CN112730704B - 一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其是在以正己烷‑丙酮混合溶液作为提取溶剂的基础上，采用低温冻融处理，以有效去除油性软膏基质对有关物质检测的干扰，从而实现目标物质的有效测定，其专属性好，杂质回收率符合要求。

Description

一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法。
背景技术
他克莫司（tacrolimus），也称为FK-506或FR-900506，是1984年日本Fujisawa制药公司从土壤放线菌中分离出来的一种具有大环内酯结构的新型强力免疫抑制剂。他克莫司的主要药理作用在于能有效抑制T细胞激活，在肝移植抗排斥方面和治疗特应性皮炎方面具有其它药物无可比拟的优势。近期研究发现他克莫司软膏可以有效治疗特应性皮炎、银屑病、脂溢性皮炎等，且其适应症仍在不断扩展。目前，他克莫司软膏适于因潜在危险而不宜使用传统疗法，或对传统疗法反应不充分、或无法耐受传统疗法的中到重度特应性皮炎患者，作为短期或间歇性长期治疗。
他克莫司软膏的基质组成中包含白凡士林、蜂蜡、石蜡、液体石蜡等成分，这些油脂性基质辅料均为多组份混合物，由于国内各厂家制备工艺和质量控制标准不同，其所含组分情况也各不相同，即使同一厂家生产的不同批次的辅料其性质也存在较大差异，这往往会使其有关物质测定结果存在巨大偏差。对杂质的控制是药品研发领域一个非常重要的环节，直接关系到药品的稳定性、有效性及安全性，采用常规的溶剂提取或固相萃取柱提取等方法无法保证将不同批次油脂性基质与他克莫司及其相关物质有效分离出来。发明专利CN 109828038A中提出采用正己烷-乙酸乙酯混合溶液进行提取，并采用固相萃取柱进行分离。但有文献报道部分品牌的乙酸乙酯会产生不明杂质，从而影响分析结果。因此，开发一种有效的他克莫司软膏样品的前处理方法，以去除油脂性基质中辅料的干扰，保证他克莫司及其相关物质的有效提取，有助于提高分析方法的重复性、准确性及适用性，并可为制剂的质量控制提供良好保证。
发明内容
本发明的目的在于提供一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其可有效去除油性软膏基质对有关物质检测的干扰，保证他克莫司及其相关物质的有效提取，提高分析方法的重复性、准确性及适用性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其包括如下步骤：
（1）样品提取：称取适量他克莫司软膏于玻璃离心管中，加入正己烷-丙酮混合溶液，剧烈振荡至混悬完全后低温静置，再以4000r/min离心5min，取上清液，重复提取1次后，合并上清液；
（2）固相萃取柱分离：将步骤（1）所得上清液全部转移入固相萃取柱，使他克莫司及其相关物质完全吸附于固相萃取柱后，再用正己烷-乙酸乙酯混合溶液进行淋洗，之后先用乙酸乙酯洗脱，待乙酸乙酯洗脱完成后再加入乙腈进行洗脱，用梨形瓶分别收集乙酸乙酯和乙腈的洗脱液，并将所有洗脱液合并，旋转蒸干，再在所得残留物中加入少量正己烷-正丁基氯-乙腈混合溶液，涡旋使残留物溶解后，所得溶液经微孔滤膜过滤后用于HPLC定性测定。
步骤（1）中所用他克莫司软膏与正己烷-丙酮混合溶液的质量体积比为1g:5mL；所述正己烷-丙酮混合溶液中正己烷与丙酮的体积比为5:1-15:1，优选为10:1。
步骤（1）中所述低温静置的温度为-50~-5℃，优选为-20℃，时间为20-40min，优选为30min。
步骤（2）所用正己烷-乙酸乙酯混合溶液与上清液的体积比为3:1；所述正己烷-乙酸乙酯混合溶液中正己烷与乙酸乙酯的体积比为1:1-10:1，优选为2:1。
步骤（2）中用于洗脱的乙酸乙酯及乙腈与上清液的体积比均为1:2。。
步骤（2）所述正己烷-正丁基氯-乙腈混合溶液中正己烷、正丁基氯与乙腈的体积比为1:1:1。
本发明的显著优势在于：
本发明采用正己烷-丙酮作为提取溶剂，结合低温冻融的方法，以尽可能减少提取过程中油脂性基质引入的杂质，避免其对有关物质检测的干扰；同时在淋洗步骤中通过调控正己烷与乙酸乙酯的比例，可在保证他克莫司杂质回收率的前提下，提高其对基质的分离能力，以适应不同厂家基质辅料中组分的差异性。
附图说明
图1为对比例1提取得到的空白对照溶液中有关物质的HPLC图谱。
