CN114668799A - 一种通便类中药的制备工艺及成分鉴定和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通便类中药的制备工艺及成分鉴定和检测方法。本发明的通便类中药的制备工艺，通过恒温浸泡提取或后下回流提取将通便类中药处方进行提取得到提取液，再将提取液进行减压浓缩和冷冻干燥，即制备得到通便类中药，该制备方法工艺简单，为通便类中药颗粒剂的生产制备提供理论依据；本发明的通便类中药的成分鉴定和检测方法，利用薄层色谱法和高效液相色谱法，对通便类中药中制何首乌、陈皮、番泻叶进行了定性鉴别研究，对方中主要活性成分番泻苷A、番泻苷B、二苯乙烯苷、橙皮苷进行了定量分析研究，可以较为全面反映中药复方所包含化学成分的信息，以保证产品的质量和疗效，为通便类中药质量控制提供了良好的解决方案。

Description

一种通便类中药的制备工艺及成分鉴定和检测方法
技术领域
本发明涉及配方成分制备技术及检测技术领域，尤其涉及一种通便类中药的制备工艺及成分鉴定和检测方法。
背景技术
通便类中药茶是武汉同济现代医药有限公司研制的三类新药，由黑芝麻、桑椹、制何首乌、陈皮、番泻叶五味药物组成。具有养血填精、润肠通便的功能，适用于治疗年老体弱、病后、产后、术后、小儿津亏血少等便秘症。其疗效和技术在国内同类产品中处于领先水平。然而通便类中药茶制备工艺及评价方法的研究不甚全面。目前关于通便类中药的研究较少，制备工艺及评价方法的研究不甚全面。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种通便类中药的制备工艺及成分鉴定和检测方法，以解决或部分解决现有技术中存在的问题。
第一方面，本发明提供了一种通便类中药的制备工艺，包括以下步骤：
将通便类中药处方加入至水中，于90～95℃下加热8～12min，过滤后得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入水中，于90～95℃下加热25～35min，过滤后得到第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣加入水中，于90～95℃下加热5～6h，过滤后得到第三滤液和第三滤渣；将第一滤液、第二滤液和第三滤液合并得到提取液；
或，将不含有番泻叶的通便类中药处方加入至水中浸泡后，加热至沸腾并保持1.5～2.5h，停止加热后然后加入番泻叶并保持12～18min，过滤后得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣加入至水中，加热至沸腾并保持0.5～1h，过滤，得到第五滤液和第五滤渣；将第四滤液和第五滤液合并得到提取液；
将提取液减压浓缩，得到浓缩液，其中浓缩温度为60～70℃，浓缩后浓缩液密度为1.0～1.1g/mL；
将浓缩液置于冷冻干燥机中，于温度为-80～-90℃、压力为3.5～20Pa下冷冻干燥24～30h，即得通便类中药。
优选的是，所述的通便类中药的制备工艺，将通便类中药处方加入至水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的18～22倍；将第一滤渣加入水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的8～12倍；将第二滤渣加入水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的8～12倍。
优选的是，所述的通便类中药的制备工艺，将不含有番泻叶的通便类中药处方加入至水中的步骤中，水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方质量以及后续加入的番泻叶质量之和的18～22倍；将第四滤渣加入至水中的步骤中，水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方质量和加入的番泻叶质量之和的8～12倍。
优选的是，所述的通便类中药的制备工艺，所述通便类中药处方包括以下重量份原料：2～4份的黑芝麻、3～5份的桑椹、3～5份的制何首乌、1～3份的陈皮、13～17份的番泻叶；
所述不含有番泻叶的通便类中药处方包括以下重量份原料：2～4份的黑芝麻、3～5份的桑椹、3～5份的制何首乌、1～3份的陈皮；其中，加入番泻叶并保持12～18min的步骤中加入的加入番泻叶重量份为13～17份。
优选的是，所述的通便类中药的制备工艺，将浓缩液置于冷冻干燥机中冷冻干燥之前，还包括将浓缩液置于温度为-80～-90℃的环境下预冻。
第二方面，本发明还提供了一种所述的制备工艺制备得到的通便类中药的成分鉴定方法，其特征在于，包括：
陈皮的鉴定：将通便类中药加入至甲醇中，超声，过滤后浓缩得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯、甲醇和水的混合物为展开剂，展至2～4cm，再以甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的混合物为展开剂，展至6～10cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视；
制何首乌的鉴定：将通便类中药加入至乙醇中，加热回流，过滤后将滤液浓缩，再加入乙醇复溶，得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至2～4cm，再以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至6～10cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视；
番泻叶的鉴定：将通便类中药加入至甲醇中，超声后，离心，收集上清液蒸干后得到残渣，再向残渣中加入水溶解后再加入石油醚，振荡，弃去石油醚，将余下的水溶液蒸干并加入乙醇，得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯、异丙醇和水的混合物为展开剂，展至13～17cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视。
优选的是，所述的通便类中药的成分鉴定方法，陈皮的鉴定过程中，乙酸乙酯、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为100:(15～19):(10～15)，甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的混合物中甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的体积比为20:(8～12):(0.5～2):(0.5～2)；
制何首乌的鉴定过程中，以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至2～4cm，其中，三氯甲烷和甲醇的体积比为7:(1～5)；再以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至6～10cm，其中，三氯甲烷和甲醇的体积比为20:(0.5～2)；
番泻叶的鉴定过程中，乙酸乙酯、异丙醇和水的混合物中乙酸乙酯、异丙醇和水的体积比为(4～5):(4～5):(2～3)。
优选的是，所述的通便类中药的成分鉴定方法，在陈皮的鉴定过程中，同时配制橙皮苷对照溶液以及不含陈皮的阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同时，将橙皮苷对照溶液以及不含陈皮的阴性对照液点在硅胶G薄层板上；
在制何首乌的鉴定过程中，同时配制二苯乙烯苷对照溶液、何首乌对照药材溶液以及不含制何首乌阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同上，将二苯乙烯苷对照溶液、何首乌对照药材溶液以及不含制何首乌阴性对照液点在硅胶G薄层板上；
