CN114609309A - 一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物前处理技术领域，具体涉及一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法。本发明提供的前处理方法，包括：将他克莫司软膏和溶散溶剂混合，得到他克莫司软膏溶液；用乙腈水溶液对他克莫司软膏溶液进行提取，得到下清液；所述溶散溶剂包括正庚烷或正己烷。本发明采用正庚烷或正己烷作为溶散溶剂，采用乙腈水溶液一步提取，操作简便，提取效率高。他克莫司在正庚烷或正己烷中几乎不溶，在乙腈水溶液中溶解性较好，而他克莫司软膏中的凡士林等油性基质在正庚烷或正己烷中溶解性较好，在乙腈水溶液中溶解性较差，本发明采用正庚烷溶散，乙腈水溶液提取，可有效避免基质对有关物质测定的影响，保证了他克莫司有关物质的有效提取。

Description

一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法
技术领域
本发明涉及药物前处理技术领域，具体涉及一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法。
背景技术
他克莫司软膏的基质组成中包含白凡士林、蜂蜡、石蜡和液体石蜡等成分，这些油脂性基质辅料均为多组分混合物，由于国内各厂家制备工艺和质量控制标准不同，其所含组分情况也各不相同，即使同一厂家生产的不同批次的辅料其性质也存在较大差异，这往往会使他克莫司软膏有关物质测定结果存在巨大偏差。对杂质的控制是药品研发领域一个非常重要的环节，直接关系到药品的稳定性、有效性及安全性。因此，开发一种有效的他克莫司软膏样品的前处理方法，以去除油脂性基质中辅料的干扰，保证他克莫司有关物质的有效提取，进而实现他克莫司有关物质的精确检测十分必要。
公开号为CN 109828038A的中国专利提出采用正己烷-乙酸乙酯混合溶液进行提取，采用固相萃取柱进行分离，但有文献报道不同品牌的乙酸乙酯会产生不明杂质，从而影响分析结果。
公开号为CN 112730704A的中国专利采用正己烷-丙酮混合溶液溶散软膏，低温处理后离心，取上清液采用固相萃取柱进行分离，该专利采用低温处理，减少基质影响，且避免了不同品牌的乙酸乙酯对检测的干扰。但该方法仍采用固相萃取柱萃取，操作步骤为先用正己烷-乙酸乙酯淋洗固相萃取柱6次，去除基质对检测的干扰，再用乙酸乙酯和乙腈分别进行洗脱，收集乙酸乙酯及乙腈洗脱液，旋转蒸干后加正己烷-正丁基氯-乙腈混合溶液溶解，该方法操作步骤繁琐、费时。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法。本发明所述的前处理方法操作步骤简单，且能保证他克莫司有关物质的有效提取。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，包括以下步骤：
将他克莫司软膏和溶散溶剂混合，得到他克莫司软膏溶液；
用乙腈水溶液对他克莫司软膏溶液进行提取，得到下清液；
所述溶散溶剂包括正庚烷或正己烷。
优选地，所述他克莫司软膏和溶散溶剂的用量比为3g:15～30mL。
优选地，所述混合的方式为振摇，所述振摇频率为200～350rpm，混合的时间为10～20min。
优选地，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为5:5～7:3。
优选地，所述他克莫司软膏溶液和乙腈水溶液的体积比为20:20～40。
优选地，所述提取为振摇提取，所述振摇提取的频率为200～350rpm，提取的时间为10～40min。
优选地，所述提取的温度为20～40℃。
本发明提供了一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，包括以下步骤：将他克莫司软膏和溶散溶剂混合，得到他克莫司软膏溶液；用乙腈水溶液对他克莫司软膏溶液进行提取，得到下清液；所述溶散溶剂包括正庚烷或正己烷。本发明采用正庚烷或正己烷作为溶散溶剂，采用乙腈水溶液一步提取，无分步提取过程，无分液过程，操作简便，提取效率高。而且他克莫司在正庚烷或正己烷中几乎不溶，在乙腈水溶液中溶解性较好，而他克莫司软膏中的凡士林等油性基质在正庚烷或正己烷中溶解性较好，在乙腈水溶液中溶解性较差，本发明采用正庚烷或正己烷溶散，乙腈水溶液提取，可有效避免基质对有关物质测定的影响，同时保证他克莫司有关物质的有效提取。
