CN114703253B - 一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于高通量测序技术领域，尤其涉及一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂及其应用。其组分包括甘油、1,2丙二醇、乙二醇和海藻糖。本申请提供的添加剂对DNA建库试剂中的末端修复试剂与接头连接试剂中的酶成分有保护作用，可延长其保存稳定性，保证构建的文库产量稳定，且不影响文库本身的性质。
Description
技术领域
本发明属于高通量测序技术领域，尤其涉及一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂及其应用。
背景技术
21世纪初，以Roche454技术、illumina公司的Genome Analyzer技术和ABI公司的Solid技术为标志的第二代高通量测序技术诞生了。第二代高通量测序大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确性。
常规的高通量测序技术，需要先构建适合测序仪读取的测序文库。测序文库由从生物中提取的核酸，经过末端修复、接头连接、文库富集3个主要流程构建而成。末端修复流程即通过磷酸酶、聚合酶，将核酸的末端进行补平，再增加一个A碱基。接头连接为通过DNA连接酶，将接头序列连接到核酸的两端。文库富集为使用与接头相匹配的引物，通过PCR扩增，对核酸序列进行富集，为的是在较低的样本起始量的情况下，满足仪器测序要求的量与后续的实验要求。在实际实验中，还要使用磁珠来纯化中间产物和终产物两次，整个实验较为繁琐，所以目前市场上出现了多种自动移液工作站替代人工操作。但是在文库构建过程中的末端修复与接头连接体系，是由多种工具酶与对应的工作缓冲液组成，这些复杂的工具酶与缓冲液通常要保存在-20℃以下温度以保持试剂的性能稳定，而目前大多数自动移液工作站通常不带有温控模块或者只能提供2～8℃的储存温度，在这些自动移液工作站中，需要频繁更换试剂，或容易发生试剂性能降低导致文库构建失败的情况。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂，包括：甘油、1,2丙二醇、乙二醇、海藻糖、水。
进一步地，海藻糖的浓度为0.2M-1M。
进一步地，包括20～50％(v/v)的甘油，20～50％(v/v)的1,2丙二醇，10～40％(v/v)的乙二醇，10～40％(v/v)的海藻糖。
进一步地，甘油、1,2丙二醇、乙二醇、海藻糖、水的体积用量比优选为2：2：1：1：4。
本发明还提供了一种匹配自动化移液工作站的试剂盒，包含如上述的添加剂。
进一步地，还包括末端修复试剂预混液、接头连接试剂预混液，接头预混液中的至少一种，其中末端修复试剂预混液与接头连接试剂预混液中添加如权利要求1-4中任一所述的添加剂。
进一步地，还包括Endprep Enzymes、Endprep Buffer、Ligation Enzymes、Ligation Buffer、Truncated DNA adapter中的至少一种。
本发明还提供了如上述的添加剂在提高DNA末端修复试剂与接头连接试剂中的酶的存储稳定性中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本申请提供了一种可提高末端修复与接头连接试剂的存储稳定性的添加剂，特别是低温和室温储存的稳定性。可以在不影响核酸文库构建的基础上，延长试剂在2～8℃以及室温存储的时间，能够缓解试剂失效，节约人力与物料成本。
附图说明
图1是添加添加剂后，保存于4℃的试剂建库Qsep-100质检结果图。取适量产物稀释至2ng/μl，使用Qsep-100进行毛细管凝胶电泳检测片段大小及分布，可见，与对照相比，8个样本的片段分布基本一致，属于合格的文库。
图2是添加添加剂后，保存于25℃的试剂建库Qsep-100质检结果图。与对照相比，25℃储存1天、2天、3天、5天、7天的5个样本峰形基本一致，属于合格文库。当储存至14天时，文库出现双峰，为不合格文库。
