CN114324726B - 滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法。该方法包括对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱，制备供试品溶液，制备滋肾育胎丸单一药材阴性对照溶液，制备药材对照溶液，制备化合物对照溶液和采用上述溶液进行薄层层析的步骤。该方法能对滋肾育胎丸中的白术、续断、何首乌、巴戟天四味药材进行检测，使得滋肾育胎丸的定性鉴别更加简便快速以及准确，提高了滋肾育胎丸质量控制的准确性和全面性，更有利于滋肾育胎丸质量标准的建立和整体评价。

Description

滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法

技术领域

本发明涉及中药检测技术领域，特别是涉及一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法。

背景技术

滋肾育胎丸具有补脾健肾，益气培元，养血安胎，强壮身体的功效，主要用于脾肾两虚，冲任不固所致的滑胎(防治习惯性流产和先兆性流产)。其由菟丝子、砂仁、熟地黄、人参、桑寄生、阿胶、何首乌、艾叶、巴戟天、白术、党参、鹿角霜、枸杞子、续断以及杜仲等15味中药组成。

该中成药的化学成分复杂多样，要保证其质量，应当进行多成分的质量控制方法对该中成药的进行质量分析。薄层鉴别是中药质量控制非常重要的一种手段，它可以快速、简便地同时分离多个样品，且灵敏度高，在定性鉴别、半定量以及定量分析中发挥着重要作用。但目前滋肾育胎丸执行的质量标准为中华人民共和国卫生部药品标准，质量标准无含量测定项，鉴别项也不完善，仅有党参、何首乌两项薄层鉴别，既不能有效地对滋肾育胎丸进行质量控制，也不能真实反映滋肾育胎丸药效与化学成分之间的关系。

发明内容

基于此，本发明提供了一种能对滋肾育胎丸中的白术、续断、何首乌、巴戟天四味药材进行检测的薄层检测方法，使得滋肾育胎丸的定性鉴别更加简便快速以及准确，提高了滋肾育胎丸质量控制的准确性和全面性，更有利于滋肾育胎丸质量标准的建立和整体评价。

技术方案如下：

一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，包括如下步骤：

(1)对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸第一洗脱液；

以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸第二洗脱液；

其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

(2)制备对照品：

制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液；

制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液；

制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液；

制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液；

(3)薄层层析：

(3-1)：将所述滋肾育胎丸第二洗脱液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液、白术内酯Ⅲ对照溶液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液、续断皂苷Ⅵ对照溶液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于展开剂中展开，取出，晾干，检视；

(3-2)：将所述滋肾育胎丸第一洗脱液、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于展开剂中展开，取出，晾干，检视。

在其中一个实施例中，所述以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸第二洗脱液的步骤包括：

以醇体积占比为40％～60％的醇水混合溶剂为第二-1洗脱剂进行第二-1洗脱，收集滋肾育胎丸第二-1洗脱液；

以醇体积占比为60％～80％的醇水混合溶剂为第二-2洗脱剂进行第二-2洗脱，收集滋肾育胎丸第二-2洗脱液；

以醇体积占比为80％～100％的醇水混合溶剂为第二-3洗脱剂进行第二-3洗脱，收集滋肾育胎丸第二-3洗脱液。

在其中一个实施例中，步骤(3-1)包括：

将所述滋肾育胎丸第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-1洗脱液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第一展开剂中展开，取出，晾干，检视；

将所述滋肾育胎丸第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-2洗脱液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第二展开剂中展开，取出，晾干，检视；

将所所述滋肾育胎丸述第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-3洗脱液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第三展开剂中展开，取出，晾干，检视；

其中，所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸的混合物；

所述第二展开剂为正丁醇、醋酸和水的混合物，或所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的混合物；

所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸的混合物。

在其中一个实施例中，步骤(3-2)所采用的展开剂为第四展开剂，所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸的混合物。

在其中一个实施例中，所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比(38-45)：(8-15)：(0.3-0.7)混合而成的混合溶剂；和/或

所述第二展开剂为正丁醇、醋酸和水按照体积比(3-5)：(0.8-1.2)：(3-7)混合而成的混合溶剂，或所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比(12-18)：(38-42)：(20-25)：(8-12)混合而成的混合溶剂；和/或

所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比(8-12)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.05-0.15)混合而成的混合溶剂；和/或

所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸按照体积比(5-8)：(2-4)：(0.3-1.2)：(0.3-1.2)混合而成的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比(40-42)：(8-10)：(0.4-0.5)混合而成的混合溶剂；和/或

所述第二展开剂为正丁醇、醋酸和水按照体积比(4-5)：(0.8-1)：(5-7)混合而成的混合溶剂，或所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比(12-15)：(40-42)：(20-22)：(8-10)混合而成的混合溶剂；和/或

所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比(10-12)：(0.8-1)：(0.8-1)：(0.05-0.1)混合而成的混合溶剂；和/或

所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸按照体积比(6-7)：(2-3)：(0.5-1)：(0.5-1)混合而成的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法还包括分别对滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱的步骤：

其中，对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸白术阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸续断阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸何首乌阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品第一洗脱液，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，其中，所述的醇为甲醇或乙醇。

在其中一个实施例中，各柱层析梯度洗脱所采用的层析柱分别独立为C18色谱柱、ODS TUP柱或D101大孔树脂柱。

在其中一个实施例中，在所述收集滋肾育胎丸第一洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第一洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第一供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种；

在所述收集滋肾育胎丸第二洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第二洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品第一洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种；

所述制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸白术阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸续断阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸何首乌阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述滋肾育胎丸第二供试品溶液具有两种浓度范围；

具有第一浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液的浓度分别独立为20μg/ml～120μg/ml；和/或

具有第二浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液的浓度分别独立为0.1mg/ml～1.5mg/ml；和/或

具有第二浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液的浓度分别独立为0.1mg/ml～1.5mg/ml；和/或

所述滋肾育胎丸第一供试品溶液、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液的浓度分别独立为0.5mg/ml～2mg/ml。

在其中一个实施例中，所述白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液、白术内酯Ⅲ对照溶液、续断对照溶液、续断皂苷Ⅵ对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液中的溶剂分别独立为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；和/或

所述水晶兰苷对照溶液中的溶剂选自水、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的至少一种。

在其中一个实施例中，步骤(3-1)和(3-2)中还包括对晾干后的各个所述硅胶G固定相进行显色处理，然后在100℃～105℃条件下加热至斑点清晰的步骤。

在其中一个实施例中，各显色处理所采用的显色剂均为硫酸质量占比为9.5％～10.5％的硫酸乙醇溶液。

在其中一个实施例中，在步骤(3-1)中，各检视的条件分别独立为紫外灯下365nm、日光灯或自然光；

在步骤(3-2)中，检视的条件为日光灯或自然光。

在其中一个实施例中，在步骤(3-1)中，针对白术或何首乌的检视条件为紫外灯下365nm，针对续断的检视条件为紫外灯下365nm。

在其中一个实施例中，在对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱、对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱、对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱、对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱和对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱、制备白术对照溶液、制备续断对照溶液以及制备何首乌对照溶液的步骤之前均还包括如下步骤：

采用水或有机溶剂作为提取试剂，分别对待检测滋肾育胎丸、滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品、白术、续断以及何首乌进行提取处理。

在其中一个实施例中，用水作为提取试剂，所述提取处理包括：

分别将待检测滋肾育胎丸、滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品、白术、续断以及何首乌溶于所述水中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，分别对应收集滋肾育胎丸滤渣、滋肾育胎丸白术阴性对照品滤渣、滋肾育胎丸续断阴性对照品滤渣、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品滤渣、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品滤渣、白术滤渣、续断滤渣以及何首乌滤渣。

在其中一个实施例中，用有机溶剂作为提取试剂，所述提取处理包括：

分别将待检测滋肾育胎丸、滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品、白术、续断、何首乌溶于第一有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤渣，分别对应收集滋肾育胎丸滤液、滋肾育胎丸白术阴性对照品滤液、滋肾育胎丸续断阴性对照品滤液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品滤液、白术滤液、续断滤液、何首乌滤液；

以及将所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品溶于第二有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品滤渣；或

将所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品溶于第三有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤渣，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品滤液；

