CN114428133B - 一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质xv含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,经过对高效液相色谱分析中的色谱柱、流动相等条件进行筛选,选用合适的缓冲溶液体系,采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料,以6mM磷酸的水溶液为溶液A,以乙腈‑叔丁基甲基醚(81:19)为溶液B,柱温为60℃;流速为1.8ml/min;检测波长为220nm;进样体积为50μl;按下表进行梯度洗脱,快速准确地实现了他克莫司软膏中杂质XV(OD‑1)含量的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种杂质含量的检测方法,特别涉及一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus),是从链霉菌属中分离出的发酵产物,是一种大环内酯类抗生素,为一种强力的新型免疫抑制剂,主要通过抑制白介素-2(IL-2)的释放,全面抑制T淋巴细胞的作用,较环孢素(CsA)强100倍。他克莫司软膏适用于非免疫受损的因潜在危险而不宜使用传统疗法、或对传统疗法反应不充分、或无法耐受传统疗法的中到重度特应性皮炎患者,作为短期或间歇性长期治疗。0.03%和0.1%浓度的本品均可用于成人,但只有0.03%浓度的本品可用于2岁及以上的儿童。他克莫司,英文名称为tacrolimus;化学名称为[3S-[3R[E(1S,3S,4S)],4S,5R,8S,9E,12R,14R,15S,16R,18S,19S,26aR]]-5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-十六氢-5,19-二羟基-3-[2-(4-羟基-3-甲氧基环已基)-1-甲基乙烯基]-14,16-二甲氧基-4,10,12,18-四甲基-8-(2-丙烯基)-15,19-环氧-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧杂氮杂环二十三碳烷-1,7,20,21(4H,23H)-四酮一水合物;分子式为C44H69NO12·H2O;CAS号为109581-93-3,化学结构式如下:
目前他克莫司软膏在国内、外均上市;他克莫司软膏未国内外药典收录,有进口注册标准,但没有一种反相色谱法准确检测杂质XV(OD-1)的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,可以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,包括如下步骤:
步骤1:精密称定杂质XV对照品约15mg,置100ml量瓶中,加入适量乙腈使完全溶解并稀释至刻度摇匀,作为对照品贮备液;移取此溶液1ml至10ml量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀作为对照品溶液;
步骤2:称取本品约2.0g,置一具塞离心管中;向离心管中加入5ml的正己烷-乙酸乙酯混合溶液,置振荡器上剧烈振摇直至混悬完全;以3000转/分钟的速度离心15分钟;将上清液小心转移至一预处理过的固相萃取柱中;转移时注意不要使沉淀悬浮;平行操作4次;弃去沉淀;用正己烷-乙酸乙酯混合溶液洗涤吸附上清液的固相萃取柱至少6次,每次5ml,每一次加入的冲洗液冲洗完全后,方可再进行下一次冲洗,最后一次洗涤后需将固相萃取柱流出口残留基质冲洗干净;
步骤3:将固相萃取柱置一50ml棕色梨形瓶顶端,吸取乙酸乙酯5.0ml,加入固相萃取柱中,待乙酸乙酯洗脱完后,再加入乙腈5.0ml洗脱,用棕色梨形瓶收集洗脱液(说明:此步骤的目的是用乙酸乙酯和乙腈将保留在固相萃取柱中的他克莫司及其相关物质洗脱下来,并收集洗脱液);
步骤4:将收集到的洗脱液旋转蒸发,得油状残余物;向蒸发后得到的残余物中加入1.0ml乙腈,涡旋使残余物溶解为供试品溶液;
步骤5:精密量取供试品溶液和对照溶液各50μl,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,高效液相色谱仪条件。
进一步地,步骤2中离心管进行预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干。
进一步地,步骤2中的固相萃取柱采用氰基键合硅胶为填充剂Sepax UCT StrataCN,500mg/6ml;或与之等效相当的固相萃取柱。
