CN110596293A - 一种高哌嗪的高效液相检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高哌嗪的高效液相检测方法，包括以下步骤：将盐酸法舒地尔注射液用水稀释并加入高哌嗪；在干燥的衍生管中，加入硼酸盐缓冲液以及衍生试剂；然后用石蜡膜封口，加热之后将衍生管冷却，得衍生样品；将衍生样品采用液相色谱仪，采集色谱图测得高哌嗪含量。本发明以Waters公司开发的反相高效液相色谱柱前衍生方法‑AccQ·Tag法为基础，利用衍生化试剂将荧光基团加在高哌嗪的氨基上；经修饰后的高哌嗪衍生物具有了紫外吸收，再利用高效液相色谱法进行定性和定量分析。本发明方法精密度高、稳定性好、重现性好，本发明丰富了检测高哌嗪含量的方法，填补了高哌嗪含量液相检测只能使用离子色谱法的空白。

Description

一种高哌嗪的高效液相检测方法
技术领域
本发明涉及液相色谱检测领域，具体涉及一种高哌嗪含量高效液相的检测方法。
背景技术
盐酸法舒地尔，是一种肌球蛋白轻链磷酸化酶、RHO激酶抑制剂和新型细胞内钙离子抗结剂，该药能改善脑组织微循环，有效缓解脑血管痉挛，保护缺血脑组织，促进神经再生，是一种具有广泛药理作用的新型药物，高哌嗪是盐酸法舒地尔合成过程中的中间体。它在常规的反相色谱柱上保留较弱，同时没有紫外吸收，且成盐后也不适合用气相检测，故而不易在生产中控制，由于高哌嗪无紫外吸收，极性大，采用高效液相色谱法无法进行有效检测，已有文献报道采用液相色谱法、紫外分光光度法、离子色谱法测定盐酸法舒地尔中高哌嗪的含量，但现有的检测方法测定结构准确度低，操作繁琐。
因此，提供一种快速、简单、经济、应用范围广的高哌嗪液相检测方法是本领域技术人鱼亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种快速、简单、高效的高哌嗪液相检测方法
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：高哌嗪的高效液相检测方法，包括以下步骤：
(1)将盐酸法舒地尔注射液用水稀释成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg的溶液；
(2)将高哌嗪用水稀释成每1ml中含高哌嗪0.12～2.4μg的溶液；
(3)在步骤(1)中制得的盐酸法舒地尔稀释液中加入高哌嗪制成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg、高哌嗪0.6～6μg的溶液作为供试品溶液，备用；
(4)精密量取供试品溶液10μl，置干燥的衍生管中，加入硼酸盐缓冲液70μl之后涡旋混合15s，再加入衍生试剂20μl，涡旋混合60s；然后将衍生管用石蜡膜封口，在55℃条件下加热10min之后将衍生管冷却至22-28℃，即得衍生样品；
(5)将衍生样品转移至微量进样管中，精密量取衍生样品10μl，按预设的色谱条件待色谱柱平衡好后，注入液相色谱仪，采集色谱图。
进一步，上述步骤(4)中硼酸盐缓冲液选自美国Waters公司提供的WatersAccQFluor试剂盒中的Waters AccQ·Fluor硼酸缓冲液。
更进一步，上述步骤(4)中衍生试剂制备方法为：
1)取出Waters AccQ Fluor试剂盒中的Waters AccQ·Fluor衍生剂粉末A和Waters AccQ·Fluor衍生剂稀释剂B；
2)从B瓶中吸取稀释剂1ml至A瓶中，加盖密封，震荡10s钟，然后55℃下加热30min，使衍生剂粉末全部溶解，取出放冷后，即得衍生试剂，并于干燥器内存放。
进一步，上述步骤(5)中色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，色谱柱规格为：4.6×250mm，5μm；
检测器为紫外检测器；
检测波长为248nm；
流动相为三水合醋酸钠水溶液-乙腈；
流动相流速为0.9～1.1ml/min；
进样体积为10μl；
色谱柱柱温为27～33℃。
更进一步，上述流动相中：乙腈的体积比例范围为22％～28％；三水合醋酸钠水溶液的体积比例范围为78％～72％；流动相中三水合醋酸钠水溶液浓度为0.02mol/L，pH值为4.8～5.2。
与现有技术相比本发明的有益效果在于：本发明以Waters公司开发的反相高效液相色谱柱前衍生方法-AccQ·Tag法为基础，利用衍生化试剂将荧光基团加在高哌嗪的氨基上；经修饰后的高哌嗪衍生物具有了紫外吸收，再利用反相高效液相色谱法进行定性和定量分析。本发明中高哌嗪的液相检测方法精密度高、稳定性好、重现性好，本发明丰富了检测高哌嗪含量的方法，同时填补了高哌嗪含量液相检测只能使用离子色谱法的空白，也为盐酸法舒地尔及相关制剂质量控制方法提供了参考。
附图说明
图1为本发明实施例1的HPLC图；
图2为本发明实施例2和实施例3的HPLC图；
图3为本发明实施例4和实施例5的HPLC图；
图4为本发明试验例1专属性试验色谱图；
图5为本发明试验例2系统适用性试验色谱图；
图6为本发明试验例3线性回归曲线图；
图7为本发明试验例3线性与线性范围色谱图；
图8为本发明试验例4检测限色谱图；
图9为本发明试验例5定量限色谱图；
图10为本发明试验例6重复性精密度试验色谱图；
图11为本发明试验例7样品加样回收率试验准确度色谱图；
图12为本发明试验例8.1流动相配比变化范围考察色谱图；