其中，所述第一有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述第二有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或几种的混合溶剂；

所述第三有机溶剂选自甲醇和乙醇中的一种或两种的混合溶剂。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种能对滋肾育胎丸中的白术、续断、何首乌、巴戟天四味药材进行检测的薄层检测方法，优化了滋肾育胎丸中白术、续断、巴戟天以及何首乌原有的薄层鉴别技术，包括优化前处理方法，具体为采用柱层析梯度洗脱的方式减少了杂质点对于薄层检测的干扰，以及增加了对照品，使得滋肾育胎丸的定性鉴别操作更加快速简便，专属性更强，适应性更广。另外，本发明完善了滋肾育胎丸中多味药材的薄层鉴别，能够更加全面地反映滋肾育胎丸的物质基础，提高了滋肾育胎丸质量控制的准确性和全面性，更有利于滋肾育胎丸质量标准的建立和整体评价。

附图说明

图1为实施例1滋肾育胎丸中白术的检测结果；

图2为实施例1滋肾育胎丸中续断的检测结果；

图3为实施例1滋肾育胎丸中何首乌的检测结果；

图4为实施例1滋肾育胎丸中巴戟天的检测结果；；

图5为实施例2滋肾育胎丸中何首乌的检测结果；

图6为实施例3至实施例5针对滋肾育胎丸中续断的检测结果；

图7为实施例3至实施例5针对滋肾育胎丸中续断的检测结果；

图8为实施例6滋肾育胎丸中巴戟天的检测结果；

图9为实施例6滋肾育胎丸中巴戟天的检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

需要说明的是，在本发明的描述中，对于方位词，如有术语“中心”、“横向”、“纵向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示方位和位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于叙述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定方位构造和操作，不能理解为限制本发明的具体保护范围。

在描述位置关系时，除非另有规定，否则当一元件例如层、膜或基板被指为在另一膜层“上”时，其能直接在其他膜层上或亦可存在中间膜层。进一步说，当层被指为在另一层“下”时，其可直接在下方，亦可存在一或多个中间层。亦可以理解的是，当层被指为在两层“之间”时，其可为两层之间的唯一层，或亦可存在一或多个中间层。

在使用本文中描述的“包括”、“具有”、和“包含”的情况下，意图在于覆盖不排他的包含，除非使用了明确的限定用语，例如“仅”、“由……组成”等，否则还可以添加另一部件。

在本发明中，至少一种指任意一种、任意两种或任意两种以上。

除非相反地提及，否则单数形式的术语可以包括复数形式，并不能理解为其数量为一个。

此外，附图并不是以1：1的比例绘制，并且各元件的相对尺寸在附图中仅以示例地绘制，以便于理解本发明，但不一定按照真实比例绘制，附图中的比例不构成对本发明的限制。

在本发明中，醇体积占比指醇占醇和水的混合溶剂的总体积的百分比。

本发明提供了一种能对滋肾育胎丸中的白术、续断、何首乌、巴戟天四味药材进行检测的薄层检测方法，使得滋肾育胎丸的定性鉴别更加简便快速以及准确，提高了滋肾育胎丸质量控制的准确性和全面性，更有利于滋肾育胎丸质量标准的建立和整体评价。

技术方案如下：

一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，包括如下步骤：

(1)对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸第一洗脱液；

以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸第二洗脱液；

其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

(2)制备对照品：

制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液；

制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液；

制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液；

制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液；

(3)薄层层析：

(3-1)：将所述滋肾育胎丸第二洗脱液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液、白术内酯Ⅲ对照溶液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液、续断皂苷Ⅵ对照溶液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于展开剂中展开，取出，晾干，检视；

(3-2)：将所述滋肾育胎丸第一洗脱液、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于展开剂中展开，取出，晾干，检视。

本发明采用柱层析梯度洗脱的方式减少了杂质点对于薄层检测的干扰，以及增加了对照品，使得滋肾育胎丸的定性鉴别操作更加快速简便，专属性更强，适应性更广，能够对滋肾育胎丸中白术、续断、巴戟天以及何首乌进行定性鉴别，配合优选的条件，还可以实现定量分析。

可以理解地，在本发明中步骤(1)和步骤(2)的顺序可以调换，本发明对其先后顺序不做要求，用(1)和(2)描述，仅是为了使后续描述更为简要。

关于本发明提供的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法详细描述如下：

步骤(1)对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸第一洗脱液；以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸第二洗脱液；其中，所述的醇为甲醇或乙醇。采用柱层析梯度洗脱的方式减少了杂质点对于薄层检测的干扰，以及增加了对照品，使得滋肾育胎丸的定性鉴别操作更加快速简便，专属性更强，适应性更广。

在其中一个较为优选的实施例中，所述的醇为甲醇。

进一步地，经发明人证实，以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集得到的滋肾育胎丸第一洗脱液中主要含有巴戟天相关成分；以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集得到的滋肾育胎丸第二洗脱液中主要含有白术相关成分，续断相关成分以及何首乌相关成分。

在其中一个实施例中，对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱所采用的层析柱分别独立为C18色谱柱、ODS TUP柱或D101大孔树脂柱。

在其中一个较为优选的实施例中，所述以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸第二洗脱液的步骤包括：

以醇体积占比为40％～60％的醇水混合溶剂为第二-1洗脱剂进行第二-1洗脱，收集滋肾育胎丸第二-1洗脱液；

以醇体积占比为60％～80％的醇水混合溶剂为第二-2洗脱剂进行第二-2洗脱，收集滋肾育胎丸第二-2洗脱液；

以醇体积占比为80％～100％的醇水混合溶剂为第二-3洗脱剂进行第二-3洗脱，收集滋肾育胎丸第二-3洗脱液。

经发明人证实，将40％～100％的醇水混合溶剂分为三个梯度的洗脱液，样能够使检测结果更为准确。其中，以醇体积占比为40％～60％的醇水混合溶剂为第二-1洗脱剂进行第二-1洗脱，收集得到的滋肾育胎丸第二-1洗脱液中主要含有白术相关成分；以醇体积占比为60％～80％的醇水混合溶剂为第二-2洗脱剂进行第二-2洗脱，收集得到的滋肾育胎丸第二-2洗脱液中主要含有续断相关成分；以醇体积占比为80％～100％的醇水混合溶剂为第二-3洗脱剂进行第二-3洗脱，收集得到的滋肾育胎丸第二-3洗脱液中主要含有何首乌相关成分。

经发明人研究发现，将收集得到的滋肾育胎丸第一洗脱液和滋肾育胎丸第二洗脱液进行浓缩和重新溶解更有利于后续进行薄层层析，更方便观察。

在其中一个实施例中，在所述收集滋肾育胎丸第一洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第一洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第一供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种；

在所述收集滋肾育胎丸第二洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第二洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述滋肾育胎丸第一供试品溶液的浓度为0.5mg/ml～2mg/ml，该滋肾育胎丸第一供试品溶液用于检测滋肾育胎丸中的巴戟天；

所述滋肾育胎丸第二供试品溶液具有两种浓度范围：

具有第一浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液的浓度为20μg/ml～120μg/ml，该滋肾育胎丸第二供试品溶液用于检测滋肾育胎丸中的白术；

具有第二浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液的浓度为0.1mg/ml～1.5mg/ml，该滋肾育胎丸第二供试品溶液用于检测滋肾育胎丸中的续断和何首乌。

同理，将收集得到的滋肾育胎丸第二-1洗脱液、滋肾育胎丸第二-2洗脱液和滋肾育胎丸第二-3洗脱液进行浓缩和重新溶解也更有利于后续进行薄层层析，更方便观察。

可以理解地，对于将40％～100％的醇水混合溶剂分为三个梯度的洗脱液实施例，在所述收集滋肾育胎丸第二-1洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第二-1洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二-1供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种，该滋肾育胎丸第二-1供试品溶液主要作为针对白术的供试品检测液，进一步优选地，滋肾育胎丸第二-1供试品溶液的浓度为20μg/ml～120μg/ml。在所述收集滋肾育胎丸第二-2洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第二-2洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二-2供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种，该滋肾育胎丸第二-2供试品溶液主要作为针对续断的供试品检测液，进一步优选地，滋肾育胎丸第二-2供试品溶液的浓度为0.1mg/ml～1.5mg/ml。在所述收集滋肾育胎丸第二-3洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第二-3洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二-3供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种，该滋肾育胎丸第二-3供试品溶液主要作为针对何首乌的供试品检测液，进一步优选地，滋肾育胎丸第二-3供试品溶液的浓度为0.1mg/ml～1.5mg/ml。所述的滋肾育胎丸第二-1供试品溶液对应本发明所述的具有第一浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液，所述滋肾育胎丸第二-2供试品溶液和滋肾育胎丸第二-3供试品溶液对应本发明所述的具有第二浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液。

