CN114369170A - 基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白、疫苗及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白、疫苗及其制备方法与用途，由外源蛋白和多效生长因子融合形成的融合蛋白TRX‑PTN；利用此融合蛋白TRX‑PTN，打破机体免疫耐受，产生抗多效生长因子的抗体，启动免疫反应，中和肿瘤中的多效生长因子。使得肿瘤生长得到抑制，同时可以促使肿瘤血管正常化，提高药物递送效率，降低副作用。

Description

基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋 白、疫苗及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于多效生长因子的神经胶质母 细胞瘤治疗性疫苗及其制备方法与用途。
背景技术
多效生长因子(Pleiotrophin，PTN)是分泌性肝素结合细胞因子，由136 个氨基酸组成。PTN基因在小鼠发育的神经系统中有大量表达，在出生前后达 到高峰，之后逐渐降低。在成体中几乎检测不到PTN的表达。但是，PTN在乳 腺癌，肺癌，黑色素瘤，胰腺癌，前列腺癌等多种肿瘤中高表达。PTN可以通 过诱导肿瘤血管生成或改变肿瘤微环境而间接促进肿瘤生长，也可以通过诱导 肿瘤细胞分裂或引发细胞上皮间叶转换(EMT)而直接促进肿瘤的生长与浸润。 发明人此前研究表明，PTN在神经胶质瘤中异常高表达，其表达量与病人整体 生存率成负相关。使用慢病毒在GL261小鼠神经胶质瘤细胞中过表达PTN，发 现PTN可以显著促进肿瘤生长，诱导肿瘤血管异常化。使用小干扰RNA下调 PTN表达，则可以显著抑制原位CT2A神经胶质母细胞瘤生长。与此同时，与 世界知名神经胶质瘤专家Eric Holland教授团队合作，发明人发现在RCAS-Tva 小鼠胶质瘤模型中，PTN通过促进神经胶质瘤干细胞(Glioma stem cell)的细 胞分裂，显著增加肿瘤发生概率。PTN在正常组织中不表达，而在肿瘤组织中 表达，并且PTN可以从多方面促进神经胶质母细胞瘤生长，因此，PTN作为靶 点治疗神经胶质母细胞瘤将大大增加特异性，降低副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗 性融合蛋白、疫苗及其制备方法与用途。
本发明的技术方案是提供一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤 治疗性融合蛋白，其特殊之处在于：由外源蛋白和多效生长因子融合形成的融 合蛋白TRX-PTN；利用此融合蛋白TRX-PTN，打破机体免疫耐受，产生抗多 效生长因子(Pleiotrophin，PTN)的抗体。
进一步地，上述外源蛋白为来自于大肠杆菌的TRX：Bacterial thioredoxin。
进一步地，融合蛋白由pET21a原核载体表达系统表达，利用融合蛋白C端 的His标签进行镍柱纯化。
进一步地，融合蛋白TRX-PTN的氨基酸序列如下：
Figure BDA0003401803870000021
本发明还提供一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性疫苗， 其特殊之处在于：含有上述基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性 融合蛋白，将该疫苗简称为融合蛋白TRX-PTN疫苗。
本发明还提供一种基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白 或疫苗在制备治疗神经胶质母细胞瘤产品方面的应用。
进一步地，基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白或疫苗 在制备促进神经胶质母细胞瘤血管正常化产品中的应用。
进一步地，基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白或疫苗 在制备减低神经胶质母细胞瘤肿瘤血管密度产品中的应用。
进一步地，基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白或疫苗 在制备抑制神经胶质母细胞瘤血管生成产品中的应用。
本发明还提供一种基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白 或疫苗与替莫唑胺联用在制备治疗神经胶质母细胞瘤产品方面的应用。
本发明还提供一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合 蛋白的制备方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1、重组表达载体的制备；
步骤1.1、合成融合蛋白TRX-PTN基因序列；
步骤1.2、制备重组表达载体pET21a-TRX-PTN；
步骤2、制备重组菌pET21a-TRX-PTN/Rosseta；
将步骤1制备的pET21a-TRX-PTN重组载体导入大肠杆菌Rosseta(DE3) 中，得到重组菌pET21a-TRX-PTN/Rosseta；
步骤3、制备融合蛋白TRX-PTN；
步骤3.1、通过培养得到pET21a-TRX-PTN/Rosseta菌体；
步骤3.2、将pET21a-TRX-PTN/Rosseta菌体超声裂解得到融合蛋白 TRX-PTN的上清液；
步骤3.3、将融合蛋白TRX-PTN的上清液利用镍柱纯化，后处理得到融合 蛋白TRX-PTN。