图13为本发明试验例8.2流动相pH值变化范围考察色谱图；
图14为本发明试验例8.3流动相流速变化范围考察色谱图；
图15为本发明试验例8.4柱温变化考察色谱图；
图16为本发明试验例8.5不同色谱柱的影响考察色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
仪器：高效液相色谱仪Waters e2695，包括液相泵、紫外检测器、进样器等。
试剂：三水合醋酸钠(优级纯)、乙腈(色谱纯)、磷酸(优级纯)
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱
如图1所示，以下各实施例的基本试验条件相同。
以下各实施例均照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。
实施例1
色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L三水合醋酸钠(pH＝5.0)-乙腈(75:25)为流动相采用梯度洗脱；检测波长为248nm，柱温30℃，进样量10μl。
测定法：精密量取本品和高哌嗪对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含盐酸法舒地尔0.6mg和高哌嗪0.6μg的溶液，作为供试品溶液；另取高哌嗪对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含高哌嗪1.2μg的溶液，作为对照品溶液。
样品衍生：精密量取供试品溶液10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混合15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混合60s，衍生管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取高哌嗪对照品溶液10μl，同法操作，并测定。按外标法以峰面积计算，不得超过0.2％。
实施例2
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L三水合醋酸钠(pH＝5.0)-乙腈(78:22)为流动相，采用等度洗脱；检测波长为248nm，柱温30℃，进样量10μl。
测定法：精密量取本品和高哌嗪对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含盐酸法舒地尔0.6mg和高哌嗪0.6μg的溶液，作为供试品溶液；另取高哌嗪对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含高哌嗪1.2μg的溶液，作为对照品溶液。
样品衍生：精密量取供试品溶液10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混合15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混合60s，衍生管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取高哌嗪对照品溶液10μl，同法操作，并测定。按外标法以峰面积计算，不得超过0.2％。
实施例3
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L三水合醋酸钠(pH＝5.0)-乙腈(72:28)为流动相，采用等度洗脱；流速为每分钟1.0ml，检测波长为248nm，柱温30℃，进样量10μl。
测定法：精密量取本品和高哌嗪对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含盐酸法舒地尔0.6mg和高哌嗪0.6μg的溶液，作为供试品溶液；另取高哌嗪对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含高哌嗪1.2μg的溶液，作为对照品溶液。
样品衍生：精密量取供试品溶液10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混合15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混合60s，衍生管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取高哌嗪对照品溶液10μl，同法操作，并测定。按外标法以峰面积计算，不得超过0.2％。
实施例4
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L三水合醋酸钠(pH＝5.0)-乙腈(75:25)为流动相，采用等度洗脱；流速为每分钟1.1ml，检测波长为248nm，柱温30℃，进样量10μl。
测定法：精密量取本品和高哌嗪对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含盐酸法舒地尔0.6mg和高哌嗪0.6μg的溶液，作为供试品溶液；另取高哌嗪对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含高哌嗪1.2μg的溶液，作为对照品溶液。