进一步地,每一份样品使用一个固相萃取柱,固相萃取柱先用5ml乙腈润洗,再用5ml乙酸乙酯润洗,再用正己烷-乙酸乙酯的混合溶液冲洗两次,每次5ml。
进一步地,步骤2中正己烷-乙酸乙酯=10:1。
进一步地,步骤2经过这些处理步骤,通过固相萃取柱将他克莫司软膏中的基质逐步洗脱除去,而将他克莫司及其相关物质保留在固相萃取柱中。
进一步地,步骤3中的梨形瓶预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干。
进一步地,步骤4中的洗脱液旋转蒸发用的水浴温度小于40℃,并抽真空。
进一步地,高效液相色谱仪条件:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,150*4.6mm,3μm;
柱温:30℃;
检测波长:240nm;
流速:1.5ml/min;
流动相:以6mM磷酸的水溶液为溶液A,以乙腈-叔丁基甲基醚(81:19)为溶液B,以溶液A-溶液B(4:1)为溶液C,以溶液A-溶液B(1:4)为溶液D。按以下梯度洗脱表:
表1:梯度洗脱
(3)精密量取对照品溶液50μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按杂质XV(OD-1)峰计,理论塔板数应不小于3000,拖尾因子不大于2.0。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明人经过对高效液相色谱分析中的色谱柱、流动相等条件进行筛选,选用合适的缓冲溶液体系,在流动性的比例调节上,保证稀释剂和辅料不干扰样品中杂质XV(OD-1)的检测,保证杂质XV(OD-1)的理论塔板数和拖尾因子符合要求,最终建立了反相梯度洗脱的HPLC分析方法,实现了对他克莫司软膏中杂质XV(OD-1)含量的准确检测与控制。
附图说明
图1为本发明的对照品溶液图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV(OD-1)含量的方法。
照高效液相色谱法测定(中国药典2020年版通则0512)。
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(150*4.6mm,3μm);以6mM磷酸的水溶液为溶液A,以乙腈-叔丁基甲基醚(81:19)为溶液B,以溶液A-溶液B(4:1)为溶液C,以溶液A-溶液B(1:4)为溶液D,柱温为60℃;流速为1.8ml/min;检测波长为220nm。精密称定杂质XV(OD-1)对照品约15mg,置100ml量瓶中,加入适量乙腈使完全溶解并稀释至刻度摇匀,作为对照品贮备液;移取此溶液1ml至10ml量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀作为对照品溶液;精密量取50μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按杂质XV(OD-1)峰计,理论塔板数应不小于3000,拖尾因子不大于2.0。
测定法:称取本品约2.0g,置一具塞离心管(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)中;向离心管中加入5ml的正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液,置振荡器上剧烈振摇直至混悬完全;以3000转/分钟的速度离心15分钟;将上清液小心转移至一预处理过的固相萃取柱[用氰基键合硅胶为填充剂(Sepax UCT Strata CN,500mg/6ml;或与之等效相当的固相萃取柱);每一份样品使用一个固相萃取柱,固相萃取柱先用5ml乙腈润洗,再用5ml乙酸乙酯润洗,再用正己烷-乙酸乙酯(10:1)的混合溶液冲洗两次,每次5ml]中,转移时注意不要使沉淀悬浮;平行操作4次;弃去沉淀;用正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液洗涤吸附上清液的固相萃取柱至少6次,每次5ml,每一次加入的冲洗液冲洗完全后,方可再进行下一次冲洗,最后一次洗涤后需将固相萃取柱流出口残留基质冲洗干净(说明:经过这些处理步骤,通过固相萃取柱将他克莫司软膏中的基质逐步洗脱除去,而将他克莫司及其相关物质保留在固相萃取柱中)。将固相萃取柱置一50ml棕色梨形瓶(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)顶端,吸取乙酸乙酯5.0ml,加入固相萃取柱中,待乙酸乙酯洗脱完后,再加入乙腈5.0ml洗脱,用棕色梨形瓶收集洗脱液(说明:此步骤的目的是用乙酸乙酯和乙腈将保留在固相萃取柱中的他克莫司及其相关物质洗脱下来,并收集洗脱液)。将收集到的洗脱液旋转蒸发(水浴温度小于40℃,并抽真空),得油状残余物;向蒸发后得到的残余物中加入1.0ml乙腈,涡旋使残余物溶解为供试品溶液;精密量取供试品溶液和对照溶液各50μl,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图(如图1)。按外标法计算,杂质XV(OD-1)含量应不大于2.5%。