本发明还提供一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性疫苗 的制备方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1、利用上述方法制备基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗 性融合蛋白；
步骤2、制备疫苗制剂；
以Montanide ISA720为溶剂，每毫升溶剂加入1mg融合蛋白。
本发明的有益效果是：本发明以融合蛋白TRX-PTN作为靶向多效生长因子 的胶质母细胞瘤治疗性疫苗，可以诱导机体产生大量特异性抗多效生长因子抗 体，启动免疫反应，中和肿瘤中的多效生长因子。使得肿瘤生长得到抑制，同 时可以促使肿瘤血管正常化，提高药物递送效率，降低副作用。
附图说明
图1为纯化后的融合蛋白TRX-PTN的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2为本发明融合蛋白TRX-PTN的免疫策略示意图。
图3为本发明利用融合蛋白TRX-PTN疫苗诱导机体产生抗多效生长因子抗 体示意图；其中a为注射后21天，小鼠血清中抗多效生长因子抗体浓度与持续 时间。其中b为注射后3个月后，小鼠血清中抗多效生长因子抗体浓度与持续 时间。
图4为本发明融合蛋白TRX-PTN疫苗显著延长GL261与CT2A荷瘤小鼠 的中位生存期示意图；其中A为GL261模型荷瘤小鼠的中位生存期，B为CT2A 模型荷瘤小鼠的中位生存期。
图5为本发明对融合蛋白TRX-PTN疫苗治疗后的肿瘤进行CD31免疫荧光 染色分析结果示意图；其中A为GL261肿瘤切片上CD31的免疫荧光染色，B 为GL261肿瘤切片上CD31的定量结果，C为GL261肿瘤切片上内源性IgG 的免疫荧光染色，D为GL261肿瘤切片上内源性IgG的定量结果，E为CD31 和灌注凝集素在肿瘤切片上的染色，F为CD31和灌注凝集素在肿瘤切片上的 定量结果。
图6为本发明融合蛋白TRX-PTN疫苗与替莫唑胺的协同抗肿瘤作用示意图； 其中A为GL261模型荷瘤小鼠的中位生存期；B为CT2A模型荷瘤小鼠的中位 生存期。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书 附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的 一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员 在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的 保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明 还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不 违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例 的限制。
实施例1
本发明所提供的基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋 白是由外源蛋白(大肠杆菌硫氧还原蛋白；thioredoxin，TRX)和内源蛋白(人 类多效生长因子；pleiotrophin，PTN)组成的融合蛋白TRX-PTN。利用此融合 蛋白，打破机体免疫耐受，产生抗多效生长因子(Pleiotrophin，PTN)的抗体。
融合蛋白TRX-PTN的氨基酸序列如下：
Figure BDA0003401803870000051
其中第1-114位为大肠杆菌硫氧还原蛋白的氨基酸序列，第115-233位为人类 多效生长因子蛋白的氨基酸序列。
通过下述过程制备基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性疫苗：
1.重组表达载体的制备
首先，我们合成了融合蛋白TRX-PTN基因的序列(如下所示)：
atgttacaccaacaacgaaaccaacacgccaggcttattcctgtggagttatatatgagc60
gataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggg120
gcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgatt180
ctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgat240
caaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttc300
aaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtcagtggatactgctgaagca360
gggaagaaagagaaaccagaaaaaaaagtgaagaagtctgactgtggagaatggcagtgg420
agtgtgtgtgtgcccaccagtggagactgtgggctgggcacacgggagggcactcggact480
ggagctgggtgcaagcaaaccatgaagacccagagatgtaagatcccctgcaactggaag540
aagcaatttggcgcggagtgcaaataccagttccaggcctggggagaatgtgacctgaac600
acagccctgaagaccagaactggaagtctgaagcgagccctgcacaatgccgaatgccag660
