CN114672571A

CN114672571A - 用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN114672571A
Application number: CN202210127758.6A
Authority: CN
Inventors: 陆兔林; 赵晓莉; 毛春芹; 毛靖; 许金国; 苏雪蓉; 谢颖; 娄悦
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2022-02-11
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2042-02-11
Also published as: CN114672571B

Abstract

本发明涉及用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对、试剂盒及应用，该特异性引物对由正向引物和反向引物组成，其正向引物核苷酸序列为：CTAGCAACCTAGCCCATGTG；反向引物核苷酸序列为：GGATCTCCTCCTCCAGAAGG。本发明还提供前述特异性引物对在鳖血鉴定中的应用。本发明的特异性引物对特异性好，只需要在一个反应体系内进行聚合酶链式反应（PCR）扩增反应，仅1 h即能快速、准确鉴定炮制辅料鳖血和其他动物血液，并能实现鳖血与其他动物的鉴别，为鳖血提供完善、客观、稳定、准确、科学可靠的鉴定方法。

Description

用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物制品鉴定及分子标记技术领域，尤其涉及用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对、试剂盒及应用。

背景技术

鳖血系鳖科动物中华鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的新鲜血液，由于鳖血具有滋阴清热、活血通络的功效，因此被广泛记载并应用于中国传统医药中。通过对历代本草典籍的考证发现，鳖血除直接药用之外，还是一种具有中药传统特色的炮制辅料，用以填血滋阴，抑制药物浮阳之性，增强清肝退热之效，主要用于炮制柴胡、胡黄连、黄连、青蒿、甘草节等饮片，并应用于方剂中，其中鳖血柴胡饮片作为江西樟帮特色炮制方法沿用至今。据文献记载，每100kg柴胡药材炮制需要活鳖200个，即近6L鳖血。鳖血药效显著但量少难取，目前鳖血作为中药炮制辅料的质量标准尚缺乏专属性鉴别，而血液类药材存在以猪血牛血等量大易得动物血液掺伪现象，并且不同种属动物血液仅从形态上难以区分。炮制辅料鳖血基原无从保证，直接影响用其作为辅料炮制的中药饮片的质量及其临床用药的安全性和有效性，因此急需一系列专属性强、科学可靠的检测鳖血辅料的方法。传统的性状鉴定方法易受采集加工、储存等因素影响，性状差异较大，主观性较强；使用单一成分鉴定具有局限性，同时近缘物种的化学成分差异较小，不易直接观察。

特异性PCR鉴别技术基于物种DNA序列，通过设计具有物种特异性的引物，进行聚合酶链式反应扩增出目标条带从而进行物种鉴别，具有分析速度快、结果准确的优点。目前聚合酶链式反应法(PCR)已经纳入2020版《中国药典》，而目前对炮制辅料鳖血完整的科学鉴定方法，特别在炮制辅料鳖血的分子生物学、生物化学方面的特征性鉴定尚无依据可询，因此用高科技建立鳖血产品的分子生物学、生物化学方面的特征性鉴定手段，成为当前紧要任务。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是根据样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。经文献查证和试验研究，不同种属样品在蛋白条带数目、大小上均不相同，同种属样品在蛋白条带数目、大小上保持一致，可有效鉴别炮制辅料鳖血质量。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对及其应用，为辅料鳖血的真伪提供科学可靠的鉴定方法。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对，

正向引物核苷酸序列为：CTAGCAACCTAGCCCATGTG；

反向引物核苷酸序列为：GGATCTCCTCCTCCAGAAGG。

本发明的另一目的在于提供上述特异性引物对在制备用于鉴定炮制辅料鳖血的试剂盒中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种用于鉴定炮制辅料鳖血的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述特异性引物对。