样品衍生：精密量取供试品溶液10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混合15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混合60s，衍生管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取高哌嗪对照品溶液10μl，同法操作，并测定。按外标法以峰面积计算，不得超过0.2％。
实施例5
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L三水合醋酸钠(pH＝5.0)-乙腈(75:25)为流动相，采用等度洗脱；流速为每分钟0.9ml，检测波长为248nm，柱温33℃，进样量10μl。
测定法：精密量取本品和高哌嗪对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含盐酸法舒地尔0.6mg和高哌嗪0.6μg的溶液，作为供试品溶液；另取高哌嗪对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含高哌嗪1.2μg的溶液，作为对照品溶液。
样品衍生：精密量取供试品溶液10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混合15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混合60s，衍生管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取高哌嗪对照品溶液10μl，同法操作，并测定。按外标法以峰面积计算，不得超过0.2％。
试验例1
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，梯度洗脱以pH＝5.0、浓度为0.02mol/L三水醋酸钠-乙腈＝75:25；pH＝5.0、0.02mol/L三水醋酸钠-乙腈＝20:80为流动相，如表1，检测波长为248nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量10μl。其他，溶液制备方法与测试方法与实施例1相同。
表1不同检测时间流动相流量
对照品溶液的制备精密称取高哌嗪对照品适量，加超纯水溶解，稀释制成每1ml中含1.2μg高哌嗪的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备精密量取本品1ml，置25ml量瓶中，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
阴性空白溶液的制备配制不含盐酸法舒地尔的阴性空白样品，精密量取阴性空白样品1ml，置25ml量瓶中，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，作为阴性空白溶液。
测定法精密量取上述溶液各10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混和15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混和60s，样品管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
结果显示，溶剂、阴性空白溶液色谱图中，在高哌嗪主峰的保留时间处均未出现色谱峰，表明溶剂与空白辅料均不影响本品中高哌嗪的测定；理论塔板数按高哌嗪主峰计大于10000，其他参数也均符合要求，表明本色谱条件专属性良好。试验结果见图4。
试验例2系统适用性试验
取高哌嗪对照品适量，加超纯水溶解，稀释制成每1ml中含高哌嗪约为1.2μg的溶液，作为系统适用性溶液。精密量取该溶液10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混和15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混和60s，样品管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中。精密量取该溶液10μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。结果显示，高哌嗪峰面积的RSD值为1.47％，小于2.0％，理论塔板数，拖尾因子均符合要求，本方法系统适用性良好。试验结果见表2，图5。
表2系统适用性试验结果
试验例3线性范围试验
精密称取高哌嗪对照品适量，用水稀释，得储备液。精密量取该储备液适量，用水稀释，制成一系列浓度为0.12μg/ml、0.31μg/ml、0.61μg/ml、0.92μg/ml、1.22μg/ml、1.53μg/ml、2.44μg/ml的对照溶液。精密量取上述溶液各10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混和15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混和60s，样品管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，分别精密量取该溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以高哌嗪对照品的浓度(μg/ml)为x轴，以峰面积为y轴进行线性回归，得回归方程：y＝25783x－2127.5，r＝0.9979。结果表明，当溶液中高哌嗪的浓度在0.12～2.44μg/ml范围内时，其浓度与峰面积线性关系良好。试验结果见表3，图6-7。