在番泻叶的鉴定过程中，同时配制番泻叶对照药材溶液、不含番泻叶阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同上，将番泻叶对照药材溶液、不含番泻叶阴性对照液点在硅胶G薄层板上。
第三方面，本发明还提供了一种所述的制备工艺制备得到的通便类中药的成分检测方法，包括：
将通便类中药加入至醇溶剂中，超声后得到待测溶液；
利用高效液相色谱法对待测溶液成分进行检测；
所述高效液相色谱法检测过程中的流动相为流动相A和流动相B，所述流动相A为三氟乙酸水溶液，所述流动相B为乙腈；
所述高效液相色谱法检测过程中采用梯度洗脱的方式使流动相通过色谱柱，所述梯度洗脱的方法为：
在0～15min，所述流动相A在流动相中的体积含量为90～85％，所述流动相B在流动相中的体积含量为10～15％；
在15～20min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为85％，所述流动相B在流动相中的体积含量为15％；
在20～28min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为85～83.5％，所述流动相B在流动相中的体积含量为15～16.5％；
在28～30min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为83.5～81.5％，所述流动相B在流动相中的体积含量为16.5～18.5％；
在30～35min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为81.5～75％，所述流动相B在流动相中的体积含量为18.5～25％；
在35～48min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为75～42％，所述流动相B在流动相中的体积含量为25～58％；
在48～50min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为42～90％，所述流动相B在流动相中的体积含量为58～10％；
在50～60min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为90％，所述流动相B在流动相中的体积含量为10％。
优选的是，所述的的通便类中药的成分检测方法，所述醇溶剂为体积分数为30～80％的甲醇溶剂，所述通便类中药与醇溶剂的质量体积比为(0.1～1.5)g:(8～12)ml；
所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；
流动相流速为0.8～1.2mL/min，柱温为30～32℃，三氟乙酸水溶液中三氟乙酸体积浓度为0.05～0.1％，检测波长为282～286nm、318～322nm、335～345nm。
本发明的一种通便类中药的制备工艺及成分鉴定和检测方法，相对于现有技术具有以下有益效果：
1、本发明的通便类中药的制备工艺，通过恒温浸泡提取或后下回流提取将通便类中药处方进行提取得到提取液，再将提取液进行减压浓缩和冷冻干燥，即制备得到通便类中药，该制备方法工艺简单，为通便类中药颗粒剂的生产制备提供理论依据；
2、本发明的通便类中药的成分鉴定和检测方法，利用薄层色谱法和高效液相色谱法，对通便类中药中制何首乌、陈皮、番泻叶进行了定性鉴别研究，对方中主要活性成分番泻苷A、番泻苷B、二苯乙烯苷、橙皮苷进行了定量分析研究，可以较为全面反映中药复方所包含化学成分的信息，以保证产品的质量和疗效，为通便类中药质量控制提供了良好的解决方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中恒温浸泡提取得到的提取液的液相色谱图；
图2为本发明实施例1中后下回流提取得到的提取液的液相色谱图；
图3～5为本发明实施例5中陈皮在不同温度下展开示意图；
图6～7为本发明实施例5中陈皮在不同极性展开剂中展开示意图；
图8～10为本发明实施例5中番泻叶在不同温度下展开示意图；
图11～12为本发明实施例5中番泻叶在不同极性展开剂中展开示意图；
图13～15为本发明实施例5中制何首乌在不同温度下展开示意图；
图16～17为本发明实施例5中制何首乌在不同极性展开剂中展开示意图；
图18为本发明实施例6中不同浓度通便类中药对各指标的影响；
图19～25为本发明实施例6中不同溶媒对通便类中药成分检测的影响；
图26～28为本发明实施例7中对照溶液、阴性处方和通便类中药的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和出示的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例提供了一种通便类中药的制备工艺，包括以下步骤：
S1、将通便类中药处方加入至水中，于90～95℃下加热8～12min，过滤后得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入水中，于90～95℃下加热25～35min，过滤后得到第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣加入水中，于90～95℃下加热5～6h，过滤后得到第三滤液和第三滤渣；将第一滤液、第二滤液和第三滤液合并得到提取液；
或，将不含有番泻叶的通便类中药处方加入至水中浸泡后，加热至沸腾并保持1.5～2.5h，停止加热后然后加入番泻叶并保持12～18min，过滤后得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣加入至水中，加热至沸腾并保持0.5～1h，过滤，得到第五滤液和第五滤渣；将第四滤液和第五滤液合并得到提取液；
S2、将提取液减压浓缩，得到浓缩液，其中浓缩温度为60～70℃，浓缩后浓缩液密度为1.0～1.1g/mL；
S3、将浓缩液置于冷冻干燥机中，于温度为-80～-90℃、压力为3.5～20Pa下冷冻干燥24～30h，即得通便类中药。
本申请的通便类中药的制备工艺，通过对通便类中药处方进行提取得到提取液，然后于将提取液进行浓缩后冷冻即制备得到通便类中药；其中，提取方式为：恒温浸泡提取和后下回流提取。
具体的，在一些实施例中，将通便类中药处方加入至水中，于90～95℃下加热10min，过滤后得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入水中，于90～95℃下加热30min，过滤后得到第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣加入水中，于90～95℃下加热5.5h，过滤后得到第三滤液和第三滤渣；将第一滤液、第二滤液和第三滤液合并得到提取液。
在一些实施例中，将不含有番泻叶的通便类中药处方加入至水中浸泡30min后，加热至沸腾并保持2h，停止加热后然后加入番泻叶并利用余热浸泡12～18min，优选为15min，过滤后得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣加入至水中，加热至沸腾并保持1h，过滤，得到第五滤液和第五滤渣；将第四滤液和第五滤液合并得到提取液。
在一些实施例中，将通便类中药处方加入至水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的18～22倍，优选为20倍；将第一滤渣加入水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的8～12倍，优选为10倍；将第二滤渣加入水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的8～12倍，优选为10倍。
在一些实施例中，将不含有番泻叶的通便类中药处方加入至水中的步骤中，水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方质量以及后续加入的番泻叶质量之和的18～22倍，优选为20倍；将第四滤渣加入至水中的步骤中，水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方质量和加入的番泻叶质量之和的8～12倍，优选为10倍。