作为一种优选的实施方式，所述试剂盒，还包括PCR反应的试剂。

本发明的再一目的在于提供上述特异性引物对在鉴定炮制辅料鳖血中的应用。

作为一种优选的实施方式，上述应用包括：提取待鉴定样品基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用所述特异性引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测，在286bp处检测出条带的样品鉴定为鳖血，在286bp处未检测出条带的样品鉴定为其他动物血液。

作为一种优选的实施方式，上述应用包括，提取待鉴定样品基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用所述特异性引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行基原鉴定。

作为一种优选的实施方式，所述PCR扩增的反应体系如下：

基因组DNA提取物100ng；

2×Rapid Taq Master Mix 5μL；

正向引物和反向引物各(10μM)0.2μL；

双蒸水补足至10μL。

作为一种优选的实施方式，所述PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，进行29次扩增循环，72℃彻底延伸3min。

作为一种优选的实施方式，上述应用还包括，在利用特异性引物对对待测样品进行基因水平的鉴定后，基于SDS-PAGE方法对待测样品进行蛋白水平的鉴定。

本发明具有如下有益效果：

(1)中华鳖鳖血的传统性状鉴定方法主观性强，且易受采集加工、储存等因素影响，且血液类药材单从性状上难以分辨；使用单一成分鉴定具有局限性，同时近缘物种化学成分差异较小；使用氨基酸薄层色谱鉴别不具有专属性。本发明设计用于炮制辅料鳖血鉴定的特异性引物对，针对该引物对建立PCR反应体系，能在40min内对大批量炮制辅料鳖血样品进行PCR扩增，进一步对PCR产物进行电泳检测若扩增出286bp的条带，表示其中含有中华鳖鳖血，在286bp处未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其它动物血液。针对PCR产物进行测序，将测序结果与中华鳖序列进行比对，根据比对结果判断辅料基原物种的真伪。

对所含特异蛋白成分的SDS-PAGE试验鉴定，若经处理后的凝胶出现鳖血的特征谱带则表示所述鳖血辅料中含有鳖血特异蛋白成分；本发明从基因水平和蛋白水平为鳖血辅料的真伪提供科学、客观、稳定、准确、可靠的鉴定方法。

(2)基因组DNA稳定性好，可于-20℃长期保存，PCR产物于-20℃保存稳定性好，相较于传统鉴别技术供试品保存期更长，且扩增及电泳全程自动化，相较于传统鉴别技术手段更加便捷、稳定、客观、准确。

(3)本发明设计的特异性引物对特异性好，能有效区分中华鳖鳖血辅料及其它动物血液。

附图说明

图1是退火温度优选的电泳检测图谱；图中M：Trans DNA Marker II；N：阴性对照；泳道1：炮制辅料鳖血；2：驴血；3：牛血；4：鸡血；5：羊血；6：猪血；7：兔血。

图2是变性-退火-延伸循环次数优选的电泳检测图谱；图中M:Trans DNA MarkerII；N：阴性对照；泳道1：炮制辅料鳖血；2：驴血；3：牛血；4：鸡血；5：羊血；6：猪血；7：兔血。

图3是引物用量优选的电泳检测图谱；图中M:Trans DNA Marker II；N：阴性对照；泳道1：炮制辅料鳖血；2：驴血；3：牛血；4：鸡血；5：羊血；6：猪血；7：兔血。

图4是模板DNA用量优选的电泳检测图谱；图中M:Trans DNA Marker II；N：阴性对照；泳道1：炮制辅料鳖血；2：驴血；3：牛血；4：鸡血；5：羊血；6：猪血；7：兔血。

图5是不同型号仪器的适用性考察；图中M:Trans DNA Marker II；N：阴性对照；泳道1：炮制辅料鳖血；2：驴血；3：牛血；4：鸡血；5：羊血；6：猪血；7：兔血。