图3是不同物种的文库片段大小分布图。在不同物种中，与对照相比，添加稳定性添加剂并不会对峰形产生明显影响，每个物种的文库峰形基本一致。
图4是文库测序结果，在不同物种中，测序覆盖度与不同GC含量区间变化关系。在不同物种中，3个文库的覆盖度与GC百分比的变化趋势基本一致，无明显差异，说明稳定性添加剂不会对测序结果造成影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂及其应用。本申请提供的添加剂对DNA建库试剂中的末端修复试剂与接头连接试剂中的酶成分有保护作用，可延长其保存稳定性，保证构建的文库产量稳定，且不影响文库本身的性质。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1稳定性添加剂的配制
1、不同浓度的海藻糖溶液配制
使用D-(+)-海藻糖二水合物(Sigma,T9531-5G)进行溶液配制
表1不同浓度的海藻糖溶液配制表
| 编号 | 海藻糖质量 | 添加水体积 | 终浓度 |
| 1 | 0.76g | 10ml | 0.2M |
2、稳定性添加剂母液的配制
使用的甘油(沪试)，1,2丙二醇(Sigma-398039-25ML,)，乙二醇(沪试)
表2稳定性添加剂母液配制表
实施例2添加剂与末端修复试剂、对接头连接试剂的预混液制备
试剂准备：Endprep Enzymes，Endprep Buffer，Ligation Enzymes，LigationBuffer均来自试剂Rapid Plus DNA Lib Prep Kit for Illumina(Abclonal，RK20208)，Truncated DNA adapter来自Truncated DNA Adapter Kit for Illumina(Abclonal，RK20294)。将表2中配制的稳定性添加剂1，按照表3进行配制，得到末端修复试剂预混液。
表3末端修复试剂预混液配制表
| 编号 | 试剂名称 | 体积 |
| 1 | Endprep Enzymes | 300μL |
| 2 | Endprep Buffer | 700μL |
| 3 | 稳定性添加剂 | 1000μL |
| 总计 | 2000μL |
将表2中配制的稳定性添加剂1，按照表4进行配制，得到接头连接试剂预混液。
表4接头连接试剂预混液配制表
| 编号 | 试剂名称 | 体积 |
| 1 | Liagtion Enzymes | 1000μL |
| 2 | Ligation Buffer | 1000μL |
| 3 | 稳定性添加剂 | 800μL |
| 总计 | 2800μL |
按照表5所述，配制接头预混液。
表5接头预混液配制表
| 编号 | 试剂名称 | 体积 |
| 1 | Truncated DNA adapter | 200μL |
| 2 | Ligation Buffer | 2000μL |
| 总计 | 2200μL |
实施例3适用于自动移液工作站的建库试剂盒稳定性测试
本实施实例以人基因组为例，测试自动移液工作站建库试剂盒的保存稳定性，其中的末端修复试剂预混液，接头连接试剂预混液中添加了本申请中提供的稳定性添加剂。以文库产量是否合格、文库片段大小分布、液相捕获效果作为综合评价标准。
1.样本：人gDNA样品(使用磁珠法血液基因组DNA小量提取试剂盒(白垩纪，CNA00390))。
2.样本准备：
将Covaris S220非接触式超声波破碎仪(美国Chromatin Shearin)提前预冷至4～10℃，取5μg DNA样品，放入Covaris S220专用管中，不足的部分使用纯水补充体积至130μL，按照仪器使用说明调节打断功率与程序，开启Covaris S220将该DNA样本进行超声破碎，获得主峰在300bp大小的DNA片段，使用Qubit(Invitrogen)进行定量。重复上述过程两次，共取15μg的DNA样本进行片段化处理，将处理后的样本混匀，使用Qubit(Invitrogen)进行定量结果为34ng/μL，总体积为375μL。
3.试剂准备：