aagactgtcaccatctccaagccctgtggcaaactgacccaccaccaccaccaccac717
然后，将pET21a载体多克隆位点的EcoRI识别序列(GAATTC)和BamHI 识别序列(GGATCC)间的小片段替换为融合蛋白TRX-PTN基因，并插入到 pET21a原核表达质粒上。将该重组载体命名为pET21a-TRX-PTN。
2.重组菌的制备
将步骤1制备的pET21a-TRX-PTN重组载体导入大肠杆菌Rosseta(DE3) (百奥莱博产品，货号为BTN12-141y)中，得到重组菌，并将重组菌命名为 pET21a-TRX-PTN/Rosseta。
3.融合蛋白TRX-PTN的制备
将步骤2制备的pET21a-TRX-PTN/Rosseta重组菌接种至LB液体培养基中， 37℃培养18个小时，得到pET21a-TRX-PTN/Rosseta培养液；取2ml该培养液， 转接至500ml的LB液体培养基中培养，培养至OD值为0.9±0.1时加入异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(IPTG浓度为1μM)，在37℃下诱导培养6小时， 得到pET21a-TRX-PTN/Rosseta诱导液。将pET21a-TRX-PTN/Rosseta诱导液在 低温离心机中进行离心(8000rpm；4℃)。弃掉上清液，得到pET21a-TRX-PTN/Rosseta菌体。用50ml预冷的缓冲液(50mmol/L Tris-HCl， 1mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl)重悬pET21a-TRX-PTN/Rosseta菌体后进行 超声裂解(功率90W，超声5S，工作5S，共计12分钟)，得到含有融合蛋白 TRX-PTN的上清液。
将含有融合蛋白TRX-PTN的上清液利用镍柱进行纯化，得到融合蛋白 TRX-PTN(98％以上纯度)收集在PBS中，得到融合蛋白TRX-PTN溶液(浓 度：500ug/ml)，将纯化的融合蛋白TRX-PTN溶液置于冷冻干燥机，抽真空得 其干粉。
4、制备疫苗制剂(1mg/ml融合蛋白TRX-PTN，溶剂：Montanide ISA720)。 以下将疫苗制剂简称为融合蛋白TRX-PTN疫苗。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测融合蛋白TRX-PTN溶液中的目的蛋白，结果 显示融合蛋白TRX-PTN溶液中含有预期蛋白大小相符的高纯度融合蛋白 TRX-PTN(图1)。
实施例2
本实施例利用融合蛋白TRX-PTN诱导机体产生抗多效生长因子抗体。
如图2所示，将本发明将融合蛋白TRX-PTN注入到动物体内，抗原提呈细胞 内吞融合蛋白TRX-PTN，并在MHC2上展示自体(self-peptides，PTN)和异体 (non-self-peptides，TRX)的多肽段。辅助性T细胞以T细胞受体(T-cell receptor) 识别递呈的异体(non-self-peptides)多肽段并被激活。而自体多肽段(self-peptides) 不会被T细胞识别，因为自身应答T细胞(self-reactive T cells)在发育过程中已 经被清除。但是，通常有少量的自身应答的B细胞存在于体内，通过其B细胞受 体(B-cell receptor)识别融合蛋白的自体组分(self-part)。识别后，B细胞受体 融合蛋白复合物被B细胞内吞并降解为多肽段，自体和异体多肽段都会被通过 MHC2递呈在B细胞表面。之前被异体多肽段激活的辅助性T细胞此时会识别B细 胞表面递呈的相同的异体多肽段，并且帮助激活自身应答的B细胞。被激活的B细胞，经过克隆扩增，产生大量的自身反应抗体。
在实验实施过程中，我们首先用Montanide ISA720乳剂重悬融合蛋白 TRX-PTN(最终浓度：1mg/ml)，混匀后注射到到小鼠腹股沟(100μl/只)，7和14 天后，在相反的腹股沟再分别加强免疫(Booster injections)两次。21天后和3 个月后，小鼠尾部少量取血2次，分离血清并将血清应用于涂过多效生长因子蛋 白的96孔ELISA板，利用酶联吸附反应(ELISA)测量血清中抗多效生长因子抗 体浓度与持续时间。如图3所示，结果显示，经过加强免疫后，融合蛋白TRX-PTN 可以诱导抗多效生长因子抗体的大量生成，且抗体浓度至少保持3个月。
实施例3
本实施例验证融合蛋白TRX-PTN疫苗在体内对抗胶质母细胞瘤的抑制作用。
利用立体定位技术将肿瘤细胞(CT-2A或GL261)原位注射到8周大的雌 性的C57BL/6小鼠大脑中。注射肿瘤7天后，将小鼠随机分为疫苗组和对照组。 疫苗组将接受融合蛋白TRX-PTN(融合蛋白TRX-PTN重悬于Montanide ISA720 中，浓度：1mg/ml，每次治疗腹股沟注射100μl)治疗，对照组将接受安慰剂(仅 Montanide ISA720乳剂)治疗。14天和21天后，分别接受两次加强免疫。肿瘤 细胞注射24天后终止实验。取出小鼠大脑，制备冰冻切片，进行免疫荧光染色。 在安乐死小鼠之前，利用FITC标记的凝集素(Lectin)心脏灌注，观测疫苗对 血管功能(Vascular perfusion)的影响。利用CD31抗体和CD133抗体染色，分 别检测疫苗对肿瘤血管和肿瘤干细胞的影响。利用磷酸化组蛋白-H3抗体和 Cleaved-caspase 3抗体，分别检测疫苗对于肿瘤细胞分裂和凋亡的影响。利用 GLUT-1抗体和小鼠免疫球蛋白抗体(anti-Mouse IgG antibody)染色分别检测疫 苗对于肿瘤乏氧(Hypoxia)和肿瘤血管通透性(Vascular permeability)的影响。