图6是实施例2电泳检测图谱；

图中：

A：M：Trans DNA Marker II；N：阴性对照；泳道1～12为不同产地炮制辅料鳖血；

B：M：Trans DNA Marker II；泳道1：炮制辅料鳖血；2：驴血；3：牛血；4：鸡血；5：羊血；6：猪血；7：兔血；

C：M：Trans DNA Marker II；N：阴性对照，泳道1～7为等比掺伪驴血、牛血、鸡血、羊血、猪血、兔血样品模板DNA与各自引物反应谱带；

D：M：Trans DNA Marker II；N：阴性对照，泳道1～7炮制辅料鳖血样品模板DNA分别与中华鳖、驴、牛、鸡、羊、猪、兔引物反应谱带，泳道8～14：空白对照。

图7是实施例3电泳检测图谱；泳道1：蛋白Marker；2：驴血；3：猪血；4：兔血；5：鸡血；6：牛血；7：羊血；泳道8～14不同产地的炮制辅料鳖血。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，不是对本技术方案的限制。

实施例1特异性引物对设计

使用CO I通用引物HCO2198/LCO1490在4批炮制辅料鳖血样品中扩增获得约700bp条带并成功测序，根据测得CO I序列(如SEQ ID NO：1所示)于NCBI下载所有登录的鳖科及常见动物驴、牛、鸡、羊、猪、兔CO I序列一起使用Clustal W程序进行多重序列比对，分析差异SNP位点。从中获得3个特异性SNP位点，其中306位为C(以GenBank序列JF700184.1为参照)，394位为G，520位为T，为中华鳖特有SNP位点，可用于炮制辅料鳖血及其混伪品鉴别，通过Primer Premier 6设计出4对中华鳖特异性鉴别引物，并在ZHB1基础上，于正向引物3’端的倒数第2位引入错配碱基设计出ZHB2，在正向引物3’端的倒数第2位和倒数第4位引入2个错配碱基设计出ZHB3，上述引物核苷酸序列如下：

ZHB1.F(5’-3’)：ACTTCTCCTAGCATCATCAGGC；

ZHB1.R(5’-3’)：CTGCGGCTAACACTGGTAGT；

ZHB2.F(5’-3’)：ACTTCTCCTAGCATCATCAGCC；

ZHB2.R(5’-3’)：CTGCGGCTAACACTGGTAGT；

ZHB3.F(5’-3’)：TTCTCCTAGCATCATCCGCC；

ZHB3.R(5’-3’)：CTGCGGCTAACACTGGTAGT；

ZHB286.F(5’-3’)：CTAGCAACCTAGCCCATGTG；

ZHB286.R(5’-3’)：GGATCTCCTCCTCCAGAAGG。

利用所设计引物对辅料鳖血和常见动物驴、牛、鸡、羊、猪、兔血液样品进行PCR扩增，仅ZHB286能得到长度为286bp单一明亮的特异性条带，其余3对引物在同一条件下无明显特异性条带，或存在非特异性条带，因此将ZHB286作为炮制辅料鳖血的特异性引物。

实施例2 PCR扩增条件优化

根据实施例1获取的特异性引物组和扩增产物的T_m值、长度设置PCR反应体系与扩增程序，以炮制辅料鳖血及常用动物血液样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增。具体如下：

PCR反应体系为10μL，基因组DNA提取物100ng；2×Rapid Taq Master Mix 5μL；引物对正反序列各(10μM)0.2μL；双蒸水补足至10μL。

所述PCR扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，进行29次扩增循环，72℃彻底延伸3min。

a.前述一组PCR鉴别引物及以其鉴别炮制辅料鳖血与其他动物血液样品的PCR扩增程序优选如下：

i.退火温度：考察了54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、65℃的退火温度。结果显示，54℃～65℃炮制辅料鳖血的扩增产物均能在286bp扩增出目的条带，而在62℃下其他物种不存在非特异性扩增条带，为保证退火延伸的有效进行，本发明选择退火温度为62℃。图1为退火温度优选的电泳检测图谱。

