CN114324651A - 一种盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，使用高效液相色谱仪检测所述盐酸贝尼地平中的乙酰乙酸甲酯的含量，高效液相色谱仪中使用的流动相包括流动相A以及流动相B，流动相A为pH为5~8的第一磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液，流动相B为pH为2~4的第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液；检测方法包括使盐酸贝尼地平进入高效液相色谱仪，向所述高效液相色谱仪中分别通入流动相A以及流动相B对盐酸贝尼地平进行检测。本发明提供的检测方法可有效检测出盐酸贝尼地平中的乙酰乙酸甲酯的残留量，该检测方法的专属性、定量限与检测限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性均良好。
Description
技术领域
本发明属于化学药物分析技术领域，具体涉及一种盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法。
背景技术
盐酸贝尼地平属于二氢吡啶类钙离子拮抗剂，是临床上用于治疗高血压患者的一种降压药，相比临床上用的其他地平类药物，降压效果更强，副作用更小；同时对钙离子拮抗剂适用的其他适应症也有很好的疗效。在缓解心绞痛方面，盐酸贝尼地平的抗冠脉痉挛，也就是冠脉的收缩作用相对比较强，能够用于治疗变异性心绞痛，是冠脉痉挛患者的首选用药。
乙酰乙酸甲酯是盐酸贝尼地平合成过程中使用的起始原料，为了提高反应效率一般会过量投料，残留的风险较大，因此有必要对其残留量进行控制。目前乙酰乙酸甲酯、乙酰乙酸乙酯等常规检测方法为气相色谱法-溶液直接进样法，该法缺点是供试品在高温汽化时盐酸贝尼地平容易分解，产生很多杂质，对乙酰乙酸甲酯的测定造成干扰，且该法下乙酰乙酸甲酯响应值不高，检测灵敏度较低。
因此，有必要开发一种针对盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的残留量的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，使用高效液相色谱仪检测所述盐酸贝尼地平中的乙酰乙酸甲酯的含量，所述高效液相色谱仪中使用的流动相包括流动相A以及流动相B，所述流动相A为pH为5～8的第一磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液，所述流动相B为pH为2～4的第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液；所述检测方法包括使所述盐酸贝尼地平进入所述高效液相色谱仪，分别向所述高效液相色谱仪中通入所述流动相A以及所述流动相B以对所述盐酸贝尼地平进行检测。
优选地，所述第一磷酸盐溶液以及所述第二磷酸盐溶液中的磷酸盐的摩尔浓度均为0.04～0.06mol/L。
进一步优选地，采用0.5～1.5mol/L的氢氧化钾水溶液调节所述第一磷酸盐溶液的pH。
进一步优选地，采用磷酸调节所述第二磷酸盐溶液的pH。
优选地，所述流动相A中所述第一磷酸盐溶液与所述甲醇的体积比为(81～83)：(17～19)。
进一步优选地，所述流动相B中所述第二磷酸盐溶液与所述甲醇的体积比为(40～42)：(58～60)。
优选地，所述流动相A的流速为0.9～1.1ml/min。
进一步优选地，所述流动相B的流速为0.9～1.1ml/min。
根据一些优选的实施方式，所述流动相的梯度洗脱程序包括：0～6min，所述流动相为所述流动相A；6.1～16min，所述流动相为所述流动相B；16.1～24min，所述流动相为所述流动相A。
根据一些优选的实施方式，所述检测方法包括如下步骤：
(1)配制所述流动相；
(2)将乙酰乙酸甲酯的标准样品与稀释剂混合配制成对照品溶液，使用所述高效液相色谱仪对所述对照品溶液进行检测；
(3)将所述盐酸贝尼地平与所述稀释剂配制成供试品溶液，使用所述高效液相色谱仪对所述供试品溶液进行检测，根据所述对照品溶液中的乙酰乙酸甲酯的质量含量和峰面积以及所述供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的峰面积，按外标法计算出供试品溶液中的乙酰乙酸甲酯的质量含量。
进一步优选地，所述稀释剂为所述第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液，所述第二磷酸盐溶液与所述甲醇的体积比为(81～83)：(17～19)。
优选地，色谱柱包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。
进一步优选地，所述色谱柱为Waters 
C18，4.6×150mm，5μm色谱柱。
更进一步优选地，所述色谱柱的柱温为23～27℃。
优选地，所述高效液相色谱仪采用的检测器包括可变波长扫描紫外检测器(VWD)、光电二极管阵列检测器(PDA或者DAD)中的任一种，所述检测器的检测波长为208～212nm。