在一些实施例中，通便类中药处方包括以下重量份原料：2～4份的黑芝麻、3～5份的桑椹、3～5份的制何首乌、1～3份的陈皮、13～17份的番泻叶；
不含有番泻叶的通便类中药处方包括以下重量份原料：2～4份的黑芝麻、3～5份的桑椹、3～5份的制何首乌、1～3份的陈皮；其中，加入番泻叶并保持12～18min的步骤中加入的加入番泻叶重量份为13～17份。
例如，通便类中药处方包括以下重量份原料：黑芝麻3.6份，桑椹3.9份，制何首乌3.6份，陈皮1.8份，番泻叶14.9份；不含有番泻叶的通便类中药处方包括黑芝麻3.6份，桑椹3.9份，制何首乌3.6份，陈皮1.8份。
在一些实施例中，将浓缩液置于冷冻干燥机中冷冻干燥之前，还包括将浓缩液置于温度为-80～-90℃的环境下预冻8～12h。
基于同一发明构思，本申请实施例还提供了一种上述制备得到的通便类中药的成分鉴定方法，其特征在于，包括：
陈皮的鉴定：将通便类中药加入至甲醇中，超声，过滤后浓缩得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯、甲醇和水的混合物为展开剂，展至2～4cm，再以甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的混合物为展开剂，展至6～10cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视；
制何首乌的鉴定：将通便类中药加入至乙醇中，加热回流，过滤后将滤液浓缩，再加入乙醇复溶，得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至2～4cm，再以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至6～10cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视；
番泻叶的鉴定：将通便类中药加入至甲醇中，超声后，离心，收集上清液蒸干后得到残渣，再向残渣中加入水溶解后再加入石油醚，振荡，弃去石油醚，将余下的水溶液蒸干并加入乙醇，得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯、异丙醇和水的混合物为展开剂，展至13～17cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视。
具体的，本申请制备得到的通便类中药主要活性成分番泻苷A、番泻苷B、二苯乙烯苷、橙皮苷；利用TLC鉴别陈皮、制何首乌和番泻叶。
在一些实施例中，陈皮的鉴定过程中，乙酸乙酯、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为100:(15～19):(10～15)，甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的混合物中甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的体积比为20:(8～12):(0.5～2):(0.5～2)；
制何首乌的鉴定过程中，以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至2～4cm，其中，三氯甲烷和甲醇的体积比为7:(1～5)；再以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至6～10cm，其中，三氯甲烷和甲醇的体积比为20:(0.5～2)；
番泻叶的鉴定过程中，乙酸乙酯、异丙醇和水的混合物中乙酸乙酯、异丙醇和水的体积比为(4～5):(4～5):(2～3)。
在一些实施例中，在陈皮的鉴定过程中，同时配制橙皮苷对照溶液以及不含陈皮的阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同时，将橙皮苷对照溶液以及不含陈皮的阴性对照液点在硅胶G薄层板上；其中，橙皮苷对照溶液的配制方法为：将橙皮苷加入至甲醇中制成饱和溶液即为橙皮苷对照溶液；不含陈皮的阴性对照液的制备方法为：将不含有陈皮的通便类中药处方(即仅含有黑芝麻、桑椹、制何首乌和番泻叶的通便类中药处方)，加入至甲醇中，超声后过滤即得不含陈皮的阴性对照液。在紫外光灯(365nm)下检视，待测溶液色谱中，在与对橙皮苷对照溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而不含陈皮的阴性对照液色谱中不显相同颜色的荧光斑点。
在一些实施例中，在制何首乌的鉴定过程中，同时配制二苯乙烯苷对照溶液、何首乌对照药材溶液以及不含制何首乌阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同上，将二苯乙烯苷对照溶液、何首乌对照药材溶液以及不含制何首乌阴性对照液点在硅胶G薄层板上；二苯乙烯苷对照溶液的制备方法为：将二苯乙烯苷加入至甲醇中制成1mg/mL的对照溶液；何首乌对照药材溶液的制备方法为：将何首乌加入至乙醇中，加热回流，过滤后将滤液浓缩，再加入乙醇复溶，得到何首乌对照药材溶液；不含制何首乌阴性对照液的制备方法为：将不含制何首乌的通便类中药处方(即仅含有黑芝麻、桑椹、陈皮和番泻叶的通便类中药处方)，加入至乙醇中，加热回流，过滤后将滤液浓缩，再加入乙醇复溶，得到不含制何首乌阴性对照液；在紫外光灯(365nm)下检视，待测溶液色谱中，在与二苯乙烯苷对照溶液、何首乌对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而不含制何首乌阴性对照液色谱中不显相同颜色的荧光斑点。
在一些实施例中，同时配制番泻叶对照药材溶液、不含番泻叶阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同上，将番泻叶对照药材溶液、不含番泻叶阴性对照液点在硅胶G薄层板上；番泻叶对照药材溶液的配制方法为：将番泻叶加入至体积分数为50％甲醇溶液中，超声30min(400W，40KHz)，然后离心15min(2000rpm)，取上清液，蒸干，残渣加10mL水使溶解，用石油醚(60～90℃)振摇提取3次，每次15mL，弃去石油醚液，取水液蒸干，残渣加稀乙醇5mL使溶解，即得番泻叶对照药材溶液；而不含番泻叶阴性对照液的制备方法为：按照上述相同的方法将不含番泻叶的通便类中药处方(即仅含有黑芝麻、桑椹、陈皮和制何首乌的通便类中药处方)，加入至甲醇溶液中，超声，离心，蒸干后，残渣加水使溶解，用石油醚振摇提取3次，弃去石油醚液，取水液蒸干，残渣加稀乙醇使溶解，即得不含番泻叶阴性对照液。在紫外光灯(365nm)下检视，待测溶液色谱中，在与番泻叶对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而不含番泻叶阴性对照液色谱中不显相同颜色的荧光斑点。
基于同一发明构思，本申请实施例还提供了上述制备得到的通便类中药的成分检测方法，包括：
将通便类中药加入至醇溶剂中，超声后得到待测溶液；
利用高效液相色谱法对待测溶液成分进行检测；
高效液相色谱法检测过程中的流动相为流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈；
高效液相色谱法检测过程中采用梯度洗脱的方式使流动相通过色谱柱，所述梯度洗脱的方法为：
在0～15min，流动相A在流动相中的体积含量为90～85％，流动相B在流动相中的体积含量为10～15％；
在15～20min，流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为85％，流动相B在流动相中的体积含量为15％；
在20～28min，流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为85～83.5％，流动相B在流动相中的体积含量为15～16.5％；
在28～30min，流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为83.5～81.5％，流动相B在流动相中的体积含量为16.5～18.5％；