另外，经发明人研究发现，在步骤(1)对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱的步骤之前，采用水或有机溶剂作为提取试剂，对待检测滋肾育胎丸进行提取处理，能够进一步地除去较多杂质成分，进一步提高本发明的定性检测准确性和定量检测准确性。

在其中一个实施例中，用水作为提取试剂，对待检测滋肾育胎丸进行提取处理包括：

将待检测滋肾育胎丸溶于水中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，收集滋肾育胎丸滤渣。

在其中一个实施例中，用有机溶剂作为提取试剂，对待检测滋肾育胎丸进行提取处理包括：

将待检测滋肾育胎丸溶于有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤渣，收集滋肾育胎丸滤液，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

步骤(2)制备对照品：

制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液；

制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液；

制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液；

制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液。

本发明创造性地设置了滋肾育胎丸白术阴性对照品、白术对照、白术内酯Ⅰ对照、白术内酯Ⅱ对照和白术内酯Ⅲ对照，能够提高对滋肾育胎丸中白术的检测准确性。同理，设置滋肾育胎丸续断阴性对照品、续断对照和续断皂苷Ⅵ对照，能够提高对滋肾育胎丸中续断的检测准确性。同理，设置滋肾育胎丸何首乌阴性对照品、何首乌对照、大黄素对照和大黄素甲醚对照，能够提高对滋肾育胎丸中何首乌的检测准确性。同理，设置滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品和水晶兰苷对照，能够提高对滋肾育胎丸中巴戟天的检测准确性。

在其中一个实施例中，所述制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液包括：

将所述滋肾育胎丸白术阴性对照品溶解在有机溶剂中，且所采用的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液包括：

将所述滋肾育胎丸续断阴性对照品溶解在有机溶剂中，且所采用的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液包括：

将所述滋肾育胎丸何首乌阴性对照品溶解在有机溶剂中，且所采用的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

在其中一个实施例中，所述制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液包括：

将所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品溶于有机溶剂中，所采用的有机溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种。

进一步地，经发明人研究发现，在制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液的步骤之前，对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行柱层析梯度洗脱能够进一步提高对滋肾育胎丸中的白术的检测准确性。同理，在制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液的步骤之前，分别对滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱也能够进一步地对应提高对滋肾育胎丸中的续断、何首乌或巴戟天的检测准确性。

在其中一个实施例中，对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸白术阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇，优选地，所述的醇为甲醇；

对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸续断阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇，优选地，所述的醇为甲醇；

对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸何首乌阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇，优选地，所述的醇为甲醇；

对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品第一洗脱液，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，其中，所述的醇为甲醇或乙醇，优选地，所述的醇为甲醇。

在其中一个实施例中，对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱所采用的层析柱分别独立为C18色谱柱、ODS TUP柱或D101大孔树脂柱。

经发明人研究发现，对于已经对滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱的实施例而言，经发明人研究发现，将收集得到的各洗脱液进行浓缩和重新溶解更有利于后续进行薄层层析，更方便观察。

在其中一个实施例中，所述制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸白术阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸续断阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸何首乌阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品第一洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种。

另外，经发明人研究发现，在步骤(2)中，对于不对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱、不对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱、不对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱和不对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，直接制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液和制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液的步骤之前，采用水或有机溶剂作为提取试剂，对待检测滋肾育胎丸单一药材阴性对照品进行提取处理，能够进一步地除去较多杂质成分，进一步提高本发明的定性检测准确性和定量检测准确性。

在其中一个实施例中，用水作为提取试剂，对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行提取处理包括：

将滋肾育胎丸白术阴性对照品溶于水中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，收集滋肾育胎丸白术阴性对照品滤渣。

在其中一个实施例中，用有机溶剂作为提取试剂，对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行提取处理包括：

将滋肾育胎丸白术阴性对照品溶于有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤渣，收集滋肾育胎丸白术阴性对照品滤液，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

在其中一个实施例中，用水作为提取试剂，对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行提取处理包括：

将滋肾育胎丸续断阴性对照品溶于水中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，收集滋肾育胎丸续断阴性对照品滤渣。

在其中一个实施例中，用有机溶剂作为提取试剂，对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行提取处理包括：

将滋肾育胎丸续断阴性对照品溶于有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤渣，收集滋肾育胎丸续断阴性对照品滤液，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

在其中一个实施例中，用水作为提取试剂，对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行提取处理包括：

将滋肾育胎丸何首乌阴性对照品溶于水中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，收集滋肾育胎丸何首乌阴性对照品滤渣。

在其中一个实施例中，用有机溶剂作为提取试剂，对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行提取处理包括：

将滋肾育胎丸何首乌阴性对照品溶于有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤渣，收集滋肾育胎丸何首乌阴性对照品滤液，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

在其中一个实施例中，用水作为提取试剂，对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行提取处理包括：

将滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品溶于水中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品滤渣。

在其中一个实施例中，用有机溶剂作为提取试剂，对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行提取处理包括：

第一种：将所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品溶于有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品滤渣，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或几种的混合溶剂。或

第二种：将所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品溶于第三有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤渣，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品滤液，所述有机溶剂选自甲醇和乙醇中的一种或两种的混合溶剂。

同理，可以理解地，在对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱、对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱、对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱和对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱的步骤之前，同样采用水或有机溶剂作为提取试剂，对待检测滋肾育胎丸进行提取处理，也能够进一步地除去较多杂质成分，进一步提高本发明的定性检测准确性和定量检测准确性。对于同样的样品(即滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品)采用的提取处理方式与上文相同，在此不再赘述。

在其中一个实施例中，制备单一药材对照溶液和单一药材的主要活性成分对照溶液包括：

分别将白术、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ溶解在溶剂中，对应制备白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液，其中，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

分别将续断和续断皂苷Ⅵ溶解在溶剂中，对应制备续断对照溶液和续断皂苷VI对照溶液，其中，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

分别将何首乌、大黄素和大黄素甲醚溶解在溶剂中，对应制备何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液，其中，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

将水晶兰苷溶解在溶剂中，制备水晶兰苷对照溶液，其中，所述溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

在其中一个实施例中，在制备白术对照溶液、续断对照溶液以及何首乌对照溶液的步骤之前均还包括如下步骤：

采用水或有机溶剂作为提取试剂，分别对白术、续断以及何首乌进行提取处理。

在其中一个实施例中，用水作为提取试剂，所述提取处理包括：

分别将白术、续断、何首乌溶于所述水中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤液，分别对应收集白术滤渣、续断滤渣以及何首乌滤渣。

在其中一个实施例中，用有机溶剂作为提取试剂，所述提取处理包括：

分别将白术、续断、何首乌溶于第一有机溶剂中，进行超声提取或加热回流提取，过滤除去滤渣，分别对应收集白术滤液、续断滤液、何首乌滤液；

其中，所述第一有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液的浓度分别独立为20μg/ml～120μg/ml。

在其中一个实施例中，所述滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液的浓度分别独立为0.1mg/ml～1.5mg/ml；和/或

在其中一个实施例中，所述滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液的浓度分别独立为0.1mg/ml～1.5mg/ml。

在其中一个实施例中，所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液的浓度分别独立为0.5mg/ml～2mg/ml。

步骤(3)薄层层析：

(3-1)：将所述滋肾育胎丸第二洗脱液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液、白术内酯Ⅲ对照溶液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于展开剂中展开，取出，晾干，检视；

(3-2)：将所述滋肾育胎丸第一洗脱液、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于展开剂中展开，取出，晾干，检视。