优选地，所述检测方法还包括使所述盐酸贝尼地平与稀释剂混合后配制供试品溶液，使所述供试品溶液进入所述高效液相色谱仪以对所述盐酸贝尼地平进行检测，所述稀释剂为所述第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液，所述第二磷酸盐溶液与所述甲醇的体积比为(81～83)：(17～19)。
进一步优选地，控制所述供试品溶液的进样量为10～30μl。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明提供的检测方法可有效检测出盐酸贝尼地平中的乙酰乙酸甲酯的残留量，该检测方法的专属性、定量限与检测限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性均良好。
附图说明
图1为本发明实施例1中的专属性试验图谱；
图2为本发明实施例1中的定量限试验图谱；
图3为本发明实施例1中的检测限试验图谱；
图4为本发明实施例1中的不同浓度的乙酰乙酸甲酯与峰面积的线性关系示意图；
图5为本发明实施例2中的乙酰乙酸甲酯的高效液相色谱图(磷酸二氢钾溶液的pH为5.0)；
图6为本发明实施例3中的乙酰乙酸甲酯的高效液相色谱图(磷酸二氢钾溶液的pH为6.0)；
图7为本发明实施例4中的乙酰乙酸甲酯的高效液相色谱图(磷酸二氢钾溶液的pH为6.8)；
图8为本发明实施例5中的乙酰乙酸甲酯的高效液相色谱图(磷酸二氢钾溶液的pH为7.8)；
图9为本发明对比例1中的气相色谱图；
图10为本发明对比例2中的乙酰乙酸甲酯的高效液相色谱图(磷酸二氢钾溶液的pH为3)。
具体实施方式
乙酰乙酸甲酯常规检测方法为气相色谱法，而本申请人采用现有的检测方法对盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯进行检测时发现，盐酸贝尼地平在高温汽化时容易分解，会产生很多杂质峰，对乙酰乙酸甲酯的测定造成干扰，造成检测结果的不准确。
基于现有技术的不足，本申请人经过长期实验及大量研究，得到本申请的方案，下面针对本方案作进一步阐述。
一种盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，使用高效液相色谱仪检测盐酸贝尼地平中的乙酰乙酸甲酯的含量。
本申请中，高效液相色谱仪使用的流动相包括流动相A以及流动相B。
流动相A为pH为5～8的第一磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液。第一磷酸盐溶液的pH越小，乙酰乙酸甲酯峰形拖尾越严重，影响检测灵敏度；而第一磷酸盐溶液的pH大于一定值时，基线噪音增大，影响测试的准确性。作为优选，第一磷酸盐溶液的pH为5～8，例如可以为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8等。
第一磷酸盐溶液的pH可以采用氢氧化钾水溶液进行调节，其中，氢氧化钾水溶液的摩尔浓度为0.5～1.5mol/L，例如可以为0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1mol/L、1.1mol/L、1.2mol/L、1.3mol/L、1.4mol/L、1.5mol/L等。
进一步地，第一磷酸盐溶液中的磷酸盐的摩尔浓度为0.04～0.06mol/L，例如可以为0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L等。
进一步地，流动相A中第一磷酸盐溶液与甲醇的体积比为(81～83)：(17～19)，例如可以为81：17、82：17、83：17、81：18、82：18、83：18、81：19、82：19、83：19等。
进一步地，流动相A的流速为0.9～1.1ml/min，例如可以为0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min等。
流动相B为pH为2～4的第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液。磷酸盐溶液的pH越大，盐酸贝尼地平在其中的溶解度越差，导致盐酸贝尼地平无法被很好地洗脱出来。本申请通过流动相B的配制，以及对流动相中的第二磷酸盐溶液的pH的调节，能够使盐酸贝尼地平及其他各杂质组分均能在较短时间内被洗脱出来。作为优选，第一磷酸盐溶液的pH为2～4，例如可以为2、2.5、3、3.5、4等。
第二磷酸盐溶液的pH可以采用磷酸进行调节。
进一步地，第二磷酸盐溶液中的磷酸盐的摩尔浓度为0.04～0.06mol/L，例如可以为0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L等。
进一步地，流动相B中第二磷酸盐溶液与甲醇的体积比为(40～42)：(58～60)，例如可以为40：58、41：58、42：58、40：59、41：59、42：59、40：60、41：60、42：60等。
进一步地，流动相B的流速为0.9～1.1ml/min，例如可以为0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min等。
本发明中，流动相的梯度洗脱程序如下所示。