图2为对比例1提取得到的他克莫司供试品溶液中有关物质的HPLC图谱。
图3为实施例1提取得到的空白对照溶液中有关物质的HPLC图谱。
图4为实施例1提取得到的他克莫司供试品溶液中有关物质的HPLC图谱。
图5为对比例2提取得到的空白对照溶液中有关物质的HPLC图谱。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1：
称取1.0g他克莫司软膏以及1.0g空白软膏辅料，分别置于玻璃离心管中，加入5mL正己烷-丙酮（10:1，v/v）混合溶液，剧烈振荡至混悬完全后于-20℃低温静置30min，再以4000r/min离心5min，取上清液。重复上述提取步骤1次，合并上清液。将10mL所得上清液全部转移入固相萃取柱。用正己烷-乙酸乙酯（2:1，v/v）混合溶液淋洗固相萃取柱6次，每次5mL。然后吸取5.0mL乙酸乙酯加入固相萃取柱中，待乙酸乙酯洗脱完后，再加入5.0mL乙腈洗脱，用梨形瓶分别收集乙酸乙酯和乙腈的洗脱液，然后将收集到的洗脱液旋转蒸发，得到残留物。在得到的残留物中加入1.0mL正己烷-正丁基氯-乙腈（1:1:1，v/v/v）混合溶液，涡旋使残留物溶解，经微孔滤膜过滤后为他克莫司供试品溶液以及空白对照溶液，注入高效液相色谱仪进行分析，并记录色谱图。
实施例2：
称取1.0g他克莫司软膏置于玻璃离心管中，加入5mL正己烷-丙酮（5:1，v/v）混合溶液，剧烈振荡至混悬完全后于-10℃低温静置40min，再以4000r/min离心5min，取上清液。重复上述提取步骤1次，合并上清液。将10mL所得上清液全部转移入固相萃取柱。用正己烷-乙酸乙酯（10:3，v/v）混合溶液淋洗固相萃取柱6次，每次5m。然后吸取5.0mL乙酸乙酯加入固相萃取柱中，待乙酸乙酯洗脱完后，再加入5.0mL乙腈洗脱，用梨形瓶分别收集乙酸乙酯和乙腈的洗脱液，然后将收集到的洗脱液旋转蒸发，得到残留物。在得到的残留物中加入1.0mL正己烷-正丁基氯-乙腈（1:1:1，v/v/v）混合溶液，涡旋使残留物溶解，经微孔滤膜过滤后为供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行分析，并记录色谱图。
对比例1：
称取1.0g他克莫司软膏以及1.0g空白软膏辅料，分别置于玻璃离心管中，加入5.0mL正己烷-乙酸乙酯（10:1，v/v）混合溶液，剧烈振荡至混悬完全后，以4000r/min离心5min，取上清液。重复上述提取步骤1次，合并上清液。将10mL所得上清液全部转移入固相萃取柱。用正己烷-乙酸乙酯（10:1，v/v）混合溶液淋洗固相萃取柱6次，每次5mL。然后吸取5.0mL乙酸乙酯加入固相萃取柱中，待乙酸乙酯洗脱完后，再加入5.0mL乙腈洗脱，用梨形瓶分别收集乙酸乙酯和乙腈的洗脱液，然后将收集到的洗脱液旋转蒸发，得到残留物。在得到的残留物中加入1.0mL正己烷-正丁基氯-乙腈（1:1:1，v/v/v）混合溶液，涡旋使残留物溶解，经微孔滤膜过滤后为他克莫司供试品溶液以及空白对照溶液，注入高效液相色谱仪进行分析，并记录色谱图。
对比例2：
称取1.0g空白软膏置于玻璃离心管中，加入5mL正己烷-丙酮（5:1，v/v）混合溶液，剧烈振荡至混悬完全后，以4000r/min离心5min，取上清液。重复上述提取步骤1次，合并上清液。将10mL所得上清液全部转移入固相萃取柱。用正己烷-乙酸乙酯（2:1，v/v）混合溶液淋洗固相萃取柱6次，每次5m。然后吸取5.0mL乙酸乙酯加入固相萃取柱中，待乙酸乙酯洗脱完后，再加入5.0mL乙腈洗脱，用梨形瓶分别收集乙酸乙酯和乙腈的洗脱液，然后将收集到的洗脱液旋转蒸发，得到残留物。在得到的残留物中加入1.0mL正己烷-正丁基氯-乙腈（1:1:1，v/v/v）混合溶液，涡旋使残留物溶解，经微孔滤膜过滤后为空白对照溶液，注入高效液相色谱仪进行分析，并记录色谱图。
1. 采用高效液相法测定他克莫司软膏中有关物质
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6×250mm)为填充剂，将两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