1、系统适用性试验
精密称杂质XV(OD-1)对照品约15mg,置100ml量瓶中,加入适量乙腈使完全溶解并稀释至刻度摇匀,作为对照品贮备液;移取此溶液1ml至10ml量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀作为对照品溶液。精密量取20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按杂质XV(OD-1)峰计,理论塔板数应不小于3000,拖尾因子不大于2.0。
2、专属性试验
精密称杂质XV(OD-1)对照品约15mg,置100ml量瓶中,加入适量乙腈使完全溶解并稀释至刻度摇匀,作为对照品贮备液;移取此溶液1ml至10ml量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀作为对照品溶液;称取本品约2.0g,置一具塞离心管(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)中;向离心管中加入5ml的正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液,置振荡器上剧烈振摇直至混悬完全;以3000转/分钟的速度离心15分钟;将上清液小心转移至一预处理过的固相萃取柱[用氰基键合硅胶为填充剂(Sepax UCT Strata CN,500mg/6ml;或与之等效相当的固相萃取柱);每一份样品使用一个固相萃取柱,固相萃取柱先用5ml乙腈润洗,再用5ml乙酸乙酯润洗,再用正己烷-乙酸乙酯(10:1)的混合溶液冲洗两次,每次5ml]中,转移时注意不要使沉淀悬浮;平行操作4次;弃去沉淀;用正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液洗涤吸附上清液的固相萃取柱至少6次,每次5ml,每一次加入的冲洗液冲洗完全后,方可再进行下一次冲洗,最后一次洗涤后需将固相萃取柱流出口残留基质冲洗干净(说明:经过这些处理步骤,通过固相萃取柱将他克莫司软膏中的基质逐步洗脱除去,而将他克莫司及其相关物质保留在固相萃取柱中)。将固相萃取柱置一50ml棕色梨形瓶(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)顶端,吸取乙酸乙酯5.0ml,加入固相萃取柱中,待乙酸乙酯洗脱完后,再加入乙腈5.0ml洗脱,用棕色梨形瓶收集洗脱液(说明:此步骤的目的是用乙酸乙酯和乙腈将保留在固相萃取柱中的他克莫司及其相关物质洗脱下来,并收集洗脱液)。将收集到的洗脱液旋转蒸发(水浴温度小于40℃,并抽真空),得油状残余物;向蒸发后得到的残余物中加入1.0ml乙腈,涡旋使残余物溶解为供试品溶液;称取空白辅料2.0g,其余同供试品溶液,作为空白辅料溶液。试验结果如下表2:
表2:专属性试验
3、线性回归
精密称杂质XV(OD-1)对照品约15mg,置100ml量瓶中,加入适量乙腈使完全溶解并稀释至刻度摇匀,作为线性贮备液;分别移取线性贮备液1.5ml、1.0ml、0.8ml、0.5ml、0.3ml置10ml量瓶中,用内标液稀释至刻度,摇匀,作为150%、120%、100%、80%、50%的线性溶液。试验结果如下表3:
表3:线性回归试验
试验结果表明,杂质XV(OD-1)在4.2771μg/ml~21.3853μg/ml的范围内,杂质XV(OD-1)峰面积与浓度呈良好的线性关系,线性方程为y=1.2068x-0.007,线性相关系数R为0.999,结果符合要求。
4、回收率
精密称杂质XV(OD-1)对照品约15mg,置100ml量瓶中,加入适量乙腈使完全溶解并稀释至刻度摇匀,作为回收率贮备液;移取此溶液1ml至10ml量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀作为对照品溶液。