按照表3，表4，表5进行试剂准备，Endprep Enzymes，Endprep Buffer，LigationEnzymes，Ligation Buffer均来自试剂Rapid Plus DNA Lib Prep Kit for Illumina(Abclonal，RK20208)，Truncated DNA adapter来自Truncated DNA Adapter Kit forIllumina(Abclonal，RK20294)，得到末端修复试剂预混液A1、接头连接试剂预混液A2和接头预混液A3。
作为对照，配制一组不添加添加剂的试剂(末端修复试剂预混液B1，接头连接试剂预混液B2，接头预混液B3)。配制一组将添加剂替换为等体积纯水的试剂(末端修复试剂预混液C1，接头连接试剂预混液C2，接头预混液C3)。
将配制好的试剂(即添加了稳定性添加剂的试剂，不添加添加剂的试剂，添加纯水的试剂)放置于4℃冰箱和25℃的恒温箱内，在第1、2、3、5、7、14、21、28天取3次反应试剂量。1次反应的试剂量包括20μL的末端修复预混液(A1、C1)，28μL的接头连接预混液(A2、C2)，20μL的接头预混液(A3、B3、C3)，不添加添加剂组取10μL B1，18μL B2。取出的试剂于-20℃保存。
4.建库测试
使用的自动移液站为奥美泰克公司的LH-1808，取出第三步中保存的试剂进行自动建库实验，取一直在-20℃保存的试剂作为对照。每个样本的投入量为50ng，即吸取1.5μL的样本，补充纯水至体积为5μL。将样本，末端修复试剂预混液(A1、B1、C1，其中B1每个反应需补充纯水10μL)，接头连接试剂预混液(A2、B2、C2，其中B2每个反应需补充纯水10μL)，接头预混液(A3、B3、C3)，2x master PCR mix(Kapa，KK2631)，Universal PCR primer与PCRIndex primer转移至仪器内，运行程序。
具体程序如下：
1.移液模块吸取20μL末端修复试剂预混液A1至样本孔，混匀；
2.加热至30℃，30min，65℃，30min；
3.移液模块吸取28μL接头连接预混液A2、22μL接头预混液A3至样本孔中，混匀；
4.20℃孵育，15min；
5.转移所有液体至磁珠纯化模块，其中含有纯化磁珠与清洗液，移液模块将纯化磁珠与样本液混匀后，室温静置5min，随后磁体模块对磁珠进行吸附，5min后移液模块将上清液转移至废液孔。
6.使用500μL清洗液清洗磁珠两次，再使用移液模块将上清液转移至废液孔，期间保持磁体模块不动；
7.移除磁体模块，移液模块转移25μL纯水进入纯化孔，混匀后室温静置3分钟；
8.使用磁体模块对磁珠进行吸附，转移20μL的上清液至PCR反应孔中，PCR反应孔中有25μL 2x PCR mix(Kapa，KK2631)，再转移5μL的Universal PCR primer与PCR Indexprimer至PCR反应孔内；
9.反应程序
10.反应结束后，移液模块将反应液转移至磁珠纯化模块，其中含有纯化磁珠与清洗液，移液模块将纯化磁珠与反应液混匀后，室温静置5min，随后磁体模块对磁珠进行吸附，5min后移液模块将上清液转移至废液孔。
11.使用500μL清洗液清洗磁珠两次，再使用移液模块将上清液转移至废液孔，期间保持磁体模块不动；
12.移除磁体模块，移液模块转移25μL纯水进入纯化孔，混匀后室温静置3分钟；
13.使用磁体模块对磁珠进行吸附，转移20μL的上清液至文库孔中待用。
使用自动移液站完成构建文库，再使用Qubit(Invitrogen)进行文库定量，使用Qsep-100(光鼎生物)或LabChipGX(Caliper)进行质检。
同样的，对不添加添加剂的试剂组(B1、B2、B3)，添加纯水的试剂组(C1、C2、C3)和对照组都进行建库、定量与质检。
Qubit定量结果如表6，作为对照放置于-20℃保存的试剂建库产量为1379ng、1402ng、1310ng，平均值为1364ng。
表6Qubit定量结果