ii.变性-退火-延伸的循环次数(n)：根据i的特征，考察26、29、32、35次变性-退火-延伸循环次数对PCR扩增的影响。结果显示，各个循环次数条件下，炮制辅料鳖血样品均能扩增，目的条带明亮清晰，尤其是29次循环时的电泳条带亮度均一且无非特异性条带扩增。因此本发明优选变性-退火-延伸的循环次数为29次。图2为变性-退火-延伸循环次数优选电泳检测图谱。

iii.基于以上，一组PCR鉴别引物以及其鉴别炮制辅料鳖血的方法PCR扩增程序最终优选为：

95℃预变性3min，95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，进行29次扩增循环，72℃彻底延伸3min。

b.上述一组PCR鉴别引物以及其鉴别炮制辅料鳖血的方法PCR反应体系优选如下：

根据上述a.项下确定的扩增程序，对10μL PCR反应体系中组分的用量进行以下优选：

i.鉴别引物用量：考察体系中ZHB286.F与ZHB286.R的用量各为0.05μL、0.1μL、0.2μL、0.4μL、0.8μL、1.6μL。结果显示，当ZHB286.F、ZHB286.R用量为0.2μL～1.6μL时，炮制辅料鳖血样品均能有效扩增，条带亮度依次增强，但仅有0.2μL时，其他动物血液样品无非特异性扩增，因此，本发明选择加入ZHB286.F、ZHB286.R的量各为0.2μL。图3为引物用量优选的电泳检测图谱。

ii.模板DNA用量：在上述i.的基础上，对体系200ng、100ng、10ng、1ng的模板DNA用量进行考察。结果显示，体系中模板DNA含量为10～200ng时，炮制辅料鳖血均能有效扩增，100ng时，其他动物血液样品无非特异性扩增，且条带清晰，因此本发明选择其用量为100ng。图4为模板DNA用量优选的电泳图谱。

iii.根据以上考察，各组分含量优选值为：基因组DNA提取物100ng；2×Rapid TaqMaster Mix 5μL；引物对正反序列各(10μM)0.2μL；双蒸水补足至10μL。

根据上述优化的扩增条件，对其确定方法进行重现性考察，具体操作如下：

分别使用赛默飞VeritiPro PCR仪、东胜ETC811梯度PCR仪、Bio-Gener GE9612-T-S PCR仪三台不同厂家型号的PCR仪扩增，考察仪器对PCR反应稳定性的影响。结果显示，不同厂家型号的PCR仪对PCR扩增结果无明显差异。图5为不同型号仪器的适用性考察电泳检测谱图。因此本发明提供的一组PCR鉴别引物和以其鉴别炮制辅料鳖血的方法，可以快速、准确的鉴别炮制辅料鳖血及其它动物血液，操作简便，实用性强，适于大规模推广应用。

实施例3鳖血辅料及不同源种动物全血中特异DNA序列的PCR扩增试验鉴定

(1)材料

a.在中华鳖养殖基地收集中华鳖鳖血样品12批，每份样品约30mL；在江苏新沂、南京收集驴血、牛血、鸡血、羊血、猪血、兔血样品，每份样品约5mL(见表1)。

b.试剂：琼脂糖(Bio Froxx)；Trans DNA Marker II(北京全式金生物)；2×RapidTaq Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；FastPure Blood DNA IsolationMini Kit V2(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；Ultra GelRed(1000×)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；Tris-乙酸电泳缓冲液(50×TAE)(LEAGENE)；引物为上海生工生物科技有限公司合成。

c.仪器：PCR仪(VeritiPro，Thermo Flasher Scientific)；全自动凝胶成像系统(SYSTEM GelDoc XR+，BIO-RAD)；电泳仪(1645050，BIO-RAD)

表1样品来源表

(2)采用诺唯赞公司生产的全血DNA提取试剂盒，按照所述试剂盒上的使用说明进行炮制辅料鳖血、掺伪血液样品、和不同源种动物全血中所含DNA序列的提取纯化，制得经纯化的鳖血基因组DNA提取物和不同源种动物基因组DNA提取物。