50%供试品溶液:称取本品约2.0g,移取杂质XV(OD-1)对照品溶液0.5ml,置一具塞离心管(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)中;向离心管中加入5ml的正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液,置振荡器上剧烈振摇直至混悬完全;以3000转/分钟的速度离心15分钟;将上清液小心转移至一预处理过的固相萃取柱[用氰基键合硅胶为填充剂(Sepax UCTStrata CN,500mg/6ml;或与之等效相当的固相萃取柱);每一份样品使用一个固相萃取柱,固相萃取柱先用5ml乙腈润洗,再用5ml乙酸乙酯润洗,再用正己烷-乙酸乙酯(10:1)的混合溶液冲洗两次,每次5ml]中,转移时注意不要使沉淀悬浮;平行操作4次;弃去沉淀;用正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液洗涤吸附上清液的固相萃取柱至少6次,每次5ml,每一次加入的冲洗液冲洗完全后,方可再进行下一次冲洗,最后一次洗涤后需将固相萃取柱流出口残留基质冲洗干净(说明:经过这些处理步骤,通过固相萃取柱将他克莫司软膏中的基质逐步洗脱除去,而将他克莫司及其相关物质保留在固相萃取柱中)。将固相萃取柱置一50ml棕色梨形瓶(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)顶端,吸取乙酸乙酯5.0ml,加入固相萃取柱中,待乙酸乙酯洗脱完后,再加入乙腈5.0ml洗脱,用棕色梨形瓶收集洗脱液(说明:此步骤的目的是用乙酸乙酯和乙腈将保留在固相萃取柱中的他克莫司及其相关物质洗脱下来,并收集洗脱液)。将收集到的洗脱液旋转蒸发(水浴温度小于40℃,并抽真空),得油状残余物;向蒸发后得到的残余物中加入1.0ml乙腈,涡旋使残余物溶解。平行配制三份。
100%供试品溶液:称取本品约2.0g,移取杂质XV(OD-1)对照品溶液1.0ml,置一具塞离心管(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)中;向离心管中加入5ml的正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液,置振荡器上剧烈振摇直至混悬完全;以3000转/分钟的速度离心15分钟;将上清液小心转移至一预处理过的固相萃取柱[用氰基键合硅胶为填充剂(Sepax UCTStrata CN,500mg/6ml;或与之等效相当的固相萃取柱);每一份样品使用一个固相萃取柱,固相萃取柱先用5ml乙腈润洗,再用5ml乙酸乙酯润洗,再用正己烷-乙酸乙酯(10:1)的混合溶液冲洗两次,每次5ml]中,转移时注意不要使沉淀悬浮;平行操作4次;弃去沉淀;用正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液洗涤吸附上清液的固相萃取柱至少6次,每次5ml,每一次加入的冲洗液冲洗完全后,方可再进行下一次冲洗,最后一次洗涤后需将固相萃取柱流出口残留基质冲洗干净(说明:经过这些处理步骤,通过固相萃取柱将他克莫司软膏中的基质逐步洗脱除去,而将他克莫司及其相关物质保留在固相萃取柱中)。将固相萃取柱置一50ml棕色梨形瓶(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)顶端,吸取乙酸乙酯5.0ml,加入固相萃取柱中,待乙酸乙酯洗脱完后,再加入乙腈5.0ml洗脱,用棕色梨形瓶收集洗脱液(说明:此步骤的目的是用乙酸乙酯和乙腈将保留在固相萃取柱中的他克莫司及其相关物质洗脱下来,并收集洗脱液)。将收集到的洗脱液旋转蒸发(水浴温度小于40℃,并抽真空),得油状残余物;向蒸发后得到的残余物中加入1.0ml乙腈,涡旋使残余物溶解。平行配制三份。
150%供试品溶液:称取本品约2.0g,移取杂质XV(OD-1)对照品溶液1.5ml,置一具塞离心管(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)中;向离心管中加入5ml的正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液,置振荡器上剧烈振摇直至混悬完全;以3000转/分钟的速度离心15分钟;将上清液小心转移至一预处理过的固相萃取柱[用氰基键合硅胶为填充剂(Sepax UCTStrata CN,500mg/6ml;或与之等效相当的固相萃取柱);每一份样品使用一个固相萃取柱,固相萃取柱先用5ml乙腈润洗,再用5ml乙酸乙酯润洗,再用正己烷-乙酸乙酯(10:1)的混合溶液冲洗两次,每次5ml]中,转移时注意不要使沉淀悬浮;平行操作4次;弃去沉淀;用正己烷-乙酸乙酯(10:1)混合溶液洗涤吸附上清液的固相萃取柱至少6次,每次5ml,每一次加入的冲洗液冲洗完全后,方可再进行下一次冲洗,最后一次洗涤后需将固相萃取柱流出口残留基质冲洗干净(说明:经过这些处理步骤,通过固相萃取柱将他克莫司软膏中的基质逐步洗脱除去,而将他克莫司及其相关物质保留在固相萃取柱中)。