为满足后续步骤起始量需求，文库产量需大于等于500ng且峰形正常为建库合格。从文库产量定量结果来看，与-20℃保存的对照试剂相比，添加稳定性添加剂的试剂可以在4℃保存14天产量无明显下降，保存28天产量下降约17％但建库合格；在25℃保存3天产量无明显下降，保存5天产量下降约22％，保存7天建库合格。不添加添加剂的试剂可以在4℃保存1天产量无明显下降，在4℃保存5天产量下降约25％，保存7天建库合格；在25℃保存1天产量下降46％，保存1天建库合格。添加纯水的试剂在4℃保存2天产量下降39％，保存3天建库合格；在25℃保存1天产量下降39％，保存1天建库合格。表明添加剂对试剂在4℃与25℃存放的稳定性有较大提升。(Too low表示定量结果低于检测下限)
对产物使用Qsep-100(光鼎生物)进行分析，结果如图1。
实施例4适用于自动移液工作站的建库试剂盒对不同物种样本兼容性测试
1.样本：人gDNA样品(使用磁珠法血液基因组DNA小量提取试剂盒(白垩纪，CNA00390))；小鼠DNA样本(使用柱式鼠尾DNA提取试剂盒(百奥莱博，BTN121102-XQA))；水稻DNA样本(使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根，DP320))。
2.样本准备：
将Covaris S220非接触式超声波破碎仪(美国Chromatin Shearin)提前预冷至4～10℃，取2μg DNA样品，放入Covaris S220专用管中，不足的部分使用纯水补充体积至130μL，按照仪器使用说明调节打断功率与程序，开启Covaris S220将该DNA样本进行超声破碎，获得主峰在300bp大小的DNA片段，使用Qubit(Invitrogen)进行定量。使用Qubit(Invitrogen)进行定量如表7，总体积为125μL。
3.试剂准备：按照表3，表4，表5进行试剂准备，得到末端修复试剂预混液、接头连接试剂预混液和接头预混液。
4.建库测试
使用的自动移液站为奥美泰克公司的LH-1808，进行自动建库实验。每个样本的投入量为50ng，补充纯水至体积为5μL，将样本，末端修复试剂预混液，接头连接试剂预混液，接头预混液，2x master PCR mix(Kapa，KK2631)，Universal PCR primer与PCR Indexprimer转移至仪器内，每个样本构建2个文库。
同时取不添加添加剂的试剂进行测试，不足体积使用纯水补充至一致，每个样本构建1个文库。
建库程序如实施实例3中第四步所示。
使用Qubit(Invitrogen)进行文库定量见表8，使用Qsep-100(光鼎生物)进行质检见图3。
表8不同物种DNA建库产量表
| 试剂 | 物种 | 产量(ng) |
| 自动化试剂1 | Human | 1374 |
| 自动化试剂2 | Human | 1326 |
| 不添加添加剂试剂3 | Human | 1400 |
| 自动化试剂1 | Mouse | 1620 |
| 自动化试剂2 | Mouse | 1530 |
| 不添加添加剂试剂3 | Mouse | 1680 |
| 自动化试剂1 | Rice | 1341 |
| 自动化试剂2 | Rice | 1284 |
| 不添加添加剂试剂3 | Rice | 1341 |
所有文库产量均大于500ng，建库合格，对合格的文库进行高通量测序检测。将上述构建的9个文库每个取500ng，使用Illumina NovaSeq平台进行测序，每个文库测序3G，测序数据如表9。
表9各物种测序数据分析表
与每个物种的不添加添加剂的对照组3来进行比较，测序数据质量，GC_Content，Mapping_Rate，Duplication几个指标无明显差异，说明稳定性添加剂对测序结果无影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种提高测序文库建库体系稳定性的添加剂在提高DNA末端修复试剂与接头连接试剂中的酶的存储稳定性中的应用，其特征在于，所述添加剂由甘油、1,2丙二醇、乙二醇、海藻糖和水组成，甘油、1,2丙二醇、乙二醇、海藻糖溶液和水的体积用量比为2：2：1：1：4，其中，所述海藻糖溶液的浓度为0.2M-1M，所述存储温度为25℃。
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|---|
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