(3)将(2)所得各样品基因组DNA提取物在实施例2确定的优化反应体系和扩增程序下进行PCR反应，掺伪血液样品与各动物引物进行扩增。

(3)将由(2)所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物加入含GelRed的2％琼脂糖凝胶中，150V稳定电压电泳30min，紫外凝胶成像系统观察，以Trans DNAMarkerII DNA MASS(5μL)中的DNA片段为分子量标准(其中DNA片段长度为100bp、200bp、400bp、500bp、700bp、900bp、1500bp)来计算PCR扩增产物大小。

(4)炮制辅料鳖血PCR产物序列经由上海生工生物科技有限公司进行测序。

(5)测序结果通过BLAST在线比对，应为中华鳖的对比相似度最高。

实验结果如下所述：

(1)通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，并与DNA Marker比较知，中华鳖鳖血基因组DNA扩增得到长为286bp的目标片段，如图6所示；

(2)炮制辅料鳖血及不同源种动物全血的PCR扩增试验产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，在286bp处产生条带的12份样品均为中华鳖鳖血，未在286bp处产生条带的6份样品为其他动物血液。(A：M：Trans DNA Marker II；N：阴性对照；1～12不同产地炮制辅料鳖血；B:Trans DNA Marker II；1：炮制辅料鳖血；2：驴血；3：牛血；4：鸡血；5：羊血；6：猪血；7：兔血；C：M：Trans DNA Marker II；N：阴性对照，1～7为等比掺伪驴血、牛血、鸡血、羊血、猪血、兔血样品模板DNA与各自引物反应谱带；D：M：Trans DNA Marker II；N：阴性对照，1～7炮制辅料鳖血样品模板DNA分别与中华鳖、驴、牛、鸡、羊、猪、兔引物反应谱带，8～14：空白对照)

由图6B中结果显示可知，中华鳖的血液为阳性，其他动物血为阴性。其中中华鳖特异引物对ZHB286对6种其他动物血液不起反应，显示为阴性，中华鳖特异引物对ZHB286对炮制辅料鳖血显示为阳性，说明该引物对具有特异性。该方法的高特异性和高灵敏度能够精准的鉴定炮制辅料的真实性，以及所用鳖血的品种。

(3)中华鳖鳖血PCR产物测序结果经SeqMan处理后如SEQ ID NO：2所示，经BLAST在线比对与中华鳖序列完全一致。

该炮制辅料基原物种为正品。

实施例4鳖血辅料中所含特异蛋白成分的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试验鉴定

(1)材料

a.在3省市中华鳖养殖基地收集中华鳖鳖血样品12批，每份样品约30mL；在江苏新沂、南京收集驴血、牛血、鸡血、羊血、猪血、兔血样品，每份样品约5mL(见表1)。

b.试剂：MOPS-SDS Running Buffer(南京艾思易生物科技有限公司)；FuturePAGE4-20％15Wells蛋白预制胶(南京艾思易生物科技有限公司)；1.5M Tris-HCL，pH8.8(碧云天生物技术)；三色预染蛋白质分子量标准(8-180kDa)(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)；甲醇(国药集团化学试剂有限公司)；冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)；考马斯亮蓝(源叶生物)。

c.仪器：电泳仪(1645050，BIO-RAD)。

(2)试剂配制：R250染色液：1g R250，450mL甲醇，100mL冰醋酸；脱色液：100mL甲醇，100mL冰醋酸，800mL超纯水。

(3)样品处理：分别取炮制辅料鳖血样品、驴血、猪血、兔血、鸡血、牛血、羊血450μL，加pH8.8的1.5M Tris-HCL缓冲液2mL，超声处理20min，离心20min(4000rpm/min)，取上清液100μL，加水100μL混匀，作为供试品溶液。

(4)取(2)供试品溶液8μL，加溴酚蓝2μL，煮沸10min，离心，待恢复室温，向样品孔中添加等量的待测鳖血辅料供试品10μL，并采用160V电压稳定电压，进行电泳1h。

