CN114354825A - 一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法，首先，称取诺氟沙星胶囊内颗粒，用0.1mol/L盐酸溶解稀释，配制成含诺氟沙星浓度为0.3～0.5mg/ml的溶液，为检测样液，然后采用高效液相色谱法进行分析；以十六烷基酰胺基硅烷键合硅胶为色谱柱填料；选用甲醇和乙腈的混合溶液为有机溶剂，甲醇和乙腈比例为2:1～4:1；选用浓度为0.01～0.02mol/L的醋酸铵高氯酸钠水溶液为缓冲溶液，并用磷酸调节缓冲溶液pH值至2.0～4.0；采用梯度洗脱。本发明的诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法，对杂质的检测能力高，各杂质间分离度更好，更能保证患者用药的安全性。

Description

一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体的说涉及一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法。

背景技术

相关物质与药品质量、安全性及疗效密切相关，相关物质的存在可能会降低药物的疗效，甚至引起毒副作用，因此，必须通过适当的检测分析方法控制药物中杂质的种类和含量，确保药品质量。

诺氟沙星是喹诺酮类抗菌药，化学名称：1-乙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧代7-(1- 哌嗪基)-3-喹啉羧酸

诺氟沙星中相关物质检测方法主要可参考中国药典2020版标准及欧洲药典 10.0标准。在对药典方法进行重现时，诺氟沙星的EP杂质E与主成分分离度较差，完全无法形成分离，色谱图见图1。实验结果与台州市药检所李俊发表的文章《中国药典2015年版中诺氟沙星胶囊相关物质测定方法的改进研究》中观点一致。在对欧洲药典相关物质进行重现时，虽然杂质E与主成分基本能达到基线分离，但是该方法耐用性较差，不同批次的色谱柱对杂质E与主成分的分离度重现性较差，色谱图见图2。推测原因为欧洲药典中的缓冲盐为磷酸溶液，具备的缓冲能力较为一般。故在欧洲药典基础上将磷酸水溶液体系更换为醋酸铵和高氯酸钠水溶液体系，将有机相乙腈体系更改为甲醇与乙腈的混合体系，即可保证杂质E与主成分的完全分离。本方法对杂质的检测能力更高，色谱图见图3，各杂质间分离度更好，更能保证患者用药的安全性，故选择本检测方法较为适宜。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法，对杂质的检测能力高，各杂质间分离度更好，更能保证患者用药的安全性。

本发明技术方案一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法，诺氟沙星EP中相关物质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K，化学式分别为：

首先，称取诺氟沙星胶囊内主成分，用0.1mol/L盐酸溶解稀释，配制成含诺氟沙星浓度为0.3～0.5mg/ml的溶液，为检测样液，然后采用高效液相色谱法进行分析；

以十六烷基酰胺基硅烷键合硅胶为色谱柱填料；选用甲醇和乙腈的混合溶液为有机溶剂，甲醇和乙腈比例为2:1～4:1；选用浓度为0.01～0.02mol/L的醋酸铵高氯酸钠水溶液为缓冲溶液，并用磷酸调节缓冲溶液pH值至2.0～4.0；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：

0～5min，有机溶剂占流动相比例为5％；

5～7min，有机溶剂占流动相比例为7％；

7～10min，有机溶剂占流动相比例为13％；

10～15min，有机溶剂占流动相比例为53％；

15～20min，有机溶剂占流动相比例为90％；

20～20.1min，有机溶剂占流动相比例为5％；

洗脱流速为1.3～1.5ml/min，进样量为10～50μl；

梯度洗脱后采用紫外检测器作为检测器，检测波长为260～270nm。

优选地，紫外检测器检测波长为265nm；醋酸铵高氯酸钠水溶液浓度为 0.01mol/L，pH值为2.4；洗脱流速为1.4ml/min；进样量为20μl；样液浓度为 0.4mg/ml。

本发明技术方案的一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法的有益效果是：通过对缓冲溶液组成、梯度洗脱程序等条件进行控制，兼顾11个有关物质(杂质)分离的需要，并将分析周期控制在30min内，主成分与各有关物质之间、各有关物质之间均能达到基线分离。

附图说明

图1为中国药典方法中杂质E与主成分分离色谱图；

图2为欧洲药典方法不同批号色谱图对比；

图3为本分析方法适用性色谱图；

图4为本分析方法各杂质专属性定位色谱图；

图4中色谱图从上至下分别为溶剂、空白辅料、诺氟沙星、杂质A、杂质B、 杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K。

具体实施方式

为便于本领域技术人员理解本发明技术方案，现结合说明书附图对本发明技术方案做进一步的说明。

本发明技术方案一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法，诺氟沙星EP中相关物质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K，化学式分别为：

