氧化钠脲水溶液：其中氢氧化钠占溶液总重量的6％，脲占溶液总重量的18％，使用前将该溶液在-20℃冰箱冷冻8h。
(3)酵母β-葡聚糖的溶解：称取步骤(1)中啤酒酵母β-葡聚糖0.1g，加到20mL所述氢氧化钠脲水溶液中，β-葡聚糖在混合溶液中的质量浓度为0.5％，在冰浴下搅拌至无沉淀，然后在-20℃冰箱冷冻12h，得到透明、均匀的啤酒酵母β-葡聚糖溶液。
(4)水溶性酵母β-葡聚糖的制备：将冷冻后的β-葡聚糖溶液加热至60℃，滴加3％过氧化氢水溶液20mL，至过氧化氢终浓度为1.8％，反应3h后，冷却至室温，用1M盐酸中和至pH7～8，加入适量饱和亚硫酸钠水溶液除去剩余的过氧化氢，离心收集清液，然后用1kDa透析袋透析，透析内液经减压浓缩、冷冻干燥，得到水溶性酵母β-葡聚糖(BYGL)。
经采用核磁共振碳谱(13C-NMR)分析表明(图1)，本实例得到的水溶性酵母β-葡聚糖其主链结构为β-1，3-葡聚糖，在葡萄糖残基的C6位具有分支结构。经采用刚果红结合试验表明(图2)，该方法制备的β-1，3/1，6-葡聚糖具有超螺旋结构。运用高效凝胶渗透色谱与十八角激光光散射仪联用(HPGPC-MALLS)分析产物，其HPGPC图显示主要有三个具有不同分子量的组分(图3)。进一步将制得的水溶性酵母β-葡聚糖经Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱洗脱，得到水洗组分BYGL-H2O和0.5M NaCl洗脱组分BYGLS，再分别经 SephacrylS-300HR凝胶柱分离纯化，得到分子量为200kDa组分(BYGLH)，以及分子量依次为960kDa(BYGLS-1)、280kDa(BYGLS-2)和17kDa组分 (BYGLS-3)，所述四个不同分子量的组分均为水溶性的低分子量的β-葡聚糖。
实施例2
本实施例中水溶性β-葡聚糖的制备方法包括以下步骤：
(1)配制氢氧化钠脲水溶液：其中氢氧化钠占溶液总重量的8％，脲占溶液总重量的12％，使用前将该溶液在-20℃冰箱冷冻10h。
(2)酵母β-葡聚糖的溶解：称取0.24g啤酒酵母β-葡聚糖加到88mL所述氢氧化钠脲水溶液中，在冰浴中搅拌至无沉淀，然后在-20℃冰箱冷冻24h，得到透明、均匀的啤酒酵母β-葡聚糖溶液。
(3)水溶性酵母β-葡聚糖的制备：将冷冻后的β-葡聚糖溶液加热至70℃，缓慢滴加30％过氧化氢水溶液8mL，至过氧化氢终浓度为2.4％，多糖浓度为 0.25％，反应时间为2h。反应结束后，冷却至室温，用1M盐酸中和至pH5～6，加入适量过氧化氢酶除去剩余的过氧化氢，然后再进行透析，用分子量截留量为 1kDa透析袋透析脱盐，内液经减压浓缩、冷冻干燥，得到水溶性酵母β-葡聚糖。
运用高效凝胶渗透色谱与十八角激光光散射仪联用(HPGPC-MALLS)分析产物，主要存在三个组分，重均分子量(Mw)由高到低依次为304kDa、65kDa 和15kDa。
实施例3
本实施例对裸藻来源β-葡聚糖进行提取并制备水溶性β-葡聚糖，具体步骤如下：
(1)裸藻β-葡聚糖的提取：裸藻粉经乙醇回流脱脂三次后，离心，收集沉淀，按质量比1∶10加入0.5M氢氧化钾溶液，80℃加热搅拌2h，离心(5000r/min， 10min)，收集清液，盐酸中和后收集沉淀，用去离子水洗涤沉淀三次，再用乙醇、丙酮依次洗涤后烘干，得不溶性裸藻β-葡聚糖，其分子量大于500kDa，该多糖主要为β-(1，3)-葡聚糖，其化学结构式如下：
(2)配制氢氧化钠钾脲水溶液，其中氢氧化钾占溶液总重量的7％，脲占溶液总重量的17％，使用前需将该溶液在-20℃冰箱冷冻8h。
(3)裸藻β-葡聚糖的溶解：称取0.2g步骤(1)中所述裸藻多糖，加到40mL 氢氧化钾脲水溶液中，浓度为0.5％，在冰浴中搅拌至无沉淀，然后在-20℃冰箱冷冻24h，得均匀溶液。
(4)水溶性裸藻β-葡聚糖的制备：将上述裸藻多糖溶液加热至60℃，缓慢滴加3.6％过氧化氢水溶液40mL，至过氧化氢终浓度为2.0％，反应时间控制在 3h。反应结束后，冷却至室温，用1M盐酸中和至pH7～8，加入适量饱和亚硫酸钠水溶液除去剩余的过氧化氢，离心收集清液，然后再进行透析，用1kDa透析袋进行脱盐，经减压浓缩、冷冻干燥，得到水溶性裸藻β-葡聚糖。