本发明通过设置滋肾育胎丸单一药材阴性对照品、单一药材对照品、单一药材主要活性成分对照品，具体为滋肾育胎丸白术阴性对照品、白术对照、白术内酯Ⅰ对照、白术内酯Ⅱ对照、白术内酯Ⅲ对照、滋肾育胎丸续断阴性对照品、续断对照、续断皂苷Ⅵ对照、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品、何首乌对照、大黄素对照、大黄素甲醚对照、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品和水晶兰苷对照，完善了滋肾育胎丸中多味药材的薄层鉴别，能够更加全面地反映滋肾育胎丸的物质基础，提高了滋肾育胎丸质量控制的准确性和全面性，更有利于滋肾育胎丸质量标准的建立和整体评价。

在其中一个实施例中，步骤(3-1)包括：

将所述滋肾育胎丸第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-1洗脱液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第一展开剂中展开，取出，晾干，检视；

将所述滋肾育胎丸第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-2洗脱液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第二展开剂中展开，取出，晾干，检视；

将所所述滋肾育胎丸述第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-3洗脱液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第三展开剂中展开，取出，晾干，检视；

其中，所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸的混合溶剂；

所述第二展开剂为正丁醇、醋酸和水的混合溶剂，或所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的混合溶剂；

所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比(38-45)：(8-15)：(0.3-0.7)混合而成的混合溶剂，包括但不限于：38：8:0.3、38：8:0.4、38：8:0.5、38：8:0.6、38：8:0.7、38：9:0.3、38：9:0.4、38：9:0.5、38：9:0.6、38：9:0.7、38：10:0.3、38：10:0.4、38：10:0.5、38：10:0.6、38：10:0.7、38：11:0.3、38：11:0.4、38：11:0.5、38：11:0.6、38：11:0.7、38：12:0.3、38：12:0.4、38：12:0.5、38：12:0.6、38：12:0.7、38：13:0.3、38：13:0.4、38：13:0.5、38：13:0.6、38：13:0.7、38：14:0.3、38：14:0.4、38：14:0.5、38：14:0.6、38：14:0.7、38：15:0.3、38：15:0.4、38：15:0.5、38：15:0.6、38：15:0.7、39：8:0.3、39：8:0.4、39：8:0.5、39：8:0.6、39：8:0.7、39：9:0.3、39：9:0.4、39：9:0.5、39：9:0.6、39：9:0.7、39：10:0.3、39：10:0.4、39：10:0.5、39：10:0.6、39：10:0.7、39：11:0.3、39：11:0.4、39：11:0.5、39：11:0.6、39：11:0.7、39：12:0.3、39：12:0.4、39：12:0.5、39：12:0.6、39：12:0.7、39：13:0.3、39：13:0.4、39：13:0.5、39：13:0.6、39：13:0.7、39：14:0.3、39：14:0.4、39：14:0.5、39：14:0.6、39：14:0.7、39：15:0.3、39：15:0.4、39：15:0.5、39：15:0.6、39：15:0.7、40：8:0.3、40：8:0.4、40：8:0.5、40：8:0.6、40：8:0.7、40：9:0.3、40：9:0.4、40：9:0.5、40：9:0.6、40：9:0.7、40：10:0.3、40：10:0.4、40：10:0.5、40：10:0.6、40：10:0.7、40：11:0.3、40：11:0.4、40：11:0.5、40：11:0.6、40：11:0.7、40：12:0.3、40：12:0.4、40：12:0.5、40：12:0.6、40：12:0.7、40：13:0.3、40：13:0.4、40：13:0.5、40：13:0.6、40：13:0.7、40：14:0.3、40：14:0.4、40：14:0.5、40：14:0.6、40：14:0.7、40：15:0.3、40：15:0.4、40：15:0.5、40：15:0.6、40：15:0.7、41：8:0.3、41：8:0.4、41：8:0.5、41：8:0.6、41：8:0.7、41：9:0.3、41：9:0.4、41：9:0.5、41：9:0.6、41：9:0.7、41：10:0.3、41：10:0.4、41：10:0.5、41：10:0.6、41：10:0.7、41：11:0.3、41：11:0.4、41：11:0.5、41：11:0.6、41：11:0.7、41：12:0.3、41：12:0.4、41：12:0.5、41：12:0.6、41：12:0.7、41：13:0.3、41：13:0.4、41：13:0.5、41：13:0.6、41：13:0.7、41：14:0.3、41：14:0.4、41：14:0.5、41：14:0.6、41：14:0.7、41：15:0.3、41：15:0.4、41：15:0.5、41：15:0.6、41：15:0.7、42：8:0.3、42：8:0.4、42：8:0.5、42：8:0.6、42：8:0.7、42：9:0.3、42：9:0.4、42：9:0.5、42：9:0.6、42：9:0.7、42：10:0.3、42：10:0.4、42：10:0.5、42：10:0.6、42：10:0.7、42：11:0.3、42：11:0.4、42：11:0.5、42：11:0.6、42：11:0.7、42：12:0.3、42：12:0.4、42：12:0.5、42：12:0.6、42：12:0.7、42：13:0.3、42：13:0.4、42：13:0.5、42：13:0.6、42：13:0.7、42：14:0.3、42：14:0.4、42：14:0.5、42：14:0.6、42：14:0.7、42：15:0.3、42：15:0.4、42：15:0.5、42：15:0.6、42：15:0.7、45：8：0.3和45：15：0.7。

优选地，所述第一展开剂为所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比(40-42)：(8-10)：(0.4-0.5)混合而成的混合溶剂。进一步地，所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比40：10:0.5混合而成的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述第二展开剂为为正丁醇、醋酸和水按照体积比(3-5)：(0.8-1.2)：(3-7)混合而成的混合溶剂，包括但不限于：3：0.8:3、3：0.8:4、3：0.8:5、3：0.8:6、3：0.8:7、3：0.9:3、3：0.9:4、3：0.9:5、3：0.9:6、3：0.9:7、3：1.0:3、3：1.0:4、3：1.0:5、3：1.0:6、3：1.0:7、3：1.1:3、3：1.1:4、3：1.1:5、3：1.1:6、3：1.1:7、3：1.2:3、3：1.2:4、3：1.2:5、3：1.2:6、3：1.2:7、4：0.8:3、4：0.8:4、4：0.8:5、4：0.8:6、4：0.8:7、4：0.9:3、4：0.9:4、4：0.9:5、4：0.9:6、4：0.9:7、4：1.0:3、4：1.0:4、4：1.0:5、4：1.0:6、4：1.0:7、4：1.1:3、4：1.1:4、4：1.1:5、4：1.1:6、4：1.1:7、4：1.2:3、4：1.2:4、4：1.2:5、4：1.2:6、4：1.2:7、5：0.8:3、5：0.8:4、5：0.8:5、5：0.8:6、5：0.8:7、4：0.9:3、5：0.9:4、5：0.9:5、5：0.9:6、5：0.9:7、5：1.0:3、5：1.0:4、5：1.0:5、5：1.0:6、5：1.0:7、5：1.1:3、5：1.1:4、5：1.1:5、5：1.1:6、5：1.1:7、5：1.2:3、5：1.2:4、5：1.2:5、5：1.2:6和5：1.2:7。优选地，所述第二展开剂为正丁醇、醋酸和水按照体积比(4-5)：(0.8-1)：(5-7)混合而成的混合溶剂。进一步地，所述第二展开剂为正丁醇、醋酸和水按照体积比4：1：5混合而成的混合溶剂。

在另一个实施例中，所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比(12-18)：(38-42)：(20-25)：(8-12)混合而成的混合溶剂，包括但不限于：12：38：20：8、12：38：20：9、12：38：20：10、12：38：20：11、12：38：20：12、12：39：21：10、12：39：21：11、12：39：21：12、12：39：22：8、12：39：22：9、12：39：22：10、12：39：22：11、12：39：22：12、12：39：25：8、12：39：25：9、12：39：25：10、12：39：25：11、12：39：25：12、12：40：20：8、12：40：20：9、12：40：20：10、12：40：20：11、12：40：20：12、12：41：20：8、12：41：20：9、12：41：20：10、12：41：20：11、12：41：20：12、12：41：22：8、12：41：22：9、12：41：22：10、12：41：22：11、12：41：22：12、12：42：22：8、12：42：22：9、12：42：22：10、12：42：22：11、12：42：22：12、