(5)将(3)电泳后的凝胶采用20～25mL考马斯亮蓝对所述凝胶在45℃水浴条件下，进行染色30～40min，将经染色后的凝胶放入50～60mL考马斯亮蓝脱色液中进行过夜脱色。

(6)图7所述凝胶上出现鳖血的特征谱带，如图7中中华鳖鳖血于180KDa-100 KDa之间有6条特征谱带，100KDa-43 KDa上下有6条特征谱带，37-17有4条特征谱带，与其他动物血液蛋白条带数量及排布有显著性差异。

实验结果如下所述：

不同批次炮制辅料鳖血条带数量及排列一致，能直观与其它动物血液样品进行区分，该方法能从鳖血特异蛋白条带数量和排列上，快速鉴别混伪品。

序列表

<110> 南京中医药大学

<120> 用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对、试剂盒及应用

<130> xb22021103

<141> 2022-02-11

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagggtgacc aaaaaatcag aataaatgtt gatataggat aggatctcct cctccagaag 60

gatcaaaaaa ggtagtattc aggtttcggt ctgtgagtaa tattgtaatg cctgcggcta 120

acactggtag tgaaagtaat aatagtacgg ctgtaataac tactgatcaa acgaataagg 180

gagtttggta ttgtgatatt gttggggatt ttatattaat agctgtagta ataaaattga 240

tagccccaag gattgaagat actccagcta gatgtaagga gaaaatagtt aagtctactg 300

atgcgcccac atgggctagg ttgctagcta atgggggata aacggttcag ccagttcctg 360

ctcctgtttc aatgcctgat gatgctagga gaagtagtaa tgaggggggt agtagtcaaa 420

aacttatatt atttattcgt gggaatgcta tgtctggggc tccaattatt aagggtacaa 480

gtcagttacc gaacccccca attattacag gtatgactat aaagaagatc ataacaaaag 540

catgtgctgt aacaattaca ttataaatct ggtcgtcccc taaaagagtg ccaggttgac 600

ttagttctgc tcggattaat aagctcaagg ctgtaccaac tatacctgct caggcaccga 660

aaattaagta aagggtgcca atatctttat gttttttttg 700

<210> 2

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggtagtgaa agtaatagta gtacggctgt aataactact gatcaaacga ataagggagt 60

ttggtattgt gatattgttg gggattttat attaatagct gtagtaataa aattgatagc 120

cccaaggatt gaagatactc cagctagatg taaggagaaa atagttaagt ctactgatgc 180

gcccacatgg gctaggttgc tag 203

Claims

1.一种用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对，其特征在于，

正向引物核苷酸序列为：CTAGCAACCTAGCCCATGTG；

反向引物核苷酸序列为：GGATCTCCTCCTCCAGAAGG。

2.权利要求1所述特异性引物对在制备用于鉴定炮制辅料鳖血的试剂盒中的应用。

3.一种用于鉴定炮制辅料鳖血的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述特异性引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应的试剂。

5.权利要求1所述特异性引物对在炮制辅料鳖血鉴定中的应用。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：提取待鉴定样品基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用所述特异性引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测，在286 bp处检测出条带的样品鉴定为鳖血，在286 bp处未检测出条带的样品鉴定为其他动物血液。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括，提取待鉴定样品基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用所述特异性引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行基原鉴定。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，PCR扩增的反应体系如下：

基因组DNA提取物100 ng；

2×Rapid Taq Master Mix 5 μL；

正向引物和反向引物各 (10 μM) 0.2 μL；

双蒸水补足至10 μL。

9. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15 sec，62℃退火15 sec，72℃延伸15 sec，进行29次扩增循环，72℃彻底延伸3 min。

10.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，还包括，在利用特异性引物对对待测样品进行基因水平的鉴定后，基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法对待测样品进行蛋白水平的鉴定。