首先，称取诺氟沙星胶囊内主成分，用0.1mol/L盐酸溶解稀释，配制成含诺氟沙星浓度为0.3～0.5mg/ml的溶液，为检测样液，样液浓度最佳为0.4mg/ml。然后采用高效液相色谱法进行分析。

以十六烷基酰胺基硅烷键合硅胶为色谱柱填料；选用甲醇和乙腈的混合溶液为有机溶剂，甲醇和乙腈比例为2:1～4:1；选用浓度为0.01～0.02mol/L的醋酸铵高氯酸钠水溶液为缓冲溶液，最佳选用浓度为0.01mol/L的醋酸铵高氯酸钠水溶液。并用磷酸调节缓冲溶液pH值至2.0～4.0，最佳pH值为2.4。

采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：

0～5min，有机溶剂占流动相比例为5％；

5～7min，有机溶剂占流动相比例为7％；

7～10min，有机溶剂占流动相比例为13％；

10～15min，有机溶剂占流动相比例为53％；

15～20min，有机溶剂占流动相比例为90％；

20～20.1min，有机溶剂占流动相比例为5％；

洗脱流速为1.3～1.5ml/min，进样量为10～50μl，洗脱流速为1.4ml/min。

梯度洗脱后采用紫外检测器作为检测器，检测波长为260～270nm，最佳检测波长为265nm。

为进一步确定本发明的诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法的优点，下面对高效液相色谱法进行验证。

1、有关物质定位试验

配制诺氟沙星样品溶液、各有关物质对照品溶液、诺氟沙星与各有关物质的混合溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表1，图谱见附图4。由表1的数据显示结果显示：诺氟沙星中有关物质之间都能达到良好的分离。

表1诺氟沙星与各杂质分离参数结果

2、检测限、定量限试验

采用信噪比法测定诺氟沙星及其各有关物质的检测限和定量限。分别配制诺氟沙星及其各有关物质的贮备液，稀释至一定浓度并进样，计算峰高与噪声的比值(信噪比)，其信噪比(S/N)约为10的样品检测量即为定量限，信噪比(S/N) 约为3的样品检测量即为检测限，结果见表2。表2中数据结果显示：本方法对各有关物质的响应高，能准确控制各有关物质的含量。

表2定量限与检测限试验结果

3、标准曲线

精密称取诺氟沙星及其11个有关物质，用0.1M盐酸稀释，配制成6份不同浓度的溶液。分别进样并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到诺氟沙星及其各有关物质的线性回归方程，结果见表3。表3中结果显示：在本发明方法下，诺氟沙星及其11个有关物质在一定浓度范围内，均能呈现良好的线性。

表3标准曲线实验结果

化合物	线性范围(μg/ml)	线性方程	回归系数r
				诺氟沙星杂质D	0.0245～0.6131μg/ml	y＝83642x-173.5	0.9995
诺氟沙星杂质B	0.0390～0.5851μg/ml	y＝83331x+634.65	0.9984
				诺氟沙星杂质E	0.0667～1.0004μg/ml	y＝58607x-93.378	0.9998
诺氟沙星杂质F	0.0549～0.6583μg/ml	y＝45343x-193.24	0.9998
				诺氟沙星杂质I	0.0232～0.5804μg/ml	y＝49958x+52.504	0.9998
诺氟沙星杂质C	0.0489～0.5870μg/ml	y＝41633x-4.6327	0.9998
				诺氟沙星杂质K	0.0619～0.9288μg/ml	y＝62541x-417.84	0.9998
诺氟沙星	0.0503～0.6087μg/ml	y＝72591x+17.972	0.9999
				诺氟沙星杂质G	0.0246～0.6518μg/ml	y＝53858x-95.407	0.9999
诺氟沙星杂质A	0.0201～0.6024μg/ml	y＝63360x-65.481	1.0000
				诺氟沙星杂质H	0.0321～0.6524μg/ml	y＝44829x+77.668	0.9999
诺氟沙星杂质J	0.0848～0.65363μg/ml	y＝28759x-164.15	0.9988

4、准确度

精密称取诺氟沙星胶囊内容物适量，用0.1M盐酸溶解稀释，配制成含诺氟沙星浓度为0.4mg/ml的溶液9份，三份为一组，分别向各组加入适量有关物质，使得三组溶液中各有关物质的浓度分别为相对限度的50％、相对限度的100％和相对限度的150％。进样并记录色谱图，计算回收率，结果见表4。表4中数据结构显示本发明的方法准确度良好。