运用高效凝胶渗透色谱与十八角激光光散射仪联用(HPGPC-MALLS)测定所制备产物，其HPGPC图显示所得水溶性裸藻β-葡聚糖具有单一组分(图4)，重均分子量(Mw)为20kDa。
实施例4：水溶性啤酒酵母β-葡聚糖体外免疫调节实验
本实施以香菇多糖(LNT)为阳性对照，探充实施例1中分离纯化得到的四个水溶性酵母β-葡聚糖组分BYGLH、BYGLS-1、BYGLS-2、BYGLS-3对巨噬细胞RAW264.7体外免疫调节作用，具体步骤如下：
(1)细胞培养：将巨噬细胞RAW264.7接种于RPMI-1640完全培养液中(含有10％FBS、100U/mL的链霉素和100U/mL青霉素)，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。
(2)MTT法细胞毒性实验：取巨噬细胞RAW 264.7加入RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为2×104个/mL，每孔100μL均匀铺于96孔板内，置CO2培养箱内培养至细胞贴壁，吸弃上清，分组为：调零组(只含培养基)、空白对照组(含细胞与培养基)、阳性对照组(含细胞和含10、25、50、100μg/mL LNT 的培养基)、实验组(含细胞和含10、25、50、100μg/mL样品的培养基)，各组重复5复孔，每孔100μL，CO2培养箱内培养24h后，每孔加入20ul 0.5％MTT 溶液，继续培养4h后小心吸去孔内上清，各孔加入150ul DMSO，置37℃摇床上振荡10min。用酶标仪于490nm处测量各孔吸光值，计算细胞存活率＝(A-A调零)/(A空白-A调零)×100％。
(3)巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红实验：取巨噬细胞RAW 264.7加入 RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔100μL均匀铺于96 孔板内，置CO2培养箱内培养至细胞贴壁，吸弃上清，分组为：调零组(只含培养基)、空白对照组(含细胞与培养基)、LPS对照组(含有细胞与含10μg/mL LPS的培养基)、阳性对照组(含细胞和含10、25、50、100μg/mL LNT的培养基)、实验组(含细胞和含10、25、50、100μg/mL样品的培养基)，各组重复 5复孔，每孔100μL，于CO2培养箱培养24h，弃上清。各孔用PBS小心冲洗一遍后，每孔加入100μL0.1％的中性红溶液，避光孵育40min，小心吸弃中性红溶液，每孔200μLPBS，小心冲洗三遍，吸干后每孔加入100μL细胞裂解液(醋酸∶无水乙醇＝1∶1)，于4℃摇床低速振荡1h，用酶标仪于570nm处测量各孔吸光值，计算各组吞噬活性＝(A-A调零)/(A空白-A调零)×100％。
(4)巨噬细胞RAW264.7释放NO和TNF-α实验：取巨噬细胞RAW 264.7 加入RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为1×105个/mL，每孔100μL均匀铺于 96孔板内，置于CO2培养箱培养至贴壁，弃去上清，分组为：调零组(只含培养基)、空白对照组(含细胞与培养基)、LPS对照组(含有细胞与含10μg/mL LPS的培养基)、阳性对照组(含细胞和含10、25、50、100μg/mL LNT的培养基)、实验组(含细胞和含10、25、50、100μg/mL样品的培养基)，各组重复 5复孔，每孔100μL，于CO2培养箱培养24h，收集细胞上清，离心(1000r/min， 15min)，并按Griess试剂盒、小鼠TNF-α ELISA试剂盒说明书进行实验操作，分别于520nm、450nm处处测定各孔吸光值，计算NO、TNF-α释放水平。
如图5所示，在浓度为10～100μg/mL时，LNT、BYGLH、BYGLS-1、BYGLS-2、 BYGLS-3对巨噬细胞RAW264.7均无细胞毒性，并在一定浓度范围内具有增殖活性。如LNT和BYGLH在50μg/mL时与对照组相比具有显著性差异；BYGLS-1 在10～50μg/mL时与对照组相比具有显著性差异；BYGLS-2在10μg/mL和 100μg/mL时与对照组相比具有显著性差异；BYGLS-3在25～100μg/mL时与对照组相比具有显著性差异。