附图说明
图1为实施例1空白软膏溶液的HPLC色谱图；
图2为实施例1加标供试品溶液中他克莫司有关物质的HPLC色谱图；
图3为实施例1供试品溶液中他克莫司有关物质的HPLC色谱图；
图4为对比例1空白软膏溶液的HPLC色谱图；
图5为对比例1供试品溶液中他克莫司有关物质的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，包括以下步骤：
将他克莫司软膏和溶散溶剂混合，得到他克莫司软膏溶液；
用乙腈水溶液对他克莫司软膏溶液进行提取，得到下清液。
在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
本发明将他克莫司软膏和溶散溶剂混合，得到他克莫司软膏溶液。
本发明中，所述溶散溶剂包括正庚烷或正己烷，优选为正庚烷。本发明中，所述他克莫司软膏和溶散溶剂的用量比优选为3g:15～30mL，进一步优选为3g:15～25mL。
本发明中，所述混合的方式为振摇，所述振摇的频率优选为200～350rpm，进一步优选为200～300rpm，所述振摇的时间优选为10～20min，进一步优选为15～20min。本发明中，所述混合优选在分液漏斗中进行。
得到他克莫司软膏溶液后，本发明用乙腈水溶液对他克莫司软膏溶液进行提取，得到下清液。
在本发明中，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比优选为5:5～7:3，进一步优选为3:2。
本发明中，所述他克莫司软膏溶液和乙腈水溶液的体积比优选为20:20～40，进一步优选为20:20～30。
本发明中，所述提取优选为振摇提取，所述振摇提取的频率优选为200～350rpm，进一步优选为200～300rpm；所述提取的时间为10～40min，进一步优选为20～30min。本发明中，所述提取的温度优选为20～40℃，进一步优选为20～35℃。
所述提取后，本发明优选还包括将提取所得料液进行静置分层。本发明对所述静置分层的时间不做具体限定，能够得到上、下分层的清液即可。本发明中，所述静置分层优选得到上清液和下清液，所述下清液作为供试品溶液。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
供试品溶液：取他克莫司软膏3g，精密称定，置分液漏斗中，加入20mL正庚烷，以频率280rpm振摇15min至软膏完全溶散，得到他克莫司软膏溶液。
然后向他克莫司软膏溶液中加入25mL体积浓度为60％的乙腈水溶液，以频率280rpm振摇20min，静置分层，取下清液作为供试品溶液。
空白软膏溶液：取不含他克莫司的空白软膏3g，配制过程同供试品溶液。
对比例1
供试品溶液：取他克莫司软膏1g，置于具塞离心管中，然后向具塞离心管中加入正己烷和乙酸乙酯的混合溶液(正己烷和乙酸乙酯的体积比为10：1)5mL，置于振摇器上振摇直至混悬完全，得到他克莫司软膏溶液，然后将所述他克莫司软膏溶液在转速3000rpm的条件下离心5min，得到上清液，将上清液转移至固相萃取柱中；再向离心管中加入正己烷和乙酸乙酯的混合溶液5mL重复上述操作1次、离心，所得上清液转移至上述步骤使用的同一固相萃取柱中，然后，用正己烷和乙酸乙酯的混合溶液淋洗上述吸附有上清液的固相萃取柱6次，每次用量5mL。
然后，取乙酸乙酯5mL加入固相萃取柱中进行洗脱，待乙酸乙酯洗脱完全后，再加入乙腈5mL洗脱，用梨形瓶收集乙酸乙酯和乙腈洗脱液。将收集到的混合洗脱液旋转蒸发，蒸发后的残留物加乙腈水溶液(体积浓度为60％)8mL，涡旋使残留物溶解，作为供试品溶液。
空白软膏溶液：取不含他克莫司的空白软膏1g，配制过程同供试品溶液。
利用高效液相色谱法对他克莫司软膏有关物质进行检测，HPLC的仪器色谱条件：流动相A为0.01mol/L磷酸盐缓冲液；流动相B为乙腈；流速为1.2mL/min；硅胶柱填充剂为：十八烷基硅烷键合硅胶；检测波长为220nm；柱温为40℃；进样体积50μL；洗脱方式：线性梯度洗脱。
专属性检测：
取实施例1空白软膏溶液按照HPLC仪器色谱条件进行检测，结果如图1所示。