15：38：21：8、15：38：21：9、15：38：21：10、15：38：21：11、15：38：21：15、12：38：22：8、15：38：22：9、15：38：22：10、15：38：22：11、15：38：22：12、15：38：25：8、15：38：25：9、15：38：25：10、15：38：25：11、15：38：25：12、15：39：20：8、15：39：20：9、15：39：20：10、15：39：20：11、15：39：20：12、15：39：21：8、15：39：21：9、18：42：25：8、18：42：20：8、18：38：25：8和18：42：25：12。

优选地，所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比(12-15)：(40-42)：(20-22)：(8-10)混合而成的混合溶剂。进一步地，所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比15:40:22:10混合而成的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比(8-12)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.05-0.15)混合而成的混合溶剂，包括但不限于：8：0.8：0.8：0.05、8：0.8：0.8：0.06、8：0.8：0.8：0.07、8：0.8：0.8：0.08、8：0.8：0.8：0.09、8：0.8：0.8：0.10、8：0.8：0.8：0.11、8：0.8：0.8：0.12、8：0.8：0.8：0.13、8：0.8：0.8：0.14、8：0.8：0.8：0.15、8：0.8：0.9：0.05、8：0.8：0.9：0.06、8：0.8：0.9：0.07、8：0.8：0.9：0.08、8：0.8：0.9：0.09、8：0.8：0.9：0.10、8：0.8：0.9：0.11、8：0.8：0.9：0.12、8：0.8：0.9：0.13、8：0.8：0.9：0.14、8：0.8：0.9：0.15、10：0.8：0.9：0.05、10：0.8：0.9：0.06、10：0.8：0.9：0.07、10：0.8：0.9：0.08、10：0.8：0.9：0.09、10：0.8：0.9：0.10、10：0.8：0.9：0.11、10：0.8：0.9：0.12、10：0.8：0.9：0.13、10：0.8：0.9：0.14、10：0.8：0.9：0.15、10：0.9：0.9：0.05、10：0.9：0.9：0.06、10：0.9：0.9：0.07、10：0.9：0.9：0.08、10：0.9：0.9：0.09、10：0.9：0.9：0.10、10：1：1：0.11、10：1：1：0.12、10：1：1：0.13、10：1：1：0.14、10：1：1：0.15、10：1：1：0.09、10：1：1：0.1、10：1：1：0.11、10：1：1：0.12、10：1：1：0.13、10：1：1：0.14、10：1：1：0.15、12：1：1：0.05和12：1：0.8：0.15。

优选地，所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比(10-12)：(0.8-1)：(0.8-1)：(0.05-0.1)混合而成的混合溶剂。进一步地，所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比10：1：1：0.1混合而成的混合溶剂。

在其中一个实施例中，步骤(3-1)中还包括对晾干后的各个所述硅胶G固定相进行显色处理，然后在100℃～105℃条件下加热至斑点清晰的步骤。

在其中一个实施例中，步骤(3-1)中各显色处理所采用的显色剂均为硫酸质量占比为9.5％～10.5％的硫酸乙醇溶液。

在其中一个实施例中，在步骤(3-1)中，各检视的条件分别独立为紫外灯下365nm、日光灯或自然光。

在其中一个实施例中，在步骤(3-1)中，针对白术或何首乌的检视条件为紫外灯下365nm，针对续断的检视条件为紫外灯下365nm。

在其中一个实施例中，步骤(3-2)所采用的展开剂为第四展开剂，所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸的混合溶剂。

在其中一个实施例中，所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸按照体积比(5-8)：(2-4)：(0.3-1.2)：(0.3-1.2)混合而成的混合溶剂，包括但不限于：5：2：0.3：0.3、5：2：0.3：0.4、5：2：0.3：0.5、5：2：0.3：0.6、5：2：0.3：0.7、5：2：0.3：0.8、5：2：0.3：0.9、5：2：0.3：1.0、5：2：0.3：1.1、5：2：0.3：1.2、5：4：0.3：0.3、5：4：0.3：0.4、5：4：0.3：0.5、5：4：0.8：0.6、5：4：0.8：0.7、5：4：0.9：0.8、5：4：1.2：0.9、5：4：1.0：1.0、5：4：0.3：0.8、5：4：0.3：1.2、7：3：0.3：0.3、7：3：0.3：0.4、7：3：0.3：0.5、7：3：0.3：0.6、7：3：0.3：0.7、7：3：0.3：0.8、7：3：0.3：0.9、7：3：0.3：1.0、7：3：0.3：1.1、7：3：0.3：1.2、7：3：0.5：0.3、7：3：0.5：0.4、7：3：0.5：0.5、7：3：0.5：0.6、7：3：0.5：0.7、7：3：0.5：0.8、7：3：0.5：0.9、7：3：0.5：1.0、7：3：1：0.3、7：3：1：0.4、7：3：1：0.5、7：3：1：0.6、7：3：1：0.7、7：3：1：0.8、7：3：1：0.9、7：3：1：1.0、7：3：1：1.1和7：3：1：1.2。

优选地，所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸按照体积比(6-7)：(2-3)：(0.5-1)：(0.5-1)混合而成的混合溶剂。进一步地，所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸按照体积比7：3：1：1混合而成的混合溶剂，或所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸按照体积比7：3：0.5：0.5混合而成的混合溶剂。

在其中一个实施例中，步骤(3-2)中还包括对晾干后的所述硅胶G固定相进行显色处理，然后在100℃～105℃条件下加热至斑点清晰的步骤。

在其中一个实施例中，步骤(3-2)中的显色处理所采用的显色剂均为硫酸质量占比为9.5％～10.5％的硫酸乙醇溶液。

在其中一个实施例中，步骤(3-2)针对巴戟天的检视条件为日光灯或自然光。

在其中一个实施例中，本发明的技术方案如下：

一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，包括如下步骤：

(1)制备滋肾育胎丸供试品溶液：

(1-1)采用水或有机溶剂作为提取试剂，对待检测滋肾育胎丸进行提取处理，制得滋肾育胎丸粗提物；

(1-2)对滋肾育胎丸粗提物进行柱层析梯度洗脱：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸第一洗脱液；

所述以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸第二洗脱液的步骤包括：

以醇体积占比为40％～60％的醇水混合溶剂为第二-1洗脱剂进行第二-1洗脱，收集滋肾育胎丸第二-1洗脱液；

以醇体积占比为60％～80％的醇水混合溶剂为第二-2洗脱剂进行第二-2洗脱，收集滋肾育胎丸第二-2洗脱液；

以醇体积占比为80％～100％的醇水混合溶剂为第二-3洗脱剂进行第二-3洗脱，收集滋肾育胎丸第二-3洗脱液。

其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

(1-3)对所述滋肾育胎丸第一洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第一供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种，所述滋肾育胎丸第一供试品溶液的浓度为0.5mg/ml～2mg/ml；

对所述滋肾育胎丸第二-1洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二-1供试品溶液，对所述滋肾育胎丸第二-2洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二-2供试品溶液，对所述滋肾育胎丸第二-3洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二-3供试品溶液，各溶解所采用的溶剂分别独立为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

(2)制备对照溶液：

(2-1)采用水或有机溶剂作为提取试剂，分别对滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行提取处理；

(2-2)对滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱：

其中，对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸白术阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸续断阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸何首乌阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0％～40％的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品第一洗脱液，再以醇体积占比为40％～100％的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

(2-3)制备滋肾育胎丸单一药材阴性对照溶液：

(2-3-1)制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液：

对所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品第一洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种；

(2-3-2)制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液：

对所述滋肾育胎丸白术阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

(2-3-3)制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸续断阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

(2-3-4)制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸何首乌阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

(2-4)制备单一药材对照溶液和单一药材的主要活性成分对照溶液：

分别对白术、续断、何首乌和巴戟天进行提取处理；

分别将提取后的白术、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、提取后的续断、续断皂苷Ⅵ、提取后的何首乌、大黄素和大黄素甲醚溶解在溶剂中，对应制备白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液、白术内酯Ⅲ对照溶液、续断对照溶液、续断皂苷VI对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液，其中，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