与此同时，另外进行了整体生存(Survival study)实验，分析靶向融合蛋白 TRX-PTN疫苗对整体生存的影响，在整体生存实验中，小鼠将接受每7天注射 一次融合蛋白TRX-PTN疫苗，直至小鼠癌亡。
另外，为了分析融合蛋白TRX-PTN疫苗对于化疗药物替莫唑胺是否有协同 作用，我们利用立体定位技术将肿瘤细胞(CT-2A或GL261)原位注射到8周 大的雌性的C57BL/6小鼠大脑中。注射肿瘤7天后，将小鼠随机分为4组：对 照组，融合蛋白TRX-PTN疫苗组，替莫唑胺组和融合蛋白TRX-PTN疫苗联合 替莫唑胺组。融合蛋白TRX-PTN疫苗组接受每7天注射一次融合蛋白TRX-PTN 疫苗治疗(融合蛋白TRX-PTN重悬于Montanide ISA720中，浓度：1mg/ml， 每次治疗腹股沟注射100μl)。替莫唑胺组在肿瘤注射后第12天后连续接受5天 替莫唑胺治疗(每天1次，每次2mg/只)。融合蛋白TRX-PTN疫苗联合替莫唑 胺组接受每7天注射一次融合蛋白TRX-PTN疫苗治疗，并接受第12天后连续 接受5天替莫唑胺治疗(每天1次，每次2mg/只)，直到实验动物癌亡。
从图4中A可以看出，本发明融合蛋白TRX-PTN疫苗可以显著延长GL261 与CT2A荷瘤小鼠的生存期。在GL261模型中，对照组荷瘤小鼠的中位生存期 为28天，而融合蛋白TRX-PTN疫苗治疗组荷瘤小鼠的中位生存期为38天。从 图4中B可以看出，在CT2A模型中，对照组荷瘤小鼠的中位生存期为30天， 而融合蛋白TRX-PTN疫苗治疗组荷瘤小鼠的中位生存期达到了42天。
因为PTN有促进血管生成的作用，因此我们融合蛋白TRX-PTN疫苗治疗 后的肿瘤进行了CD31免疫荧光染色分析，结果显示，融合蛋白TRX-PTN疫苗 可以显著降低CD31阳性染色(图5A,5B)，说明融合蛋白TRX-PTN疫苗可以 显著减低肿瘤血管密度(VascularDensity)。与此同时，我们还评估了肿瘤血管 功能相关的指标：应用内源性IgG为指示物，检测发现融合蛋白TRX-PTN疫苗 不能够影响肿瘤血管的通透性(Vascular Permeability)(图5C，5D)，但是，在 应用Lectin为指示剂检测肿瘤血管灌注功能(Vascular Perfusion)中发现，融合 蛋白TRX-PTN疫苗可以促进肿瘤血管的灌注，因此，我们认为融合蛋白 TRX-PTN疫苗可以促进血管的正常化。
融合蛋白TRX-PTN疫苗联用替莫唑胺具有协同抗神经胶质母细胞瘤作用。 同单替莫唑胺治疗组或单融合蛋白TRX-PTN疫苗治疗组相比，融合蛋白 TRX-PTN疫苗治疗组可以显著延长GL261与CT2A荷瘤小鼠的中位生存期。 GL261模型荷瘤小鼠的中位生存期分别是：对照组：28天；融合蛋白TRX-PTN 疫苗治疗组：38天；替莫唑胺治疗组：39天；融合蛋白TRX-PTN疫苗+替莫唑 胺治疗组：55天(图6A)。在CT2A模型荷瘤小鼠的中位生存期分别是：对照组：30天；融合蛋白TRX-PTN疫苗治疗组：42天；替莫唑胺治疗组：48天； 融合蛋白TRX-PTN疫苗+替莫唑胺治疗组：61天(图6B)。
<110>一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白、疫苗及其制备方法与用途
<120>陕西师范大学
<210> 1
<211> 239
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Met Leu His Gln Gln Arg Asn Gln His Ala Arg Leu Ile Pro Val Glu Leu Tyr Met Ser Asp Lys
1 5 10 15 20
Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val
25 30 35 40
Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
45 50 55 60 65
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys
70 75 80 85
Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val
90 95 100 105 110
Gly Ala Leu Ser Val Asp Thr Ala Glu Ala Gly Lys Lys Glu Lys Pro Glu Lys Lys Val Lys Lys
115 120 125 130
Ser Asp Cys Gly Glu Trp Gln Trp Ser Val Cys Val Pro Thr Ser Gly Asp Cys Gly Leu Gly Thr
135 140 145 150
Arg Glu Gly Thr Arg Thr Gly Ala Gly Cys Lys Gln Thr Met Lys Thr Gln Arg Cys Lys Ile Pro
155 160 165 170 175
Cys Asn Trp Lys Lys Gln Phe Gly Ala Glu Cys Lys Tyr Gln Phe Gln Ala Trp Gly Glu Cys Asp
180 185 190 195
Leu Asn Thr Ala Leu Lys Thr Arg Thr Gly Ser Leu Lys Arg Ala Leu His Asn Ala Glu Cys Gln
200 205 210 215 220