将固相萃取柱置一50ml棕色梨形瓶(预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干)顶端,吸取乙酸乙酯5.0ml,加入固相萃取柱中,待乙酸乙酯洗脱完后,再加入乙腈5.0ml洗脱,用棕色梨形瓶收集洗脱液(说明:此步骤的目的是用乙酸乙酯和乙腈将保留在固相萃取柱中的他克莫司及其相关物质洗脱下来,并收集洗脱液)。将收集到的洗脱液旋转蒸发(水浴温度小于40℃,并抽真空),得油状残余物;向蒸发后得到的残余物中加入1.0ml乙腈,涡旋使残余物溶解。平行配制三份。试验结果如下表4:
表4:回收率试验
试验结果表明:本方法的回收率试验结果符合药典规定。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:精密称定杂质XV对照品约15mg,置100ml量瓶中,加入适量乙腈使完全溶解并稀释至刻度摇匀,作为对照品贮备液;移取此溶液1ml至10ml量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀作为对照品溶液;
步骤2:称取本品约2.0g,置一具塞离心管中;向离心管中加入5ml 的正己烷-乙酸乙酯混合溶液,置振荡器上剧烈振摇直至混悬完全;以3000转/分钟的速度离心15分钟;将上清液小心转移至一预处理过的固相萃取柱中;转移时注意不要使沉淀悬浮;平行操作4次;弃去沉淀;用正己烷-乙酸乙酯混合溶液洗涤吸附上清液的固相萃取柱至少6次,每次5ml,每一次加入的冲洗液冲洗完全后,方可再进行下一次冲洗,最后一次洗涤后需将固相萃取柱流出口残留基质冲洗干净;步骤2中的固相萃取柱采用氰基键合硅胶为填充剂Sepax UCTStrata CN,500mg/6ml;每一份样品使用一个固相萃取柱,固相萃取柱先用5ml乙腈润洗,再用5ml乙酸乙酯润洗,再用正己烷-乙酸乙酯的混合溶液冲洗两次,每次5ml;
步骤3:将固相萃取柱置一50ml棕色梨形瓶顶端,吸取乙酸乙酯5.0ml,加入固相萃取柱中,待乙酸乙酯洗脱完后,再加入乙腈5.0ml洗脱,用棕色梨形瓶收集洗脱液;
步骤4:将收集到的洗脱液旋转蒸发,得油状残余物;向蒸发后得到的残余物中加入1.0ml 乙腈,涡旋使残余物溶解为供试品溶液;
步骤5:精密量取供试品溶液和对照溶液各50μl,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,高效液相色谱仪条件为:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,150*4.6mm,3μm;
柱温:30℃;
检测波长:240nm;
流速:1.5ml/min;
流动相:以6mM磷酸的水溶液为溶液A,以乙腈-叔丁基甲基醚81:19为溶液B,按以下梯度洗脱表:
2.如权利要求1所述的一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,其特征在于,步骤2中离心管进行预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干。
3.如权利要求1所述的一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,其特征在于,步骤2中正己烷-乙酸乙酯=10: 1。
4.如权利要求1所述的一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,其特征在于,步骤2经过这些处理步骤,通过固相萃取柱将他克莫司软膏中的基质逐步洗脱除去,而将他克莫司及其相关物质保留在固相萃取柱中。
5.如权利要求1所述的一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,其特征在于,步骤3中的梨形瓶预处理:用甲醇润洗两次,每次5ml,烘干。
6.如权利要求1所述的一种用反相色谱法检测他克莫司软膏中杂质XV含量的方法,其特征在于,步骤4中的洗脱液旋转蒸发用的水浴温度小于40℃,并抽真空。
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