如图6所示，BYGLH、BYGLS-1和BYGLS-3能够促进巨噬细胞RAW264.7 的吞噬作用，其中BYGLH和BYGLS-1在浓度为10～100μg/mL时与对照组相比具有显著性差异，BYGLS-3在浓度为10μg/mL和100μg/mL时与对照组相比具有显著性差异。
如图7所示，LNT、BYGLS-1和BYGLS-3能够促进巨噬细胞RAW264.7释放NO，其中LNT和BYGLS-3在浓度为10μg/mL时与对照组相比具有显著性差异，BYGLS-1在浓度为25～100μg/mL时与对照组相比具有显著性差异，且呈剂量依赖性增加。
如图8所示，LNT、BYGLH、BYGLS-1、BYGLS-2、BYGLS-3均能促进巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-a，LNT在50μg/mL、100μg/mL时与对照组相比具有显著性差异，BYGLH、BYGLS-2和BYGLS-3在25～100μg/mL时与对照组相比具有显著性差异，且呈剂量依赖性，BYGLS-1在10～100μg/mL时与对照组相比具有显著性差异，且呈剂量依赖性增加。
综合以上指标，应用本发明所述的降解方法制备的水溶性啤酒酵母β-葡聚糖具有很强的免疫调节活性。
注：与空白对照组(Control)比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，#P＜0.0001。
实施例5：水溶性酵母β-葡聚糖拮抗肝癌细胞HepG2作用的研究
本实施以香菇多糖(LNT)为阳性对照，探充实施例1中分离纯化得到的四个水溶性酵母β-葡聚糖组分BYGLH、BYGLS-1、BYGLS-2、BYGLS-3拮抗肝癌细胞HepG2的作用，具体步骤如下：
(1)肝癌细胞HepG2培养基上清液的制备：取对数生长期的肝癌细胞 HepG2，用胰酶消化后，经1000r/min离心5min，吸弃上清，加入完全培养基调整细胞浓度为5.0×104/mL，接种于50mL培养瓶中，每瓶10mL细胞悬液，置于 37℃，5％CO2细胞培养箱中培养至细胞长满瓶底80％时换液，继续培养8h后，收集培养基上清液，0.22μm滤膜过滤，-20℃保存备用。
(2)水溶性酵母β-葡聚糖拮抗HepG2免疫抑制活性的研究：取巨噬细胞 RAW264.7加入RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为2×104个/mL，每孔100μL 均匀铺于96孔板内，置于CO2培养箱培养至贴壁，吸弃上清，并分组为：调零组(只含培养基)、空白对照组(含细胞与培养基)；实验组(含细胞与HepG2 培养上清)、实验组(为HepG2培养上清配制的不同浓度的多糖组，浓度为10、 25、50、100μg/mL)，各组重复5复孔，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h，每孔加入20ul 0.5％MTT溶液，继续培养4h后小心吸去孔内上清，各孔加入150ul DMSO，置37℃摇床上振荡10min。用酶标仪于490nm处测量各孔吸光值，计算细胞存活率＝(A-A调零)/(A空白-A调零)×100％。
(3)水溶性酵母β-葡聚糖抑HepG2增殖作用：取巨噬细胞RAW 264.7加入RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为2×104个/mL，每孔100ul均匀铺于 96孔板内，置于CO2培养箱培养至贴壁，吸弃上清，分组为：调零组(只含培养基)、空白对照组(含细胞与培养基)、阳性对照组(含细胞和含50μg/mL LNT 的培养基)、实验组(含细胞和含50μg/mL样品的培养基)，各组重复5复孔，每孔100ul，置于CO2培养箱内培养24h，每孔加入20ul 0.5％MTT溶液，继续培养4h后小心吸去孔内上清，各孔加入150ul DMSO，置37℃摇床上振荡10min。用酶标仪于490nm处测量各孔吸光值，计算细胞存活率＝(A-A调零)/(A空白-A调零)×100％。