表4准确度实验结果

化合物	50％限度浓度	100％限度浓度	150％限度浓度
				诺氟沙星杂质D	95.7％	98.8％	98.5％
诺氟沙星杂质C	103.5％	102.6％	101.5％
				诺氟沙星杂质K	103.7％	101.0％	100.2％
诺氟沙星杂质B	106.1％	102.1％	100.8％
				诺氟沙星杂质E	100.9％	100.1％	100.6％
诺氟沙星杂质F	98.6％	99.6％	100.3％
				诺氟沙星杂质G	95.5％	95.6％	95.7％
诺氟沙星杂质A	102.1％	100.2％	100.4％
				诺氟沙星杂质H	98.7％	98.8％	100.9％
诺氟沙星杂质I	99.1％	99.3％	100.6％
				诺氟沙星杂质J	96.9％	94.8％	107.5％

5、破坏性试验

精密称取诺氟沙星胶囊内容物适量，在强酸、强碱、高温、光照、氧化等条件下分别对其进行破坏试验，进样并记录色谱图，统计被破坏出的杂质情况，结果见表5。表5中结果显示：本发明技术方案的方法能够很好的检测出诺氟沙星破坏性试验产生的降解产物，物料平衡率均在95％～105％之间，降解杂质与主峰分离度符合要求，主峰光谱纯度也都符合要求。因此，可采用上述色谱系统来测定诺氟沙星胶囊中的有关物质及其降解产物。

表5破坏性试验实验结果

下面就上述技术方案提出一组实验和数据，用以验证上述技术方案及其有益效果。精密称取诺氟沙星胶囊内主成分(细粉)适量，用0.1M盐酸溶解稀释，配制成含诺氟沙星浓度为0.4mg/ml的溶液，过滤，即为检测样液。然后精密量取检测样液1ml置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置 10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，得到对照溶液。

然后采用高效液相色谱法，以末端封尾的十六烷基酰胺基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，选用适当的有机溶剂和缓冲溶液为流动相，采用梯度洗脱。

梯度洗脱；有机溶剂为甲醇和乙腈的混合溶液，缓冲溶液为醋酸铵高氯酸钠水溶液，且醋酸铵的浓度为0.01～0.02mol/L，并用磷酸调节pH值至2.4。以醋酸铵高氯酸钠水溶液(缓冲液)为流动相A，甲醇和乙腈按照3∶1混合溶液为流动相B。

梯度洗脱程序为：

0～5min，流动相B比例为5％；

5～7min，流动相B比例从5％变为7％；

7～10min，流动相B比例从7％变为13％；

10～15min，流动相B比例从13％变为53％；

15～20min，流动相B比例从53％变为90％；

20min～20.1min，流动相B比例为从90％变为5％。

再后，精密量取对照溶液和检测样液各20μl，分别注入液相色谱仪中，进样并记录色谱图，使用除杂质A按外标法其余杂质均按自身对照法计算各有关物质的含量，结果见表6。

表6诺氟沙星胶囊原研药品测定结果对比

杂质/批号	Y001A
		诺氟沙星杂质D	未检出
诺氟沙星杂质C	未检出
		诺氟沙星杂质K	0.052％
诺氟沙星杂质B	0.015％
		诺氟沙星杂质E	未检出
诺氟沙星杂质F	未检出
		诺氟沙星杂质G	未检出
诺氟沙星杂质A	未检出
		诺氟沙星杂质H	未检出
诺氟沙星杂质I	未检出
		其他最大单杂	未检出
总杂	0.067％

本发明技术方案在上面结合附图对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法，其特征在于，

诺氟沙星EP中相关物质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J和杂质K，化学式分别为：

首先，称取诺氟沙星胶囊内颗粒，用0.1mol/L盐酸溶解稀释，配制成含诺氟沙星浓度为0.3～0.5mg/ml的溶液，为检测样液，然后采用高效液相色谱法进行分析；

以十六烷基酰胺基硅烷键合硅胶为色谱柱填料；选用甲醇和乙腈的混合溶液为有机溶剂，甲醇和乙腈比例为2:1～4:1；选用浓度为0.01～0.02mol/L的醋酸铵高氯酸钠水溶液为缓冲溶液，并用磷酸调节缓冲溶液pH值至2.0～4.0；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：

0～5min，有机溶剂占流动相比例为5％；

5～7min，有机溶剂占流动相比例为7％；

7～10min，有机溶剂占流动相比例为13％；

10～15min，有机溶剂占流动相比例为53％；

15～20min，有机溶剂占流动相比例为90％；

20～20.1min，有机溶剂占流动相比例为5％；

洗脱流速为1.3～1.5ml/min，进样量为10～50μl；

梯度洗脱后采用紫外检测器作为检测器，检测波长为260～270nm。

2.根据权利要求1所述的一种诺氟沙星胶囊中相关物质的分析方法，其特征在于，紫外检测器检测波长为265nm；醋酸铵高氯酸钠水溶液浓度为0.01mol/L，pH值为2.4；洗脱流速为1.4ml/min；进样量为20μl；样液浓度为0.4mg/ml。

Images