在30～35min，流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为81.5～75％，所述流动相B在流动相中的体积含量为18.5～25％；
在35～48min，流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为75～42％，流动相B在流动相中的体积含量为25～58％；
在48～50min，流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为42～90％，所述流动相B在流动相中的体积含量为58～10％；
在50～60min，流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为90％，流动相B在流动相中的体积含量为10％。
本申请利用高效液相色谱法对通便类中药中二苯乙烯苷、番泻苷B、番泻苷A、橙皮苷的含量进行测定。
在一些实施例中，醇溶剂为体积分数为30～80％的甲醇溶剂，优选为体积分数为50％的甲醇溶剂，通便类中药与醇溶剂的质量体积比为(0.1～1.5)g:(8～12)ml；
高效液相色谱检测过程中的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，3.5-Micron，即色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm)；流动相流速为0.8～1.2mL/min，优选为1mL/min；柱温为30～32℃，优选为30℃；三氟乙酸水溶液中三氟乙酸体积浓度为0.05～0.1％，其对应的pH分别为2.36和2.13；检测波长为282～286nm、318～322nm、335～345nm，具体的，检测波长为284nm、320nm、340nm。
在一些实施例中，流动相A为三氟乙酸水溶液，且三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积浓度为0.03～0.07％，优选为0.05％。
在一些实施例中，在利用高效液相色谱法对待测溶液成分进行检测时，还配制番泻苷A对照品溶液、番泻苷B对照品溶液、二苯乙烯苷对照品溶液、橙皮苷对照品溶液；通过待测溶液以及番泻苷A对照品溶液、番泻苷B对照品溶液、二苯乙烯苷对照品溶液、橙皮苷对照品溶液的色谱图，进而确定通便类中药中各组分含量。
以下进一步以具体实施例说明通便类中药的制备工艺及成分鉴定和检测方法。
以下实施例中，采用的仪器设备为Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；XP205型十万分之一电子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；FA124型万分之一天平，天津亿诺科学仪器有限公司；PX223ZH型千分之一电子天平，奥豪斯仪器(常州)有限公司；KQ-400B型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；DZKW-S-6电热恒温水浴锅，北京市光明医疗仪器有限公司；BGZ-140电热鼓风干燥箱，上海迅博实业有限公司医疗设备；N-12108旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；FDU-2100冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；Milli-Q academic超纯水系统，美国Miliipore公司。本实施例子选用材料为对照品二苯乙烯苷(批号：RFS-E02201908015)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；橙皮苷(批号：110721-202019)、番泻苷A(批号：110824-202003)、番泻苷B(批号：110825-202004)均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、三氟乙酸，均为色谱纯，美国Fisher公司；水为超纯水。黑芝麻、桑椹、制何首乌、陈皮、番泻叶均购于其道地产地或主产区，经对药材进行鉴定，均符合《中国药典》2020版项下规定：黑芝麻为脂麻科植物脂麻Sesamum indicum L.的干燥成熟种子；桑椹为桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗；制何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultifLorum Thunb.的干燥块根的炮制加工品；陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮；番泻叶为豆科植物狭叶番泻Cassia angustifoliaVahl或尖叶番泻Cassia acutifolia Delile的干燥小叶。
实施例1
本实施例提供了通便类中药的制备过程中提取工艺的研究，包括恒温浸泡提取和后下回流提取；
其中，恒温浸泡提取具体为：
S1、将通便类中药处方(黑芝麻3.6g、桑椹3.9g、制何首乌3.6g、陈皮1.8g、番泻叶14.9g)加入至水中，于90～95℃下加热10min，过滤后得到第一滤液和第一滤渣；水的质量为通便类中药处方质量的20倍；
S2、将第一滤渣加入水中，于90～95℃下加热30min，过滤后得到第二滤液和第二滤渣；水的质量为通便类中药处方质量的10倍；
S3、将第二滤渣加入水中，于90～95℃下加热5.5h，过滤后得到第三滤液和第三滤渣；将第一滤液、第二滤液和第三滤液合并得到提取液；水的质量为通便类中药处方质量的10倍。
后下回流提取具体为：
S1、将不含有番泻叶的通便类中药处方(黑芝麻3.6g、桑椹3.9g、制何首乌3.6g、陈皮1.8g)加入至水中浸泡30min，加热至沸腾并保持2h，停止加热后然后加入番泻叶(番泻叶14.9g)利用余热浸泡15min，过滤后得到第四滤液和第四滤渣；水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方质量以及加入的番泻叶质量之和的20倍；
S2、将第四滤渣加入至水中，加热至沸腾并保持1h，过滤，得到第五滤液和第五滤渣；将第四滤液和第五滤液合并得到提取液；水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方质量以及加入的番泻叶质量之和的10倍。
实施例1中恒温浸泡提取和后下回流提取的转移率和出膏率结果如下表1所示。
表1-恒温浸泡提取和后下回流提取的转移率和出膏率结果
Figure BDA0003616713980000111
一致性评价公式：
Figure BDA0003616713980000112
Figure BDA0003616713980000113
Figure BDA0003616713980000114
出膏率的测定：将提取液放冷后搅拌均匀，用移液管精密移取10mL提取液于已恒重的蒸发皿中，100℃水浴蒸干后，放入鼓风干燥箱105℃干燥6h，取出置于干燥器中冷却后称定重量，按下述公式计算出膏率。
Figure BDA0003616713980000115
其中，干膏粉指通便类中药处方饮片经提取浓缩干燥后得到的中间体；饮片重是指一个通便类中药处方中该种药材的称量重量；企业检测含量是指企业给出的饮片含量检测报告里的饮片中指标成分的含量百分比×称量的该饮片重量；干膏粉的检测指标包括出膏率，以及二苯乙烯苷、橙皮苷、番泻苷A、B的含量；出膏率max指提取工艺条件下出膏率的最大值，橙皮苷转移率max表示转移率的最大值，转移率的最大值指提取工艺条件下转移率的最大值；汤剂冷体积是指提取液放置至室温后的体积；饮片总重量指的是一个通便类中药处方的饮片总重，即一组提取称量的饮片总重。
从表1中可以看出，恒温浸泡提取和后下回流提取两种工艺的一致性评价得分较高，番泻苷的转移率较高，工艺较为稳定。
进一步的，分别按照上述实施例1中恒温浸泡提取和后下回流提取两种工艺得到的提取液，进行液相色谱分析，液相色谱分析的工艺条件与实施例6中的工艺条件相同，结果如图1～2所示。