将水晶兰苷溶解在溶剂中，制备水晶兰苷对照溶液，其中，所述溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

(3)薄层层析：

(3-1)：

将具有第一浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液或滋肾育胎丸第二-1供试品溶液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第一展开剂中展开，取出，晾干，显色，紫外灯下365nm检视；

将具有第二浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液或滋肾育胎丸第二-2供试品溶液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第二展开剂中展开，取出，晾干，显色，日光灯或自然光下检视；

将具有第二浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液或滋肾育胎丸第二-3供试品溶液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第三展开剂中展开，取出，晾干，显色，紫外灯下365nm检视；

(3-2)：将所述滋肾育胎丸第一供试品溶液、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于展开剂中展开，取出，晾干，显色，日光灯或自然光下检视。

具体实施例

以下结合具体实施例本发明作进一步详细说明。

实施例1

本实施例提供一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，步骤如下：

(1)制备供试品溶液：

(1-1)对滋肾育胎丸进行提取：

取滋肾育胎丸研细，称取粉末2g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇10ml溶解；

(1-2)对提取后的滋肾育胎丸产物进行柱层析梯度洗脱：

取预先活化的C-18E(55μm，70A)固相小柱，活化的方式为依次加入100％甲醇10ml、60％甲醇10ml、纯化水10ml洗脱，弃去洗脱液。活化处理后，将样品加入到固相小柱，完成上样后，依次用20ml水(甲醇为0％)、20ml甲醇体积占比为60％的甲醇-水混合溶剂、20ml甲醇(甲醇体积占比为100％)，对应收集甲醇体积占比为0％阶段的洗脱液，蒸干，残渣加入甲醇1ml溶解，得到作为针对巴戟天进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液，收集甲醇体积占比为60％阶段的洗脱液，蒸干，残渣加入甲醇1ml溶解，得到作为针对续断进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液，以及收集甲醇体积占比为100％阶段的洗脱液，蒸干，50％质量的残渣加1ml甲醇溶解，得到作为针对白术进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液，另外50％质量的残渣加1ml甲醇溶解，作为针对何首乌进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液。

(2)制备对照品溶液：

(2-1)制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液：

(2-1-1)制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸白术阴性对照品研细，称取粉末2g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇10ml溶解，按照步骤(1-2)同样的洗脱方法对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，弃去甲醇体积占比为0％以及60％阶段的洗脱液，收集甲醇体积占比为100％的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到滋肾育胎丸白术阴性对照溶液；

(2-1-2)制备白术对照溶液：

取白术作为对照药材0.5g，加二氯甲烷10ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇2ml溶解，制成白术对照溶液；

(2-1-3)制备白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液：

分别精密称取白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ对照品，加入甲醇，对应制备成50μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液。

(2-2)制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷VI对照溶液：

(2-2-1)制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸续断阴性对照品研细，称取粉末2g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇10ml溶解，按照步骤(1-2)同样的洗脱方法对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，弃去甲醇体积占比为0％以及100％阶段的洗脱液，收集甲醇体积占比为60％的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到滋肾育胎丸续断阴性对照溶液；

(2-2-2)制备续断对照溶液：

取续断作为对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇2ml溶解，制成续断对照溶液；

(2-2-3)制备续断皂苷VI对照溶液：

精密称取续断皂苷VI对照品，加入甲醇，制备成1ml/mg的续断皂苷VI对照溶液。

(2-3)制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素溶液和大黄素甲醚对照溶液：

(2-3-1)制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸何首乌阴性对照品研细，称取粉末2g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇10ml溶解，按照步骤(1-2)同样的洗脱方法对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，弃去甲醇体积占比为0％以及60％阶段的洗脱液，收集甲醇体积占比为100％的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液；

(2-3-2)制备何首乌对照溶液：

取何首乌作为对照药材0.5g，加入乙醇25ml，超声提取30min后滤液浓缩至1ml制成何首乌对照溶液；

(2-3-3)制备大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液：

分别精密称取大黄素对照品、大黄素甲醚对照品，加入甲醇，对应制备成0.15mg/ml的大黄素对照溶液和1mg/ml大黄素甲醚对照溶液。

(2-4)制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液：

(2-4-1)制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品细粉5g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加水30ml溶解，将溶液转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次(30、20、20ml)，合并乙酸乙酯液，减压回收，残渣加水10ml溶解，按照步骤(1-2)同样的洗脱方法对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，弃去甲醇体积占比为60％以及100％阶段的洗脱液，收集甲醇体积占比为0％的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液；

(2-4-2)制备水晶兰苷对照溶液：

精密称取水晶兰苷对照品，加入水，制备成1mg/ml的水晶兰苷对照溶液。

(3)薄层层析：

(3-1-1)针对滋肾育胎丸中的白术进行检测：

照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取针对白术进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液和滋肾育胎丸滋肾育胎丸白术阴性对照溶液各20μl，白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液、白术内酯Ⅲ对照溶液各10μl点于同一MERCK硅胶G板和同一青岛海洋硅胶G板，(其中青岛海洋板105℃烘干1h活化处理)，展开剂选择正己烷-乙酸乙酯-甲酸(40:10:0.5)，展开，取出，晾干，喷10％硫酸乙醇显色，105℃加热至斑点清晰，紫外灯下365nm检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

图1为滋肾育胎丸中白术的检测结果，图1(a)为MERCK高效硅胶G薄层板，图1(b)为青岛海洋硅胶G板，其中，0、1、2、3、4、5分别为滋肾育胎丸供试品、白术对照药材、滋肾育胎丸阴性对照品、白术内酯Ⅰ对照品、白术内酯Ⅱ对照品、白术内酯Ⅲ对照品。

(3-1-2)针对滋肾育胎丸中的续断进行检测：

照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取针对续断进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液20μl、滋肾育胎丸滋肾育胎丸续断阴性对照溶液20μl、续断皂苷VI对照溶液和续断对照溶液各5μl，分别点于同一MERCK高效硅胶G板和同一青岛海洋硅胶G板，以正丁醇-醋酸-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，与对照品色谱同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

图2为滋肾育胎丸中续断的检测结果，图2(a)为MERCK高效硅胶G板，图2(b)为青岛海洋硅胶G板，其中，0、1、2、3分别为滋肾育胎丸供试品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、续断对照药材、续断皂苷Ⅵ对照品。

(3-1-3)针对滋肾育胎丸中的何首乌进行检测：

分别吸取滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液10μl、针对何首乌进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液10μl、何首乌对照溶液10μl，大黄素对照溶液5μl，大黄素甲醚对照溶液5μl，点于同一MERCK高效硅胶G板和同一青岛海洋硅胶G板，采用10*20硅胶板竖着展开，展开剂为环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(10:1:1:0.1)，展距约为15cm，紫外灯下365nm检视，供试品色谱中，与对照品色谱同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

图3为滋肾育胎丸中何首乌的检测结果，图3(a)为MERCK高效硅胶G板，图3(b)右边为青岛海洋硅胶G板，1为滋肾育胎丸何首乌阴性对照品，2为滋肾育胎丸，3为制首乌对照药材，4为大黄素对照品，5为大黄素甲醚对照品。

(3-2)针对滋肾育胎丸中的巴戟天进行检测：

照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取针对巴戟天进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液20μl、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液20μl、水晶兰苷对照溶液3μl，点于同一MERCK高效硅胶G板，以三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸(7：3：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，与对照品色谱同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

图4为滋肾育胎丸中巴戟天的检测结果，0，1，2分别为水晶兰苷对照品，滋肾育胎丸，滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品。

实施例2

本实施例提供一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，步骤如下：

(1)制备供试品溶液：

(1-1)对滋肾育胎丸进行提取：

取滋肾育胎丸研细，称取粉末2g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇10ml溶解；

(1-2)对提取后的滋肾育胎丸产物进行柱层析梯度洗脱：

取预先活化的C-18E(55μm，70A)固相小柱，活化的方式为依次加入100％甲醇10ml、60％甲醇10ml、纯化水10ml洗脱，弃去洗脱液。活化处理后，将样品加入到固相小柱，完成上样后，依次用20ml水(甲醇为0％)、20ml甲醇体积占比为40％的甲醇-水混合溶剂、20ml甲醇体积占比为60％的甲醇-水混合溶剂、20ml甲醇体积占比为80％的甲醇-水混合溶剂，对应收集甲醇体积占比为0％阶段的洗脱液，蒸干，残渣加入甲醇1ml溶解，得到作为针对巴戟天进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液，收集甲醇体积占比为40％阶段的洗脱液，蒸干，50％质量的残渣加1ml甲醇溶解，得到作为针对白术进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液，收集甲醇体积占比为60％阶段的洗脱液，蒸干，残渣加入甲醇1ml溶解，得到作为针对续断进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液，以及收集甲醇体积占比为80％阶段的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，作为针对何首乌进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液。