本发明先以100v/v％流动相A洗脱6分钟，洗脱出乙酰乙酸甲酯；再以100v/v％流动相B洗脱10分钟，洗脱出盐酸贝尼地平及其他杂质组分；最后，再以100v/v％流动相A平衡8分钟，进而能够检测出盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的含量。
本发明中，色谱柱包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，例如可以为Waters
C18，4.6×150mm，5μm色谱柱或者其他效能相当的色谱柱。色谱柱的柱温为23～27℃，例如可以为23℃、24℃、25℃、26℃、27℃等。
本发明中，高效液相色谱仪采用的检测器包括可变波长扫描紫外检测器(VWD)、光电二极管阵列检测器(PDA或者DAD)中的任一种，检测器的检测波长为208～212nm，例如可以为208nm、209nm、210nm、211nm、212nm等。
本发明的检测方法包括如下步骤：
(1)配制流动相；
(2)将乙酰乙酸甲酯的标准样品与稀释剂混合配制成对照品溶液，使用高效液相色谱仪对对照品溶液进行检测；
(3)将盐酸贝尼地平与稀释剂混合配制成供试品溶液，使用高效液相色谱仪对供试品溶液进行检测，根据对照品溶液中的乙酰乙酸甲酯的质量含量和峰面积以及供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的峰面积，按外标法计算出供试品溶液中的乙酰乙酸甲酯的质量含量。
本发明的检测方法还包括使盐酸贝尼地平与稀释剂混合后配制供试品溶液，使供试品溶液进入高效液相色谱仪以对盐酸贝尼地平进行检测，其中，控制供试品溶液的进样量为10～30μl，例如可以为10μl、15μl、20μl、25μl、30μl等。
上述稀释剂为第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液，第二磷酸盐溶液与甲醇的体积比为(81～83)：(17～19)，例如可以为81：17、82：17、83：17、81：18、82：18、83：18、81：19、82：19、83：19等。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
在没有特别说明的情况下，下述实施例以及对比例中的“S/N”指信噪比、“RSD”指相对标准偏差。
实施例1
仪器：SHIMADZU LC-2030C；
(一)色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(Waters 
C18，4.6×150mm，5μm)；
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用1mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至6.0)-甲醇(体积比82︰18)；
流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(体积比41︰59)；
洗脱程序如下表1所示：
表1
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 6 | 100 | 0 |
| 6.1 | 0 | 100 |
| 16 | 0 | 100 |
| 16.1 | 100 | 0 |
| 24 | 100 | 0 |
检测波长：210nm；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
柱温：30℃。
(二)溶液的配制
溶剂：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(体积比82︰18)。
对照品溶液：取乙酰乙酸甲酯约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀(平行配制两份)。
供试品溶液：取供试品约250mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀(平行配制两份)。
(三)系统适用性要求
连续进5针对照品溶液(3针对照品溶液1和2针对照品溶液2)，校正因子的RSD应≤5.0％；理论板数按乙酰乙酸甲酯峰计应≥2000。
(四)测定
精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
进样程序如下表2所示。
表2
| 溶液名称 | 进样次数 |
| 空白溶剂 | 重复进空白至系统无干扰 |
| 对照品溶液1 | 3 |
| 对照品溶液2 | 2 |
| 供试品溶液1 | 1 |
| 供试品溶液2 | 1 |
| 对照品溶液1 | 1 |
(五)方法学验证
1、专属性
(1)测试方法
溶剂：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(体积比82︰18)。
对照品贮备液：称取乙酰乙酸甲酯28.81mg，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取对照品贮备液1ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀.