实施例2
本实施例提供了通便类中药的制备过程中浓缩工艺的研究，由于指标性成分番泻苷受热易分解，选择浓缩温度50℃，60℃，70℃进行考察，同一条件冷冻干燥后进行含量测定；
具体的，将提取液精密移取50mL于250mL圆底烧瓶中，减压浓缩至10mL左右，浓缩温度分别为50℃、60℃、70℃，测量浓缩液的成分含量。或将浓缩液在不同温度下浓缩后进行冷冻干燥，冷冻干燥条件为：温度为-80～-90℃、压力为3.5～20Pa下冷冻干燥24～30h，将冷冻干燥后的产物进行成分含量测量。其中测量方法具体为：浓缩液或冷冻干燥后的产物置于棕色西林瓶中，在精密移取5mL于50mL三角瓶中，先后加入10mL纯水与15mL甲醇，摇匀超声30min(400W，40KHz)，静置吸取上清液用0.22μm有机滤膜过滤，然后利用HPLC进行测量(具体工艺同实施例6)。结果如下表2所示。
其中，提取液的提取方法为：
S1、称取便乃通处方剂量饮片(黑芝麻2.6g、桑椹2.8g、制何首乌2.6g、陈皮1.3g、番泻叶10.7g)并加入至水中然后置于电加热器中，浸泡30min，于220V电压下加热至沸腾然后保持微沸(控制电压为175V)，回流10min停止加热，过滤后得到第一滤液和第一滤渣；水的质量为便乃通处方剂量饮片质量的10倍；
S2、将第一滤渣加入水中然后置于电加热器中，浸泡30min，于220V电压下加热至沸腾然后保持微沸(控制电压为175V)，回流30min停止加热，过滤后得到第二滤液和第二滤渣；水的质量为通便类中药处方质量的10倍；
S3、将第二滤渣加入水中然后置于电加热器中，浸泡30min，于220V电压下加热至沸腾然后保持微沸(控制电压为175V)，回流3.5h停止加热，过滤后得到第三滤液和第三滤渣；水的质量为通便类中药处方质量的8倍；
S4、合并第一滤液、第二滤液和第三滤液即得提取液。
表2-浓缩干燥前后每克干浸膏粉中各指标成分含量结果(单位mg)
Figure BDA0003616713980000121
Figure BDA0003616713980000131
从表2中可以看出，浓缩前二苯乙烯苷含量较低，分析可能是由于溶媒极性的差异造成(浓缩前溶媒(即甲醇)极性为33％，浓缩后溶媒极性为50％)，提取液进样未出现二苯乙烯苷峰。同时由于溶媒极性原因导致各成分浓缩前后含量变化趋势不太准确。根据实验结果选择60℃～70℃作为减压浓缩温度。由于浓缩前后平行样品中各指标性成分变化趋势相同，说明浓缩、冻干对各指标成分的影响较为一致，工艺较稳定。
实施例3
本实施例提供了通便类中药的制备过程中干燥工艺的研究，将实施例2中的提取液经过减压浓缩，得到浓缩液，其中浓缩温度为60℃，浓缩后浓缩液密度为1.0～1.1g/mL；将浓缩液分别进行冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥三种方式进行考察，冷冻干燥参数：温度为-84℃、压力为8.5Pa下冷冻干燥30h。喷雾干燥参数：进口温度120℃，出口温度75℃，蠕动泵泵速13％，流速40L/h。真空干燥参数：干燥温度50℃。结果见表3。
表3-不同干燥方式下每克干浸膏粉中各指标成分含量结果(单位mg/g)
样品名称 二苯乙烯苷 番泻苷B 番泻苷A 橙皮苷
喷雾干燥 2.12 7.43 4.99 3.84
冷冻干燥 2.21 7.52 5.13 3.90
真空干燥 1.73 5.95 4.37 3.54
综合考虑三种干燥方式的特点，本申请选择冷冻干燥作为干燥方式。
实施例4
本实施例提供了通便类中药的制备工艺，包括以下步骤：
S1、将不含有番泻叶的通便类中药处方(包括黑芝麻3.6份、桑椹3.9份、制何首乌3.6份、陈皮1.8份)加入至水中浸泡30min，加热至沸腾并保持2h，停止加热后然后加入番泻叶(重量份为14.9份)利用余热浸泡15min，过滤后得到第四滤液和第四滤渣；水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方的质量和加入番泻叶质量之和的20倍；
S2、将第四滤渣加入至水中，加热至沸腾并保持1h，过滤，得到第五滤液和第五滤渣；将第四滤液和第五滤液合并得到提取液；水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方的质量和加入番泻叶质量之和的10倍；
S3、用旋转蒸发仪于60℃减压浓缩至50mL(此时密度即为1.0～1.1g/ml)，放入100mL培养皿中，置-80℃冰箱中预冻10h，然后再于冷冻干燥机中，于温度为-85℃、压力为10Pa下冷冻干燥27h，研细，即得通便类中药(亦称干浸膏粉)。
实施例5
本实施例提供了通便类中药的成分鉴定方法，具体将实施例4中制备得到的通便类中药进行成分鉴定，包括：
陈皮的鉴定：将0.3g通便类中药加入至10mL甲醇剂中，超声20min，过滤，取滤液5mL，浓缩至1mL得到待测溶液；同时配制橙皮苷对照溶液以及不含陈皮的阴性对照液；利用薄层色谱法，取上述三种溶液各2μL，分别点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为100:17:13)为展开剂，展至约3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(体积比为20:10:1:1)为展开剂，展至约8cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视；
制何首乌的鉴定：将0.25g通便类中药加入至50mL的乙醇中，加热回流1h，过滤后将滤液浓缩，再加入3ml的乙醇复溶，得到待测溶液；同时配制二苯乙烯苷对照溶液、何首乌对照药材溶液以及不含制何首乌阴性对照液；利用薄层色谱法，吸取上述四种溶液各2μL，分别点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇的混合物(体积比为7:3)为展开剂，展至3.5cm，晾干，再以三氯甲烷-甲醇的混合物(体积比为20:1)为展开剂，展至7cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视；
番泻叶的鉴定：将0.5g通便类中药加入至体积分数为50％的甲醇中，超声30min后，离心，收集上清液蒸干后得到残渣，再向残渣中加入10mL水溶解后再加入石油醚于60～90振荡提取3次，每次加入15mL石油醚，弃去石油醚，将余下的水溶液蒸干得到残渣，并加入5mL乙醇使其溶解，得到待测溶液；同时配制番泻叶对照药材溶液、不含番泻叶阴性对照液；利用薄层色谱法，吸取上述三种溶液各3μL，分别点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-异丙醇-水(体积比为4.2:4.2:2.6)为展开剂，展开15cm，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯、异丙醇和水的混合物为展开剂，展至13～17cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视。
分别按照上述方法，考察展开温度以及展开剂极性进行考察，结果如3～7所示。
具体的，图3～5分别表示陈皮在常温、5℃以及45℃下薄层鉴别展开的示意图。图6～7分别表示陈皮在不同极性展开剂(极性减小：展开剂中甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的体积比为20.5:10:0.5:1，极性增大：展开剂中甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的体积比为19.5:10:1.5:1)下薄层鉴别展开的示意图。图3～7中橙皮苷指的是橙皮苷对照溶液的薄层鉴别展开的示意图，全方指的是待测溶液薄层鉴别展开的示意图，阴性指的是不含陈皮的阴性对照液薄层鉴别展开的示意图。薄层色谱法中RF值指薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。
从图3～5中可以看出，常温、5℃、45℃均可实现展开，考虑操作方便建议陈皮的最佳展开温度为常温。