(2)制备对照品溶液：

(2-1)制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液：

(2-1-1)制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸白术阴性对照品研细，称取粉末2g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇10ml溶解，按照步骤(1-2)同样的洗脱方法对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，弃去甲醇体积占比为0％、60％以及80％阶段的洗脱液，收集甲醇体积占比为40％的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到滋肾育胎丸白术阴性对照溶液；

(2-1-2)制备白术对照溶液：

取白术作为对照药材0.5g，加二氯甲烷10ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇2ml溶解，制成白术对照溶液；

(2-1-3)制备白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液：

分别精密称取白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ对照品，加入甲醇，对应制备成50μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液。

(2-2)制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷VI对照溶液：

(2-2-1)制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸续断阴性对照品研细，称取粉末2g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇10ml溶解，按照步骤(1-2)同样的洗脱方法对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，弃去甲醇体积占比为0％、40％以及80％阶段的洗脱液，收集甲醇体积占比为60％的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到滋肾育胎丸续断阴性对照溶液；

(2-2-2)制备续断对照溶液：

取续断作为对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇2ml溶解，制成续断对照溶液；

(2-2-3)制备续断皂苷VI对照溶液：

精密称取续断皂苷VI对照品，加入甲醇，制备成1ml/mg的续断皂苷VI对照溶液。

(2-3)制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素溶液和大黄素甲醚对照溶液：

(2-3-1)制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸何首乌阴性对照品研细，称取粉末2g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加甲醇10ml溶解，按照步骤(1-2)同样的洗脱方法对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，弃去甲醇体积占比为0％、40％以及60％阶段的洗脱液，收集甲醇体积占比为80％的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液；

(2-3-2)制备何首乌对照溶液：

取何首乌作为对照药材0.5g，加入乙醇25ml，超声提取30min后滤液浓缩至1ml制成何首乌对照溶液；

(2-3-3)制备大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液：

分别精密称取大黄素对照品、大黄素甲醚对照品，加入甲醇，对应制备成0.15mg/ml的大黄素对照溶液和1mg/ml大黄素甲醚对照溶液。

(2-4)制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液：

(2-4-1)制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸细粉5g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加水30ml溶解，将溶液转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次(30、20、20ml)，合并乙酸乙酯液，减压回收，残渣加水10ml溶解，按照步骤(1-2)同样的洗脱方法对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱，弃去甲醇体积占比为40％、60％以及80％阶段的洗脱液，收集甲醇体积占比为0％的洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液；

(2-4-2)制备水晶兰苷对照溶液：

精密称取水晶兰苷对照品，加入水，制备成1mg/ml的水晶兰苷对照溶液。

(3)薄层层析：

(3-1-1)针对滋肾育胎丸中的白术进行检测：

照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取针对白术进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液和滋肾育胎丸滋肾育胎丸白术阴性对照溶液各20μl，白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液、白术内酯Ⅲ对照溶液各10μl点于MERCK硅胶G板和青岛海洋硅胶G板，(其中青岛海洋板105℃烘干1h活化处理)，展开剂选择正己烷-乙酸乙酯-甲酸(40:10:0.5)，展开，取出，晾干，喷10％硫酸乙醇显色，105℃加热至斑点清晰，紫外灯下365nm检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

(3-1-2)针对滋肾育胎丸中的续断进行检测：

照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取针对续断进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液20μl、滋肾育胎丸滋肾育胎丸续断阴性对照溶液20μl、续断皂苷VI对照溶液和续断对照溶液各5μl，分别点于同一MERCK高效硅胶G板和同一青岛海洋硅胶G板，以正丁醇-醋酸-水(4：1：5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，与对照品色谱同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

(3-1-3)针对滋肾育胎丸中的何首乌进行检测：

分别吸取滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液20μl、针对何首乌进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液20μl、何首乌对照溶液10μl，大黄素对照溶液5μl，大黄素甲醚对照溶液5μl，点于点于同一MERCK高效硅胶G板和同一青岛海洋硅胶G板上，展开剂系统均为环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(10：1：1：0.1)，紫外灯下365nm检视，供试品溶液与对照药材溶液、对照品溶液在同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

图5为滋肾育胎丸中何首乌的检测结果，图5(a)为MERCK高效硅胶G板，图5(b)为青岛海洋硅胶G板，其中，0、1、2、3、4、分别为滋肾育胎丸、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品、何首乌对照药材、大黄素对照品和大黄素甲醚对照品。

(3-2)针对滋肾育胎丸中的巴戟天进行检测：

照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取针对巴戟天进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液20μl、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液20μl、水晶兰苷对照溶液3μl，点于MERCK高效硅胶G薄层板，以三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸(7：3：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，与对照品色谱同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

实施例3

本实施例提供一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，与实施例2基本相同，区别在于，将实施例2各柱层析梯度洗脱所采用的C-18E(55μm，70A)固相小柱全部替换为StrataC18-E柱，并将针对续断进行检测所使用的展开剂系统替换为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10℃以下放置12h的下层溶液，点样量均为10μl，固定相为merckmerckmerck硅胶G板和青岛海洋硅胶G板，显色剂为10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，与对照品、对照药材色谱同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

实施例4

本实施例提供一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，与实施例2基本相同，区别在于，将实施例2各柱层析梯度洗脱所采用的C-18E(55μm，70A)固相小柱全部替换为StrataC18-E柱，并将针对续断进行检测所使用的展开剂系统替换为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10℃以下放置12h的下层溶液，点样量均为10μl，固定相为merckmerckmerck硅胶G板和青岛海洋硅胶G板，显色剂为10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，与对照品、对照药材色谱同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

实施例5

本实施例提供一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，与实施例2基本相同，区别在于，将实施例2各柱层析梯度洗脱所采用的C-18E(55μm，70A)固相小柱全部替换为StrataC18-E柱，并将针对续断进行检测所使用的展开剂系统替换为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10℃以下放置12h的下层溶液，点样量均为10μl，固定相为merckmerckmerck硅胶G板和青岛海洋硅胶G板，显色剂为10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，与对照品、对照药材色谱同一位置显示相同颜色斑点，阴性样品无干扰。

将实施例3至实施例5种3种柱子得到的样品点样于同一固定相，图6为实施例3至实施例5针对滋肾育胎丸中续断的检测结果，固定相为merck merckmerck硅胶G板，1表示经Strata C18-E柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸供试品，2表示经ODS TUP柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸供试品，3表示经Cleanert S C18柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸供试品，4和8都表示续断皂苷VI对照品，5、6和7都表示续断对照药材，9表示经Strata C18-E柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸续断阴性对照品，9表示经ODS TUP柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸续断阴性对照品，11表示经Cleanert S C18柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸续断阴性对照品。

将实施例3至实施例5种3种柱子得到的样品点样于同一固定相，图7为实施例3至实施例5针对滋肾育胎丸中续断的检测结果，固定相为青岛海洋硅胶G板，1表示经StrataC18-E柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸供试品，2表示经ODS TUP柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸供试品，3表示经Cleanert S C18柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸供试品，4和8都表示续断皂苷VI对照品，5、6和7都表示续断对照药材，9表示经Strata C18-E柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸续断阴性对照品，9表示经ODS TUP柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸续断阴性对照品，11表示经Cleanert S C18柱洗脱、后续制备的滋肾育胎丸续断阴性对照品。