表3线性与线性范围试验结果
试验例4检测限试验
精密称取高哌嗪对照品适量，加水稀释制成每1ml中含有高哌嗪15.5ng的溶液，同法用阴性空白溶解制备高哌嗪检测限测试溶液，平行制备三份，精密量取以上溶液各10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混和15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混和60s，样品管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，响应值约为噪音的4.33倍，经计算，本测定条件下高哌嗪的检测限为10.7ng/ml(响应值为噪音的3倍)，高哌嗪测试溶液中高哌嗪峰面积的RSD<15％，见表4，图8。
表4检测限测试溶液1-3试验测试数据
试验例5定量限试验
精密称取高哌嗪对照品适量，加水稀释制成每1ml中含有高哌嗪61.9ng的溶液，同法用阴性空白溶解制备高哌嗪定量限测试溶液，平行制备三份，精密量取上述溶液各10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混和15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混和60s，样品管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，响应值约为噪音的15.4倍，本测定条件下高哌嗪的定量限为40.1ng/ml(响应值为噪音的10倍)。高哌嗪测试溶液中高哌嗪峰面积RSD﹤10％，保留时间的RSD﹤2.0％，结果见表5，图9。
表5定量限测试溶液1-3试验测试数据
试验例6精密度试验
精密量取本品1ml，置25ml量瓶中，量取浓度约为6μg/ml高哌嗪对照品储备液2.5ml加入上述量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，得试验溶液。平行配制六份试验溶液，精密量取上述溶液各10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混和15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混和60s，样品管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。测得6份试验溶液中高哌嗪含量的RSD值小于3.0％，表明该方法重复性良好，结果见表6，图10.
表6重复性精密度试验结果
试验例7准确度试验
分别精密量取本品1ml，置于25ml量瓶中，分别加入浓度约为6μg/ml高哌嗪对照品储备液2.5ml，5ml，7.5ml，然后加超纯水稀释溶解并定容至刻度，摇匀，得50％，100％，150％的样品加样回收率测试溶液，每个浓度的测试溶液各平行配制三份。精密量取上述溶液各10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混和15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混和60s，样品管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算高哌嗪的回收率。试验结果显示，各个浓度的高哌嗪回收率均在92％～104％范围中，且回收率RSD值为4.63％，试验结果见表6，图11，结果表明本法准确度良好，试验结果可靠。
表6样品加样回收率试验结果
试验例8耐用性试验
表7高哌嗪含量测定耐用性试验项目
8.1流动相比例的影响
量取本品1ml，置于25ml量瓶中，量取浓度约为6μg/ml高哌嗪对照品储备液2.5ml加入上述量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，得试验溶液，平行制备两份试验溶液。精密量取上述溶液各10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混和15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混和60s，样品管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中。
在其余检测条件不变的情况下，改变流动相比例，考察流动相比例的改变对检测结果的影响，试验结果见表9，图12。试验结果显示，改变流动相比例为乙腈-0.02mol/L三水醋酸钠(22：78)及乙腈-0.02mol/L三水醋酸钠(28：72)时，对高哌嗪含量测定无显著性影响，表明此方法对流动相比例变化的耐用性良好。
表8流动相比例变化范围考察结果
表9流动相比例变化范围对高哌嗪测定的影响