从图6～7中可以看出，极性微调对展开效果无明显影响，建议正常或极性减小条件下进行展开。
具体的，图8～10分别表示番泻叶在常温、5℃以及45℃下薄层鉴别展开的示意图。图11～12分别表示番泻叶在不同极性展开剂(极性减小：展开剂中乙酸乙酯、异丙醇、水的体积比为4.4:4.4:2.2，极性增大：展开剂中乙酸乙酯、异丙醇、水的体积比为4:4:3)下薄层鉴别展开的示意图。图8～12中番泻叶指的是番泻叶对照药材溶液的薄层鉴别展开的示意图，全方指的是待测溶液薄层鉴别展开的示意图，阴性指的是不含番泻叶阴性对照液薄层鉴别展开的示意图。薄层色谱法中RF值指薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。
从图8～10中可以看出，常温、5℃、45℃均可实现展开，但45℃展开展开剂挥发较快在展开缸上部凝结成水滴滴下，同时考虑操作方便番泻叶的最佳展开温度为常温。
从图11～12中可以看出，极性增大会影响展开效果，RF值偏大，故建议极性正常或减小条件下展开。
具体的，图13～15分别表示制何首乌在常温、5℃以及45℃下薄层鉴别展开的示意图。图16～17分别表示制何首乌在不同极性展开剂(极性减小：展开剂中三氯甲烷、甲醇的体积比为20.2:0.8，极性增大：展开剂中三氯甲烷、甲醇的体积比为18.8:1.2)下薄层鉴别展开的示意图。图13～17中二苯乙烯苷指的是二苯乙烯苷对照溶液的薄层鉴别展开的示意图，对照药材指的是何首乌对照药材溶液薄层鉴别展开的示意图，全方指的是待测溶液的薄层鉴别展开的示意图，阴性指的是不含制何首乌阴性对照液薄层鉴别展开的示意图。薄层色谱法中RF值指薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。
从图13～15中可以看出，常温、5℃、45℃均可实现展开，考虑操作方便制何首乌的最佳展开温度为常温。
从图16～17中可以看出，极性增大RF值偏小，故建议及性正常或减小条件下展开。
实施例6
本申请实施例提供了通便类中药的成分检测方法，具体将实施例4中制备得到的通便类中药进行成分检测，包括：
将通便类中药加入至溶剂中，超声后得到待测溶液；
利用高效液相色谱法对待测溶液成分进行检测；
高效液相色谱法检测过程中的流动相为流动相A和流动相B，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈；三氟乙酸水溶液中三氟乙酸体积浓度为0.05％；高效液相色谱检测过程中的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，3.5-Micron)；流动相流速为为1mL/min；柱温为30℃；进样量为5μL，检测波长为284nm、320nm、340nm；使用的高效液相色谱仪选用编号A(HPLC 1260配四元泵DEAE 207941，DAD检测器DEAC 611591，厂家：美国安捷伦公司)
高效液相色谱法检测过程中采用梯度洗脱的方式使流动相通过色谱柱，所述梯度洗脱的方法如表4所示：
表4-梯度洗脱表
时间(min) 流动相A(0.05％三氟乙酸)体积含量(％) 流动相B(乙腈)体积含量(％)
0 90 10
15 85 15
20 85 15
28 83.5 16.5
30 81.5 18.5
35 75 25
48 42 58
50 90 10
60 90 10
考察不同质量的通便类中药的影响：
分别取通便类中药0.1g、0.15g、0.3g、0.6g、0.8g、1.0g、1.5g于50mL三角瓶中，精密加入体积分数50％甲醇10mL，摇匀，超声处理(400W，40KHz)30min，取出静置至室温，吸取上清液过0.22μm滤膜，按照上述条件进样分析。结果见图18。从图18中可以看出，随着样品取样量增加，各指标性成分含量并未增加。相反，样品浓度越大，指标性成分的含量反而降低。表明浓度过高，指标性成分的溶解呈现高浓度抑制现象。为确保检测结果的准确性以及各指标性成分的分离度合格，选择适当的样品浓度作为检测浓度，即选择通便类中药取样量为0.15g，溶解于10mL溶媒。
不同溶媒考察：
称取通便类中药0.15g于50mL三角瓶中，分别加入10mL纯水、10mL体积分数为30％甲醇、10mL体积分数为50％甲醇、10mL体积分数为80％甲醇、10mL体积分数为100％甲醇(即纯甲醇)、10mL体积分数为100％乙醇(即纯乙醇)、10mL体积分数为100％乙腈(即纯乙腈)摇匀，超声处理(400W，40KHz)30min，取出静置至室温，吸取上清液过0.22μm滤膜，按照上述条件进样分析，结果如图19～25所示。
从图19～25可以看出，溶媒为纯水、100％乙醇、100％乙腈时部分指标成分未被检测；50％甲醇溶解通便类中药时，色谱峰较多，指标成分峰分离度较好，基线平稳。
实施例7
本申请实施例提供了通便类中药的成分检测方法，具体将实施例4中制备得到的通便类中药进行成分检测，包括：
将0.15g通便类中药粉末于三角瓶中，精密加入10mL体积分数为50％甲醇，称定质量，摇匀超声提取30min(400W，40KHz)，摇匀，静置至室温，吸取上清液用0.22μm有机滤膜过滤，即得通便类中药待测溶液；
同法制备制何首乌单味药、陈皮单味药、番泻叶单味药、制何首乌阴性处方、陈皮阴性处方、番泻叶阴性处方待测溶液。其中，制何首乌单味药、陈皮单味药、番泻叶单味药待测溶液的制备方法为：制何首乌、陈皮和番泻叶按照上述相同的方法加入至甲醇中，超声，过滤即得。制何首乌阴性处方、陈皮阴性处方、番泻叶阴性处方的制备方法为：将不含制何首乌的通便类中药处方、不含陈皮的通便类中药处方和不含番泻叶的通便类中药处方叶按照上述相同的方法加入至甲醇中，超声，过滤即得。
对照品溶液的制备
精密称取番泻苷A 10.64mg于10mL容量瓶中，加含0.1％的NaHCO3(质量浓度)的体积分数为30％甲醇超声溶解并定容，制成每1mL番泻苷A 1.034mg的对照品母液；
精密称取番泻苷B14.17mg于10mL容量瓶中，加含0.1％的NaHCO3(质量浓度)的体积分数为30％甲醇超声溶解并定容，制成每1mL番泻苷B1.360mg的对照品母液；
精密称取二苯乙烯苷4.91mg于10mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，制成每1mL二苯乙烯苷0.481mg的对照品母液；
精密称取橙皮苷5.49mg于20mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，制成每1mL橙皮苷0.262mg的对照品母液；
吸取番泻苷A母液1mL与番泻苷B母液1mL于同一10mL容量瓶中，加含0.1％的NaHCO3(质量浓度)的体积分数为30％甲醇定容，制成番泻苷A0.1034 mg/mL与番泻苷B0.1360 mg/mL的混标溶液。
吸取二苯乙烯苷母液1mL与橙皮苷母液1mL于同一10mL容量瓶中，加甲醇定容，制成二苯乙烯苷0.0481mg/mL与橙皮苷0.0262mg/mL的混标溶液。
分别取空白溶剂体积分数为50％甲醇、二苯乙烯苷、番泻苷A、番泻苷B、橙皮苷对照品溶液，制何首乌单味药、陈皮单味药、番泻叶单味药、通便类中药全方(即本申请的通便类中药)、制何首乌阴性处方、陈皮阴性处方、番泻叶阴性处方按实施例6中的色谱条件进样，记录色谱图如图26～28所示。具体的，图26～27中，二苯乙烯苷+橙皮苷即为苯乙烯苷0.0481mg/mL与橙皮苷0.0262mg/mL的混标溶液；图28中，番泻苷A+B即为番泻苷A0.1034mg/mL与番泻苷B0.1360 mg/mL的混标溶液。
从图26～28中可以看出，空白溶剂指标性成分对应保留时间无干扰，阴性中无干扰，各指标成分属于相对应药材的专属性成分。
将二苯乙烯苷对照品母液依次稀释为0.0096mg/mL、0.0241mg/mL、0.0481mg/mL、0.0962mg/mL、0.2406mg/mL，番泻苷B对照品母液依次稀释为0.034mg/mL、0.068mg/mL、0.136mg/mL、0.6802mg/mL，番泻苷A对照品母液依次稀释为0.0259mg/mL、0.0517mg/mL、0.1034mg/mL、0.5171mg/mL，橙皮苷对照品母液依次稀释为0.0052mg/mL、0.0131mg/mL、0.0262mg/mL、0.0523mg/mL、0.1308mg/mL。按上述实施例6中的色谱条件进样分析，以浓度C(mg/mL)为横坐标，峰面积A为纵坐标进行回归分析，回归方程见表5。