供试品溶液：称取供试品252.56mg，置50ml量瓶中，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：称取供试品250.86mg，置50ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液分别进样，记录色谱图。
(2)接受标准
空白溶剂、盐酸贝尼地平应不干扰乙酰乙酸甲酯的测定。
(3)验证结果
试验结果显示：空白溶剂、盐酸贝尼地平均不干扰乙酰乙酸甲酯的测定，说明上述分析方法的专属性良好。图谱如图1所示。
2、定量限与检测限
(1)测试方法
对照品贮备液：称取乙酰乙酸甲酯26.12mg，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取对照品贮备液1ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
定量限溶液：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
检测限溶液：精密量取定量限溶液4ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
(2)接受标准
定量限溶液的S/N应≥10，检测限溶液的S/N应≥3；定量限不得过限度的20％(0.02％)；定量限溶液连续进样6次峰面积的RSD应≤10％。
(3)验证结果
定量限与检测限图谱如图2与图3所示，表3为定量限与检测限试验结果。
表3
试验结果显示：乙酰乙酸甲酯定量限溶液的S/N均＞10，检测限溶液的S/N＞3；检测限浓度为0.2069μg/ml，检测限为0.004％；定量限浓度为0.5172μg/ml，定量限为0.010％；定量限溶液连续进样6次峰面积的RSD为5.2％；均符合规定，说明上述分析方法的检测灵敏度良好。
3、线性与范围
(1)测试方法
对照品贮备液：配制方法见定量限与检测限项。
线性溶液：精密量取对照品贮备液0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml，分别置不同的50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为20％、50％、100％、150％、200％浓度水平的线性溶液；取定量限溶液作为最低浓度的线性溶液。
取各线性溶液分别进样，记录色谱图。以浓度(C)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，分别计算乙酰乙酸甲酯的线性回归方程及相关系数r。
(2)接受标准
相关系数r应≥0.990，截距百分比应≤10％。
3)验证结果
线性与范围试验结果见表4以及图4。
表4
试验结果显示：乙酰乙酸甲酯在0.5172μg/ml～10.3435μg/ml范围内，线性方程为y＝1066.7x-27.738，相关系数为0.9997，截距百分比为0.5％，均符合规定，说明上述分析方法乙酰乙酸甲酯在该浓度范围内与峰面积的线性关系良好。
4、精密度
(1)测试方法
a、重复性
对照品贮备液①和②：称取乙酰乙酸甲酯26.12mg、27.20mg，分别置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液①和②：精密量取对照品贮备液①和②各1ml，分别置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：称取供试品242.89mg、248.11mg、246.19mg、253.37mg、250.56mg、252.97mg，分别置不同的50ml量瓶中，精密加入对照品贮备液①各1ml，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
取上述溶液分别进样，记录色谱图，按外标法计算加标供试品中乙酰乙酸甲酯的含量。
b、中间精密度
在与重复性试验不同日期由另一名实验人员使用不同仪器，各溶液按重复性进行配制并测定。
对照品贮备①和②：称取乙酰乙酸甲酯27.53mg、26.87mg，分别置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液①和②：精密量取对照品贮备液①和②各1ml，分别置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：称取供试品242.61mg、245.78mg、240.42mg、248.18mg、244.72mg、245.72mg，分别置不同的50ml量瓶中，精密加入对照品贮备液②各1ml，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
(2)接受标准
重复性6份加标供试品中乙酰乙酸甲酯含量的极差应≤0.05％。
中间精密度6份加标供试品中乙酰乙酸甲酯含量的极差应≤0.05％。
两名实验人员各自测得乙酰乙酸甲酯含量均值的差值应≤0.05％。
(3)验证结果
精密度试验结果如表5所示。
表5
试验结果显示：重复性与中间精密度各6份加标供试品测得乙酰乙酸甲酯含量的极差分别为0.00％、0.03％，两名实验人员测得乙酰乙酸甲酯含量平均值的差值为0.00％，均符合规定，说明上述分析方法的精密度良好。
5、准确度
(1)测试方法