8.2流动相pH值的影响
在其余检测条件不变的情况下，改变流动相中0.02mol/L三水醋酸钠的pH值，考察流动相pH值的改变对检测结果的影响，试验结果见表11，图13。试验结果显示，改变流动相中0.02mol/L三水醋酸钠的pH值为4.8和5.2时，对高哌嗪含量测定无显著性影响，表明此方法对流动相pH值变化的耐用性良好。
表10流动相pH值变化范围考察结果
表11流动相pH值变化范围对高哌嗪测定的影响
8.3流速的影响
在其余检测条件不变的情况下，改变流动相流速，考察流动相流速的改变对检测结果的影响，试验结果见表13，图14。试验结果显示，流动相流速为0.9～1.1ml/min时，对高哌嗪含量测定无显著性影响，表明本发明方法对流动相流速变化的耐用性良好。
表12流动相流速变化范围考察结果
考察条件 保留时间(min) 峰面积 理论塔板数 拖尾因子
正常条件(1.0ml/min) 13.413 25148 15865 1.150
流速1(0.9ml/min) 14.403 39643 16114 1.171
流速2(1.1ml/min) 11.939 32899 14529 1.160
表13流动相流速变化范围对高哌嗪含量测定的影响
8.4柱温的影响
在其余检测条件不变的情况下，改变柱温，考察柱温的改变对检测结果的影响，试验结果见表15，图15。试验结果显示，当柱温为27℃或33℃时，对高哌嗪测定无显著性影响，表明本发明方法对柱温变化的耐用性良好。
表14柱温变化考察结果
考察条件 保留时间(min) 峰面积 理论塔板数 拖尾因子
正常条件(30℃) 13.413 25148 15865 1.150
柱温(27℃) 12.995 36013 14747 1.174
柱温(33℃) 13.259 36263 15868 1.161
表15柱温变化对高哌嗪含量测定的影响
8.5不同色谱柱的影响
在其余检测条件不变的情况下，使用不同的十八烷基硅烷键合硅胶柱，考察其对检测结果的影响，试验结果见表17，图16。试验结果显示，不同的十八烷基硅烷键合硅胶柱对高哌嗪含量测定无显著性影响。
表16不同色谱柱的影响考察结果
考察条件 保留时间(min) 峰面积 理论塔板数 拖尾因子
正常条件 13.413 25148 15865 1.150
更换色谱柱 13.000 35711 13276 1.141
表17不同色谱柱对高哌嗪含量测定的影响
综上所述可知，本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将盐酸法舒地尔注射液用水稀释成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg的溶液；
(2)将高哌嗪用水稀释成每1ml中含高哌嗪0.12～2.4μg的溶液；
(3)在步骤(1)中制得的盐酸法舒地尔稀释液中加入高哌嗪制成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg、高哌嗪0.6～6μg的溶液作为供试品溶液，备用；
(4)供试品溶液，置干燥的衍生管中，加入硼酸盐缓冲液之后涡旋混合，再加入衍生试剂，在进行涡旋混合；然后将衍生管用石蜡膜封口并加热，然后将衍生试管进行冷却，即得衍生样品；
(5)将衍生样品转移至微量进样管中，精密量取衍生样品10μl，按预设的色谱条件待色谱柱平衡好后，注入液相色谱仪，采集色谱图。
2.根据权利要求1所述一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的硼酸盐缓冲液选自美国Waters公司提供的Waters AccQFluor试剂盒中的Waters AccQ·Fluor硼酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述衍生试剂制备方法为：
1)取出Waters AccQFluor试剂盒中的Waters AccQ·Fluor衍生剂粉末A和WatersAccQ·Fluor衍生剂稀释剂B；
2)从B瓶中吸取稀释剂1ml至A瓶中，加盖密封，震荡10s钟，然后55℃下加热30min，使衍生剂粉末全部溶解，取出放冷后，即得衍生试剂，并于干燥器内存放。
4.根据权利要求1所述一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(5)中所述的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
检测器为紫外检测器；
检测波长为248nm；
流动相为三水合醋酸钠水溶液-乙腈；
流动相流速为0.9～1.1ml/min；
进样体积为10μl；
色谱柱柱温为27～33℃。
5.根据权利要求4所述一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，所述流动相中：乙腈的体积比例范围为22％～28％；三水合醋酸钠水溶液的体积比例范围为78％～72％。
6.根据权利要求4所述一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，所述流动相中三水合醋酸钠水溶液浓度为0.02mol/L，pH值为4.8～5.2。
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