结合实施例3至实施例5可知，固相小柱的品牌和类型不影响结果的判断，说明本发明可采用不同的硅胶柱作为各柱层析梯度洗脱所采用的固定相。

实施例6

本实施例提供一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，与实施例2基本相同，区别在于，步骤(1-1)为：取滋肾育胎丸研细，称取15g，加二氯甲烷75ml，回流提取1h，滤过，滤渣挥干，加80％甲醇150ml，超声45min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解；步骤(1-2)为：采用D101大孔树脂柱作为固定相(内径为2.0cm，柱高为40cm，预处理：依次用乙醇洗和水洗)，用水300ml洗脱，前100ml洗脱液弃去，收集后200ml洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为针对巴戟天进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液。

(2-4-1)制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液：

取滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品细粉5g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干得残渣，残渣加水30ml溶解，将溶液转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次(30、20、20ml)，合并乙酸乙酯液，减压回收，残渣加水10ml溶解，采用D101大孔树脂柱作为固定相(内径为2.0cm，柱高为40cm，预处理：依次用乙醇洗和水洗)，用300ml水洗脱，前100ml洗脱液弃去，收集后200ml洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为针对巴戟天进行检测的1号滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液；另外再用100ml乙醇洗脱固定相，收集洗脱液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制备得到2号滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液；

步骤(3-2)为：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取针对巴戟天进行检测的滋肾育胎丸供试品溶液10μl、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液10μl、水晶兰苷对照溶液3μl，分别点于同一Merck硅胶G板上或或同一青岛海洋硅胶G板，以三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸(7：3：0.5：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，l00℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。

图8为滋肾育胎丸中巴戟天的检测结果，固定相为Merck硅胶G板，0为2号滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品，1为水晶兰苷对照品，2为滋肾育胎丸，3为1号滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品。

图9为滋肾育胎丸中巴戟天的检测结果，固定相为青岛海洋硅胶G板，1为滋肾育胎丸，2为滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品，3为水晶兰苷对照品。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书和附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (8)

1.一种滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱：

以醇体积占比为0%～40%的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸第一洗脱液；

以醇体积占比为40%～60%的醇水混合溶剂为第二-1洗脱剂进行第二-1洗脱，收集滋肾育胎丸第二-1洗脱液；

以醇体积占比为60%～80%的醇水混合溶剂为第二-2洗脱剂进行第二-2洗脱，收集滋肾育胎丸第二-2洗脱液；

以醇体积占比为80%～100%的醇水混合溶剂为第二-3洗脱剂进行第二-3洗脱，收集滋肾育胎丸第二-3洗脱液；

其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

（2）制备对照品：

制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液；

制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液；

制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液；

制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液；

（3）薄层层析：

（3-1）：将所述滋肾育胎丸第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-1洗脱液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第一展开剂中展开，取出，晾干，检视；

将所述滋肾育胎丸第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-2洗脱液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第二展开剂中展开，取出，晾干，检视；

将所所述滋肾育胎丸述第二洗脱液或滋肾育胎丸第二-3洗脱液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于第三展开剂中展开，取出，晾干，检视；

其中，所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸的混合物；

所述第二展开剂为正丁醇、醋酸和水的混合物，或所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的混合物；

所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸的混合物；

（3-2）：将所述滋肾育胎丸第一洗脱液、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液点样于同一硅胶G固定相，于展开剂中展开，取出，晾干，检视。

2.根据权利要求1所述的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，其特征在于，步骤（3-2）所采用的展开剂为第四展开剂，所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸的混合物。

3.根据权利要求2所述的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述第一展开剂为正己烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比（38-45）：（8-15）：（0.3-0.7）混合而成的混合溶剂；和/或

所述第二展开剂为正丁醇、醋酸和水按照体积比（3-5）：（0.8-1.2）：（3-7）混合而成的混合溶剂，或所述第二展开剂为三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比（12-18）：（38-42）：（20-25）：（8-12）混合而成的混合溶剂；和/或

所述第三展开剂为环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲酸按照体积比（8-12）：（0.8-1.2）：（0.8-1.2）：（0.05-0.15）混合而成的混合物；和/或

所述第四展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰醋酸按照体积比（5-8）：（2-4）：（0.3-1.2）：（0.3-1.2）混合而成的混合物。

4.根据权利要求1至3任一项所述的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，其特征在于，还包括分别对滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品和滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱的步骤：

其中，对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0%～40%的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40%～100%的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸白术阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0%～40%的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再 以醇体积占比为40%～100%的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸续断阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0%～40%的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，再以醇体积占比为40%～100%的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，收集滋肾育胎丸何首乌阴性对照品第二洗脱液，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；

对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱包括：

以醇体积占比为0%～40%的醇水混合溶剂为第一洗脱剂进行第一洗脱，收集滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品第一洗脱液，再以醇体积占比为40%～100%的醇水混合溶剂为第二洗脱剂进行第二洗脱，其中，所述的醇为甲醇或乙醇；和/或

各柱层析梯度洗脱所采用的层析柱分别独立为C18色谱柱、ODS TUP柱或D101大孔树脂柱。

5.根据权利要求4所述的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，其特征在于，在所述收集滋肾育胎丸第一洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第一洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第一供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种；

在所述收集滋肾育胎丸第二洗脱液的步骤之后，还包括对所述滋肾育胎丸第二洗脱液进行浓缩，溶解制备滋肾育胎丸第二供试品溶液的步骤，溶解所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；和/或

所述制备滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品第一洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种；

所述制备滋肾育胎丸白术阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸白术阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸续断阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸续断阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；

所述制备滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液包括：

对所述滋肾育胎丸何首乌阴性对照品第二洗脱液进行浓缩和溶解处理，且溶解处理所采用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂。

6.根据权利要求5所述的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述滋肾育胎丸第二供试品溶液具有两种浓度范围；

具有第一浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液、滋肾育胎丸白术阴性对照溶液、白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液和白术内酯Ⅲ对照溶液的浓度分别独立为20μg/ml～120μg/ml；和/或

具有第二浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液、滋肾育胎丸续断阴性对照溶液、续断对照溶液和续断皂苷Ⅵ对照溶液的浓度分别独立为0.1mg/ml～1.5mg/ml；和/或

具有第二浓度的所述滋肾育胎丸第二供试品溶液、滋肾育胎丸何首乌阴性对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液的浓度分别独立为0.1mg/ml～1.5mg/ml；和/或

所述滋肾育胎丸第一供试品溶液、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照溶液和水晶兰苷对照溶液的浓度分别独立为0.5mg/ml～2mg/ml；和/或

所述白术对照溶液、白术内酯Ⅰ对照溶液、白术内酯Ⅱ对照溶液、白术内酯Ⅲ对照溶液、续断对照溶液、续断皂苷Ⅵ对照溶液、何首乌对照溶液、大黄素对照溶液和大黄素甲醚对照溶液中的溶剂分别独立为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的一种或几种的混合溶剂；和/或

所述水晶兰苷对照溶液中的溶剂选自水、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的至少一种。

7.根据权利要求1至3任一项所述的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，其特征在于，步骤（3-1）和（3-2）中还包括对晾干后的各个所述硅胶G固定相进行显色处理，然后在100℃～105℃条件下加热至斑点清晰的步骤；和/或

各显色处理所采用的显色剂均为硫酸质量占比为9.5%～10.5%的硫酸乙醇溶液；和/或

在步骤（3-1）中，各检视的条件分别独立为紫外灯下365nm、日光灯或自然光；

在步骤（3-2）中，检视的条件为日光灯或自然光。

8.根据权利要求4所述的滋肾育胎丸的薄层色谱检测方法，其特征在于，在对待检测滋肾育胎丸进行柱层析梯度洗脱、对滋肾育胎丸白术阴性对照品进行梯度洗脱、对滋肾育胎丸续断阴性对照品进行柱层析梯度洗脱、对滋肾育胎丸何首乌阴性对照品进行柱层析梯度洗脱和对滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品进行柱层析梯度洗脱、制备白术对照溶液、制备续断对照溶液以及制备何首乌对照溶液的步骤之前均还包括如下步骤：

采用水或有机溶剂作为提取试剂，分别对待检测滋肾育胎丸、滋肾育胎丸白术阴性对照品、滋肾育胎丸续断阴性对照品、滋肾育胎丸何首乌阴性对照品、滋肾育胎丸巴戟天阴性对照品、白术、续断以及何首乌进行提取处理。