将对比例1和实施例1处理后得到的他克莫司供试品溶液以及空白对照溶液分别进行测定，结果见图1-4所示。按照质量标准规定，对保留时间小于他克莫司（约16min）的杂质，计算含量大于0.1%的杂质，对保留时间大于他克莫司的杂质，计算含量大于0.20%的杂质。从图1、2中可以看出，辅料峰会严重干扰他克莫司及其相关杂质测定；且由于在保留时间100min左右出现的辅料峰，需要延长样品的检测分析时间至少120min以上才能保证不干扰下一样品的测定，增加了检测时间、有机溶剂使用等检测成本。同时因为辅料峰干扰的不确定性，在稳定性试验过程中经常会造成测定数据无法溯源统计。而由图3、4可见，采用实施例1方法处理后的供试品溶液能很显著的消除辅料峰的干扰，准确对他克莫司及相关杂质进行分析，且缩短检测时间，重现好，适用性好。
将按对比例1、2及实施例1处理后的空白对照溶液进行测定，由图1、3、5对比可知，采用对比例1方法处理后，软膏辅料峰会严重干扰他克莫司及其相关杂质的测定。采用对比例2方法处理后，能够基本消除60min之内的辅料峰干扰，但在100min的辅料峰虽然已明显降低，但仍不符合检测要求。而按实施例1处理能很好的消除120min内辅料峰的干扰。由此证明，采用正己烷-丙酮作为提取溶剂，联合低温冻融的方法，可以有效的减少提取过程中油脂性基质引入的杂质。
2. 他克莫司软膏提取方法的回收率测定
分别配制1mg/ml他克莫司系统适应性溶液（USP，批号：F0J361）和10μg/ml他克莫司相关化合物A溶液（USP，批号G0M223）。在空白软膏基质中加入1ml他克莫司系统适应性溶液后，涡旋混匀，按实施例1方法进行处理。在他克莫司软膏中加入1ml他克莫司相关化合物A溶液，涡旋混匀，按实施例1方法进行处理。
HPLC仪器色谱条件设置：用羟丙基硅烷键合硅胶(Supelcosil LC-Diol，5μm，4.6×250mm)为填充剂，将两根相同的色谱柱串联使用，以正己烷-正丁基氯-乙腈(7∶2∶1)为流动相，流速为1.4ml/min，柱温为28℃，检测波长为225nm，进样体积为20μl。
结果显示，在空白软膏基质中加入他克莫司系统适应性溶液并经实施例1方法处理后，他克莫司的回收率在98.2%，他克莫司杂质XI的回收率为97.2%，他克莫司相关化合物A的回收率为97.4%。在他克莫司软膏中加入他克莫司相关化合物A溶液并经实施例1方法处理后，他克莫司相关化合物A的回收率为92.1%；均符合分析要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样品提取：称取适量他克莫司软膏于玻璃离心管中，加入正己烷-丙酮混合溶液，剧烈振荡至混悬完全后低温静置，再以4000r/min离心5min，取上清液，重复提取1次后，合并上清液；
（2）固相萃取柱分离：将步骤（1）所得上清液全部转移入固相萃取柱，再用正己烷-乙酸乙酯混合溶液进行淋洗，之后依次加入乙酸乙酯、乙腈进行洗脱，分别收集乙酸乙酯和乙腈的洗脱液并合并所有洗脱液，将其旋转蒸干，再在所得残留物中加入少量正己烷-正丁基氯-乙腈混合溶液，涡旋使残留物溶解后，所得溶液经微孔滤膜过滤后用于HPLC定性测定；
步骤（1）中所述低温静置的温度为-50~-5℃，时间为20-40min。
2.根据权利要求1所述的他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其特征在于，步骤（1）中所用他克莫司软膏与正己烷-丙酮混合溶液的质量体积比为1g:5mL；
所述正己烷-丙酮混合溶液中正己烷与丙酮的体积比为5:1-15:1。
3.根据权利要求1所述的他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其特征在于，步骤（2）所用正己烷-乙酸乙酯混合溶液与上清液的体积比为3:1；
所述正己烷-乙酸乙酯混合溶液中正己烷与乙酸乙酯的体积比为1:1-10:1。
4.根据权利要求1所述的他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其特征在于，步骤（2）中用于洗脱的乙酸乙酯及乙腈与上清液的体积比均为1:2。
5.根据权利要求1所述的他克莫司软膏有关物质测定的前处理方法，其特征在于，步骤（2）所述正己烷-正丁基氯-乙腈混合溶液中正己烷、正丁基氯与乙腈的体积比为1:1:1。
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