从图9可知，与空白对照组比较，巨噬细胞RAW264.7在HepG2培养基上清液的作用下，存活率显著降低，但加入LNT、BYGLH、BYGLS-1、BYGLS-2、 BYGLS-3后，存活率显著升高，说明应用本发明所制备的水溶性酵母β-葡聚糖能够有效拮抗肝癌细胞HepG2抑制巨噬细胞RAW264.7生长的作用，能够解除肿瘤对巨噬细胞的免疫抑制，在肿瘤免疫治疗方面具有极大的开发前景。
注：与HepG2培养上清组(HepG2-S)比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，#P＜0.0001。
从图10可知，LNT、BYGLH、BYGLS-1、BYGLS-2、BYGLS-3对HepG2 均有抑制增殖的作用，其中BYGLS-1的抑制率达到31.74％，显著高于其他组分， BYGLS-2、BYGLS-3的抑制率为22.30和20.39％，其抑制率显著高于阳性对照药LNT。说明应用本发明所制备的水溶性酵母β-葡聚糖能够有效抑制肝癌细胞 HepG2的生长，可应用于抗肿瘤药物的开发应用。
注：与阳性对照组(LNT)比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，#P＜0.0001。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实例对本发明进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种水溶性β-葡聚糖的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）配制强碱脲水溶液，使用前先冷冻；
（2）将不溶性β-葡聚糖加到所述强碱脲水溶液中得到混合溶液，搅拌至无沉淀，放入冰箱冷冻，得到透明、均匀的β-葡聚糖溶液；
（3）将上述β-葡聚糖溶液加热，搅拌下缓慢滴加过氧化氢水溶液进行降解；
（4）反应结束后，冷却至室温，调节pH至中性，加入饱和亚硫酸钠水溶液或者过氧化氢酶除去剩余的过氧化氢；离心后上清液经透析、减压浓缩、冷冻干燥，得到的产物即为水溶性β-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的水溶性β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）强碱脲水溶液中强碱为氢氧化钠或氢氧化钾，强碱重量占溶液总重量的1~40%，脲占溶液总重量的5~30%。
3.根据权利要求1所述的水溶性β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中β-葡聚糖在混合溶液中的质量比为0.1~10%。
4.根据权利要求1所述的水溶性β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中需在0~4℃下搅拌至无沉淀，然后在-20℃冰箱冷冻12~24h，得到透明、均匀的β-葡聚糖溶液。
5.根据权利要求1所述的水溶性β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中将β-葡聚糖溶液在水浴中加热至20~80℃，搅拌下缓慢滴加过氧化氢水溶液，至过氧化氢质量浓度为0.5%~10%。
6.根据权利要求1所述的水溶性β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述不溶性β-葡聚糖来源于：酵母、裂褶菌、小核真菌、金藻、角毛藻、裸藻、拟球藻、燕麦以及微生物发酵产物中的β-葡聚糖，且不溶于热水。
7.权利要求1-6任一项所述制备方法制得的水溶性β-葡聚糖。
8.根据权利要求7所述的水溶性β-葡聚糖，其特征在于，所述水溶性β-葡聚糖的分子量范围为1kDa-1500kDa。
9.权利要求7所述的水溶性β-葡聚糖在制备免疫增强和抗肿瘤的药物和保健品中的应用。
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