表5-4种指标成分的回归方程
成分 回归方程 线性范围mg/ml R<sup>2</sup>
二苯乙烯苷 y＝17315x-44.433 0.0096～0.4812 0.9999
番泻苷A y＝4464.5x+9.9369 0.0259～1.0342 1.0000
番泻苷B y＝4054.7x+12.932 0.0340～1.3603 1.0000
橙皮苷 y＝8728.2x+0.3672 0.0052～0.2616 0.9999
从表5中可以看出，二苯乙烯苷在0.0096mg/mL～0.4812mg/mL范围内、番泻苷B在0.034mg/mL～1.3603mg/mL范围内、番泻苷A在0.0259mg/mL～1.0342mg/mL范围内、橙皮苷在0.0052mg/mL～0.2616mg/mL范围内线性关系良好。
取浓度为0.1360mg/mL番泻苷B、0.1034mg/mL番泻苷A、0.0481mg/mL二苯乙烯苷、0.0262mg/mL橙皮苷对照品溶液，按上述实施例6中的色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD，所得结果见下表6。
表6-精密度番泻苷B、番泻苷A、二苯乙烯苷、橙皮苷峰面积
Figure BDA0003616713980000181
Figure BDA0003616713980000191
从表6中可以看出，各指标成分的峰面积RSD均小于3％，仪器精密度良好。
取上述通便类中药待测溶液于0h、5h、10h、15h、24h按实施例6中的色谱条件进样分析，记录指标成分峰面积，计算含量RSD，所得结果见下表7。
表7–稳定性-每克干浸膏粉中各指标成分含量结果(单位mg)
时间 二苯乙烯苷 番泻苷B 番泻苷A 橙皮苷
0h 3.23 7.37 6.19 4.13
5h 3.23 7.42 6.16 4.12
10h 3.23 7.28 6.16 4.13
15h 3.23 7.14 6.18 4.14
24h 3.22 7.54 6.04 4.08
平均 3.23 7.35 6.15 4.12
SD 0.01 0.15 0.06 0.02
RSD％ 0.21 2.02 1.01 0.53
从表7中可以看出，各指标成分含量在24h内含量RSD在3％以内，样品在常温放置24h内稳定。
取上述通便类中药待测溶液，按实施例6中的色谱条件进样分析，记录指标成分峰面积，计算含量RSD，平行测量6次，结果如下表8所示。
表8-重复性-每克干浸膏粉中各指标成分含量结果(单位mg)
Figure BDA0003616713980000192
Figure BDA0003616713980000201
从表8中可以看出，各指标成分含量RSD均小于3％，该方法重复性良好。
根据重复性结果，可以计算出称取0.075g干膏粉中指标性成分的含量。取已知含量的通便类中药干膏粉0.075g，平行称取6份，精密称定，分别精密加入二苯乙烯苷对照品溶液、番泻苷B对照品溶液、番泻苷A对照品溶液、橙皮苷对照品溶液，按样品溶液制备方法制备，按以下公式计算加标回收率，所得结果见下表9。
Figure BDA0003616713980000202
表9-准确度结果表
Figure BDA0003616713980000203
Figure BDA0003616713980000211
试验结果表明：各指标成分的加标回收率均在90％～108％之间，该方法准确度良好。
进样流速分别设定为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min，其他条件同上述实施例6中色谱条件。精密吸取对照品混标溶液和通便类中药待测溶液各5μL分别进样分析，所得结果见下表10。其中，Rt是保留时间(min)，USP分离度是峰与峰之间的分离程度，两个指标均是液相色谱仪器积分计算得出。
表10-流速考察结果表
Figure BDA0003616713980000212
从表10中可以看出，番泻苷A与橙皮苷由于保留时间较为接近，当升高或降低流速时会使两者不能实现完全分离，建议选择流动相流速为1.0mL/min。
流动相A分别为体积分数为0.05％三氟乙酸水溶液(pH＝2.36)、体积分数为0.1％三氟乙酸水溶液(pH＝2.13)，其他条件同上述实施例6色谱条件。精密吸取对照品混标溶液和通便类中药待测溶液各5μL分别进样分析，所得结果见下表11。
表11流动相酸性考察结果表
Figure BDA0003616713980000213
Figure BDA0003616713980000221
从表11中可以看出，两种不同酸度的流动相色谱图结果均良好，建议流动相酸性pH＝2.13～2.36。
柱温分别设定为28℃、30℃、32℃，其他条件同上述色谱条件。精密吸取对照品混标溶液和通便类中药待测溶液各5μL分别进样分析所得结果见下表12。
表12-柱温考察结果表
Figure BDA0003616713980000222
从表12中可以看出，柱温结果表明，28℃对色谱图结果影响较大，建议选择柱温为30℃或32℃。
色谱柱选用编号A(AgiLent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，3.5-Micron，P.N.884950-567，S.N.USAWX03029))、编号B(kromasiL100-5-C18色谱柱，4.6×250mm，M05CLA25/E198809)，其他条件同上述实施例6色谱条件。精密吸取对照品混标溶液和通便类中药待测溶液各5μL分别进样分析所得结果见下表13。
表13-色谱柱型号考察结果表
Figure BDA0003616713980000223
Figure BDA0003616713980000231
从表13中可以看出，色谱柱型号结果表明，色谱柱型号对色谱图结果影响较大，建议选择AgiLent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×250mm，3.5-Micron)。
高效液相色谱仪选用编号A(HPLC 1260配四元泵DEAE 207941，DAD检测器DEAC611591，厂家：美国安捷伦公司)、编号B(LC-20AT，紫外可见光检测器，编号：L20115534250AE，厂家：日本株式会社岛津制作所)其他条件同上述实施例6色谱条件。精密吸取对照品混标溶液和通便类中药待测溶液各5μL分别进样分析所得结果见下表14。
表14-色谱柱型号考察结果表
Figure BDA0003616713980000232
从表14中可以看出，高效液相色谱仪建议选择安捷伦高效液相色谱仪(HPLC 1260配四元泵，DAD检测器，厂家：美国安捷伦公司)。
所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种通便类中药的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
将通便类中药处方加入至水中，于90～95℃下加热8～12min，过滤后得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入水中，于90～95℃下加热25～35min，过滤后得到第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣加入水中，于90～95℃下加热5～6h，过滤后得到第三滤液和第三滤渣；将第一滤液、第二滤液和第三滤液合并得到提取液；
或，将不含有番泻叶的通便类中药处方加入至水中浸泡后，加热至沸腾并保持1.5～2.5h，停止加热后然后加入番泻叶并保持12～18min，过滤后得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣加入至水中，加热至沸腾并保持0.5～1h，过滤，得到第五滤液和第五滤渣；将第四滤液和第五滤液合并得到提取液；