对照品贮备液①和②：称取乙酰乙酸甲酯26.50mg、27.40mg，分别置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液①和②：精密量取对照品贮备液①和②各1ml，分别置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：称取供试品247.95mg，置50ml量瓶中，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液(20％浓度)：称取供试品245.76mg、250.28mg、248.07mg，置不同的50ml量瓶中，分别精密加入对照品贮备液①200μl，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液(50％浓度)：称取供试品248.38mg、253.29mg、247.42mg，置不同的50ml量瓶中，分别精密加入对照品贮备液①500μl，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液(100％浓度)：称取供试品245.39mg、258.61mg、251.28mg，置不同的50ml量瓶中，分别精密加入对照品贮备液①1ml，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液(150％浓度)：称取供试品247.98mg、249.94mg、249.80mg，置不同的50ml量瓶中，分别精密加入对照品贮备液①1.5ml，加溶剂超声10分钟助溶，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
取上述溶液分别进样，记录色谱图，按外标法计算乙酰乙酸甲酯的加样回收率及RSD。
(2)接受标准
乙酰乙酸甲酯加样回收率应为90％～108％，RSD应≤10％。
(3)验证结果
准确度试验结果如表6所示。
表6
试验结果显示：在20％～150％加样浓度水平下，乙酰乙酸甲酯回收率范围为94.10％～104.78％，平均回收率为99.7％，RSD为2.8％，均符合规定，说明上述分析方法的准确度良好。
6、耐用性
6.1、溶液稳定性
(1)测试方法
对照品溶液、加标供试品溶液：配制方法见重复性项下。
取对照品溶液、加标供试品溶液在25℃下放置，于0、2、4、8、12、18、24、34、49h分别进样，考察不同时间点测得乙酰乙酸甲酯的峰面积与0h的比值。
(2)接受标准
不同时间点测得乙酰乙酸甲酯的峰面积与0h的比值应为0.90～1.10。
(3)验证结果
溶液稳定性试验结果如表7所示。
表7
试验结果显示：对照品溶液在25℃下放置49h，各时间点测得乙酰乙酸甲酯的峰面积与0h的比值在0.95～1.00之间；加标供试品溶液在25℃下放置49h，各时间点测得乙酰乙酸甲酯的峰面积与0h的比值在0.98～1.01之间；均符合规定。说明上述分析方法对照品溶液与供试品溶液在25℃下放置49h，溶液稳定性良好。
6.2、色谱条件及供试品超声时间的耐用性
(1)测试方法
对照品溶液、加标供试品溶液：配制方法见准确度与中间精密度项下。
色谱条件在初始条件基础上进行微小变动(波长±2nm、柱温±2℃、流速±0.1ml/min、流动相A的pH值±0.1、流动相A的比例±1％)，改变色谱柱，超声时间进行微小变动(超声时间±2min)，考察加标供试品测得乙酰乙酸甲酯的含量，与初始条件比较差值。
(2)接受标准
加标供试品测得乙酰乙酸甲酯的含量与初始条件相比差值应≤0.05％。
(3)验证结果
色谱条件及超声时间耐用性试验结果如表8所示。
表8
注1：为初始条件。
注2：色谱柱编号RH0148，Waters 
C18，4.6×150mm，5μm，SN：03293014212481。
注3：色谱柱编号RH0128，Waters 
C18，4.6×150mm，5μm，SN：03293014212469。
试验结果显示：微调波长(210nm±2nm)、柱温(30℃±2℃)、流速(1.0ml/min±0.1ml/min)、流动相A的pH值(pH6.0±0.1)、流动相A的比例(体积比81︰19、82︰18、83︰17)，改变色谱柱，超声时间进行微小变动(10min±2min)，加标供试品溶液测得乙酰乙酸甲酯的含量与初始条件相比，差值最大为0.01％，均符合规定，说明上述分析方法对色谱条件及超声时间的耐用性良好。
总结：上述分析方法的专属性、定量限与检测限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等项目验证结果均符合要求，该方法适用于盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的测定。
实施例2
仪器：SHIMADZU LC-2030C；
色谱柱：C18柱，4.6×150mm，5μm；
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用流速调节pH值至5.0)-甲醇(体积比87︰13)
检测波长：210nm；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
柱温：30℃。
乙酰乙酸甲酯溶液：取乙酰乙酸甲酯约20mg，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，再取1ml，置20ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。(10μg/ml)
取乙酰乙酸甲酯溶液进样，图谱如图5所示。
实施例3
与实施例2的区别在于：
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用流速调节pH值至6.0)，图谱如图6所示。
实施例4
与实施例2的区别在于：
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用流速调节pH值至6.8)，图谱如图7所示。
实施例5
与实施例2的区别在于：
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用流速调节pH值至7.8)，图谱如图8所示。
实施例2至5中，其他色谱条件不变，配制10μg/ml的乙酰乙酸甲酯溶液进样，以信噪比来考察检测灵敏度，结果见下表9所示。
表9
试验结果显示：磷酸二氢钾溶液的pH值从5.0增加到7.8，乙酰乙酸甲酯的峰高和对称性越来越好，但是增加到6.0之后，基线噪音开始增大，S/N值反而下降。
对比例1
采用气相色谱法进行测定
仪器：SHIMADZU GC-2010pro；
色谱柱：Agilent DB-WAX(30m×0.25mm，0.5μm)；
检测器：FID；