加标供试品溶液：取他克莫司软膏3g，精密称定，置分液漏斗中，加入20mL正庚烷，以频率280rpm振摇15min至软膏完全溶散，得到他克莫司软膏溶液。然后向他克莫司软膏溶液中加入杂质储备液(含杂质XI、杂质A、杂质XV及杂质IX)1mL，再加入24mL体积浓度为60％的乙腈水溶液，以频率280rpm振摇20min，静置至分层，取下层澄清液作为加标供试品溶液。取加标供试品溶液按照HPLC仪器色谱条件进行检测，检测结果见图2。从图1～图2可知，空白基质对杂质及主峰检测无干扰，他克莫司峰与相邻杂质峰分离度大于1.3；其余杂质间分离度均大于1.5，符合标准要求；主峰峰纯度合格；本方法专属性良好。
所述杂质储备液的制备，包括以下步骤：分别取标准品杂质XI、杂质A、杂质XV以及杂质IX各适量，加乙腈水混合溶液溶解并定量稀释制成约含杂质XI 20μg/mL、杂质A20μg/mL、杂质XV40μg/mL以及杂质IX 20μg/mL的混合溶液，得到杂质储备液。
有关物质回收率检测：
加标供试品溶液：取他克莫司软膏3g，精密称定，置分液漏斗中，加入20mL正庚烷，以频率280rpm振摇15min至软膏完全溶散，得到他克莫司软膏溶液。然后向他克莫司软膏溶液中精密加入杂质储备液适量，再精密加入适当体积乙腈水溶液，以频率280rpm振摇20min，静置至分层，取下层澄清液分别作为50％、100％、150％的加标供试品溶液。
所述杂质的加入量是按照标准规定的他克莫司软膏中杂质的限度浓度配制的。
表1他克莫司软膏有关物质回收率检测结果
Figure BDA0003558004520000051
Figure BDA0003558004520000061
从表1可以看出：各已知杂质在9份加标供试品溶液中平均回收率在93.5％～100.8％之间，回收率RSD最大为7.3％，小于8％；准确度良好。
将实施例1和对比例1处理后得到的空白软膏溶液以及供试品溶液分别按照HPLC仪器色谱条件进行检测，结果见图1、图3～5和表2。
图1为实施例1空白软膏溶液的HPLC色谱图，从图1可知，基质峰在0～20min及54min以后出峰，不干扰样品检测。
图3为实施例1供试品溶液中他克莫司有关物质的HPLC色谱图，从图3可知：相比于图5，两者杂质峰检出个数一致，但图3中20～54min基线较平稳，无基质峰干扰检测。
图4为对比例1空白软膏溶液的HPLC色谱图，从图4可知，在20～54min仍有一些较小基质峰，部分基质峰干扰样品检测。
图5为对比例1供试品溶液中有关物质的HPLC色谱图；图5在检测过程中除他克莫司异构体I、II之外，仍检出三个未知杂质。
表2他克莫司软膏有关物质检测结果对比表
Figure BDA0003558004520000062
Figure BDA0003558004520000071
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
将他克莫司软膏和溶散溶剂混合，得到他克莫司软膏溶液；
用乙腈水溶液对所述他克莫司软膏溶液进行提取，得到下清液；
所述溶散溶剂包括正庚烷或正己烷。
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述他克莫司软膏和溶散溶剂的用量比为3g:15～30mL。
3.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述混合的方式为振摇，所述振摇的频率为200～350rpm，所述振摇的时间为10～20min。
4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为5:5～7:3。
5.根据权利要求1或4所述的前处理方法，其特征在于，所述他克莫司软膏溶液和乙腈水溶液的体积比为20:20～40。
6.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述提取为振摇提取，所述振摇提取的频率为200～350rpm，提取的时间为10～40min。
7.根据权利要求1或6所述的前处理方法，其特征在于，所述提取的温度为20～40℃。
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