将提取液减压浓缩，得到浓缩液，其中浓缩温度为60～70℃，浓缩后浓缩液密度为1.0～1.1g/mL；
将浓缩液置于冷冻干燥机中，于温度为-80～-90℃、压力为3.5～20Pa下冷冻干燥24～30h，即得通便类中药。
2.如权利要求1所述的通便类中药的制备工艺，其特征在于，将通便类中药处方加入至水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的18～22倍；将第一滤渣加入水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的8～12倍；将第二滤渣加入水中的步骤中，水的质量为通便类中药处方质量的8～12倍。
3.如权利要求1所述的通便类中药的制备工艺，其特征在于，将不含有番泻叶的通便类中药处方加入至水中的步骤中，水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方质量以及后续加入的番泻叶质量之和的18～22倍；将第四滤渣加入至水中的步骤中，水的质量为不含有番泻叶的通便类中药处方质量和加入的番泻叶质量之和的8～12倍。
4.如权利要求1所述的通便类中药的制备工艺，其特征在于，所述通便类中药处方包括以下重量份原料：2～4份的黑芝麻、3～5份的桑椹、3～5份的制何首乌、1～3份的陈皮、13～17份的番泻叶；
所述不含有番泻叶的通便类中药处方包括以下重量份原料：2～4份的黑芝麻、3～5份的桑椹、3～5份的制何首乌、1～3份的陈皮；其中，加入番泻叶并保持12～18min的步骤中加入的加入番泻叶重量份为13～17份。
5.如权利要求1所述的通便类中药的制备工艺，其特征在于，将浓缩液置于冷冻干燥机中冷冻干燥之前，还包括将浓缩液置于温度为-80～-90℃的环境下预冻。
6.一种如权利要求1～5任一所述的制备工艺制备得到的通便类中药的成分鉴定方法，其特征在于，包括：
陈皮的鉴定：将通便类中药加入至甲醇中，超声，过滤后浓缩得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯、甲醇和水的混合物为展开剂，展至2～4cm，再以甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的混合物为展开剂，展至6～10cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视；
制何首乌的鉴定：将通便类中药加入至乙醇中，加热回流，过滤后将滤液浓缩，再加入乙醇复溶，得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至2～4cm，再以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至6～10cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视；
番泻叶的鉴定：将通便类中药加入至甲醇中，超声后，离心，收集上清液蒸干后得到残渣，再向残渣中加入水溶解后再加入石油醚，振荡，弃去石油醚，将余下的水溶液蒸干并加入乙醇，得到待测溶液；利用薄层色谱法，将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯、异丙醇和水的混合物为展开剂，展至13～17cm，晾干，喷以三氯化铝试液，置于紫外光灯下检视。
7.如权利要求6所述的通便类中药的成分鉴定方法，其特征在于，陈皮的鉴定过程中，乙酸乙酯、甲醇和水的混合物中乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为100:(15～19):(10～15)，甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的混合物中甲苯、乙酸乙酯、甲酸、水的体积比为20:(8～12):(0.5～2):(0.5～2)；
制何首乌的鉴定过程中，以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至2～4cm，其中，三氯甲烷和甲醇的体积比为7:(1～5)；再以三氯甲烷和甲醇的混合物为展开剂，展至6～10cm，其中，三氯甲烷和甲醇的体积比为20:(0.5～2)；
番泻叶的鉴定过程中，乙酸乙酯、异丙醇和水的混合物中乙酸乙酯、异丙醇和水的体积比为(4～5):(4～5):(2～3)。
8.如权利要求6所述的通便类中药的成分鉴定方法，其特征在于，在陈皮的鉴定过程中，同时配制橙皮苷对照溶液以及不含陈皮的阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同时，将橙皮苷对照溶液以及不含陈皮的阴性对照液点在硅胶G薄层板上；
在制何首乌的鉴定过程中，同时配制二苯乙烯苷对照溶液、何首乌对照药材溶液以及不含制何首乌阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同上，将二苯乙烯苷对照溶液、何首乌对照药材溶液以及不含制何首乌阴性对照液点在硅胶G薄层板上；
在番泻叶的鉴定过程中，同时配制番泻叶对照药材溶液、不含番泻叶阴性对照液；将待测溶液点在氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上的同上，将番泻叶对照药材溶液、不含番泻叶阴性对照液点在硅胶G薄层板上。
9.一种如权利要求1～5任一所述的制备工艺制备得到的通便类中药的成分检测方法，其特征在于，包括：
将通便类中药加入至醇溶剂中，超声后得到待测溶液；
利用高效液相色谱法对待测溶液成分进行检测；
所述高效液相色谱法检测过程中的流动相为流动相A和流动相B，所述流动相A为三氟乙酸水溶液，所述流动相B为乙腈；
所述高效液相色谱法检测过程中采用梯度洗脱的方式使流动相通过色谱柱，所述梯度洗脱的方法为：
在0～15min，所述流动相A在流动相中的体积含量为90～85％，所述流动相B在流动相中的体积含量为10～15％；
在15～20min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为85％，所述流动相B在流动相中的体积含量为15％；
在20～28min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为85～83.5％，所述流动相B在流动相中的体积含量为15～16.5％；
在28～30min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为83.5～81.5％，所述流动相B在流动相中的体积含量为16.5～18.5％；
在30～35min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为81.5～75％，所述流动相B在流动相中的体积含量为18.5～25％；
在35～48min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为75～42％，所述流动相B在流动相中的体积含量为25～58％；
在48～50min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为42～90％，所述流动相B在流动相中的体积含量为58～10％；
在50～60min，所述流动相A在流动相中的流动相中的体积含量为90％，所述流动相B在流动相中的体积含量为10％。
10.如权利要求9所述的的通便类中药的成分检测方法，其特征在于，所述醇溶剂为体积分数为30～80％的甲醇溶剂，所述通便类中药与醇溶剂的质量体积比为(0.1～1.5)g:(8～12)ml；
所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；
流动相流速为0.8～1.2mL/min，柱温为30～32℃，三氟乙酸水溶液中三氟乙酸体积浓度为0.05～0.1％，检测波长为282～286nm、318～322nm、335～345nm。
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