Lys Thr Val Thr Ile Ser Lys Pro Cys Gly Lys Leu Thr His His His His His His
225 230 235
<210>2
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atgttacaccaacaacgaaaccaacacgccaggcttattcctgtggagttatatatgagc60
gataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggg120
gcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgatt180
ctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgat240
caaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttc300
aaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtcagtggatactgctgaagca360
gggaagaaagagaaaccagaaaaaaaagtgaagaagtctgactgtggagaatggcagtgg420
agtgtgtgtgtgcccaccagtggagactgtgggctgggcacacgggagggcactcggact480
ggagctgggtgcaagcaaaccatgaagacccagagatgtaagatcccctgcaactggaag540
aagcaatttggcgcggagtgcaaataccagttccaggcctggggagaatgtgacctgaac600
acagccctgaagaccagaactggaagtctgaagcgagccctgcacaatgccgaatgccag660
aagactgtcaccatctccaagccctgtggcaaactgacccaccaccaccaccaccac717

Claims (12)

1.一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白，其特征在于：由外源蛋白和多效生长因子融合形成。
2.根据权利要求1所述的基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白，其特征在于：所述外源蛋白为来自于大肠杆菌的TRX：Bacterialthioredoxin。
3.根据权利要求2所述的基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白，其特征在于：由pET21a原核载体表达系统表达，利用融合蛋白C端的His标签进行镍柱纯化。
4.根据权利要求3所述的基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如下：
Figure FDA0003401803860000011
5.一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性疫苗，其特征在于：含有上述基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白。
6.一种基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白或疫苗在制备治疗神经胶质母细胞瘤产品方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白或疫苗在制备促进神经胶质母细胞瘤血管正常化产品中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白或疫苗在制备减低神经胶质母细胞瘤肿瘤血管密度产品中的应用。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白或疫苗在制备抑制神经胶质母细胞瘤血管生成产品中的应用。
10.一种基于多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白或疫苗与替莫唑胺联用在制备治疗神经胶质母细胞瘤产品方面的应用。
11.一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、重组表达载体的制备；
步骤1.1、合成融合蛋白TRX-PTN基因序列；
步骤1.2、制备重组表达载体pET21a-TRX-PTN；
步骤2、制备重组菌pET21a-TRX-PTN/Rosseta；
将步骤1制备的pET21a-TRX-PTN重组载体导入大肠杆菌Rosseta(DE3)中，得到重组菌pET21a-TRX-PTN/Rosseta；
步骤3、制备融合蛋白TRX-PTN；
步骤3.1、通过培养得到pET21a-TRX-PTN/Rosseta菌体；
步骤3.2、将pET21a-TRX-PTN/Rosseta菌体超声裂解得到融合蛋白TRX-PTN的上清液；
步骤3.3、将融合蛋白TRX-PTN的上清液利用镍柱纯化，后处理得到融合蛋白TRX-PTN。
12.一种基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、利用权利要求11所述的方法制备基于靶向多效生长因子的神经胶质母细胞瘤治疗性融合蛋白；
步骤2、制备疫苗制剂；
以Montanide ISA720为溶剂，每毫升溶剂加入1mg融合蛋白。
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