柱温：90℃维持5min，20℃/min升至250℃，维持10min；
柱流速：2.5ml/min；
气化室温度：200℃；
检测器温度：280℃；
进样量：5μl；
分流比：10︰1；
空气流速：400ml/min；
氢气流速：40ml/min；
尾吹流速：30ml/min。
对照品溶液：取乙酰乙酸甲酯约50mg、HAc(乙酸)约250mg、SM2(N-苄基-3-羟基哌啶)约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。(注：HAc、SM2为盐酸贝尼地平中其他残留溶剂，最初与乙酰乙酸甲酯残留同时摸索检测方法，最终采用不同方法分别进行检测，故下文中不再阐述。)
供试品溶液：取盐酸贝尼地平约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
加标供试品溶液：取盐酸贝尼地平约500mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入对照品贮备液1ml，再加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
取上述溶液分别进样，记录色谱图。
试验结果显示：供试品在乙酰乙酸甲酯峰附近有杂质峰产生，且基线产生漂移，影响乙酰乙酸甲酯测定，图谱如图9所示。
对比例2
与实施例2的区别在于：
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3)-甲醇(体积比87︰13)，配制20μg/ml的乙酰乙酸甲酯溶液进样，图谱如图10所示。乙酰乙酸甲酯峰形拖尾，影响检测灵敏度。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：使用高效液相色谱仪检测所述盐酸贝尼地平中的乙酰乙酸甲酯的含量，所述高效液相色谱仪中使用的流动相包括流动相A以及流动相B，所述流动相A为pH为5~8的第一磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液，所述流动相B为pH为2~4的第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液；
所述检测方法包括使所述盐酸贝尼地平进入所述高效液相色谱仪，分别向所述高效液相色谱仪中通入所述流动相A以及流动相B对所述盐酸贝尼地平进行检测。
2.根据权利要求1所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：所述第一磷酸盐溶液以及所述第二磷酸盐溶液中的磷酸盐的摩尔浓度均为0.04～0.06mol/L；
和/或，采用0.5~1.5mol/L的氢氧化钾水溶液调节所述第一磷酸盐溶液的pH，采用磷酸调节所述第二磷酸盐溶液的pH。
3.根据权利要求1所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：所述流动相A中所述第一磷酸盐溶液与所述甲醇的体积比为（81~83）：（17~19）；
和/或，所述流动相B中所述第二磷酸盐溶液与所述甲醇的体积比为（40~42）：（58~60）。
4.根据权利要求1所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：所述流动相A的流速为0.9~1.1 ml/min；
和/或，所述流动相B的流速为0.9~1.1ml/min。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：所述流动相的梯度洗脱程序包括：
0~6min，所述流动相为所述流动相A；
6.1~16min，所述流动相为所述流动相B；
16.1~24min，所述流动相为所述流动相A。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤，
（1）配制所述流动相；
（2）将乙酰乙酸甲酯的标准样品与稀释剂混合配制成对照品溶液，使用所述高效液相色谱仪对所述对照品溶液进行检测；
（3）将所述盐酸贝尼地平与所述稀释剂混合配制成供试品溶液，使用所述高效液相色谱仪对所述供试品溶液进行检测，根据所述对照品溶液中的乙酰乙酸甲酯的质量含量和峰面积以及所述供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的峰面积，按外标法计算出供试品溶液中的乙酰乙酸甲酯的质量含量；
其中，所述稀释剂为所述第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液，所述第二磷酸盐溶液与所述甲醇的体积比为（81~83）：（17~19）。
7.根据权利要求1所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：色谱柱包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
和/或，所述色谱柱的柱温为23~27℃。
8.根据权利要求1所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪采用的检测器包括可变波长扫描紫外检测器、光电二极管阵列检测器中的任一种，所述检测器的检测波长为208~212nm。
9.根据权利要求1所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括使所述盐酸贝尼地平与稀释剂混合后配制供试品溶液，使所述供试品溶液进入所述高效液相色谱仪以对所述盐酸贝尼地平进行检测，所述稀释剂为所述第二磷酸盐溶液和甲醇的混合溶液，所述第二磷酸盐溶液与所述甲醇的体积比为（81~83）：（17~19）。
10.根据权利要求9所述的盐酸贝尼地平中乙酰乙酸甲酯的检测方法，其特征在于：控制所述供试品溶液的进样量为10～30µl。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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