CN114317176A - 一种改良阿斯蒂缺氮发酵方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种改良阿斯蒂缺氮发酵方法及其应用，涉及食品加工技术领域。本发明提供的改良阿斯蒂缺氮发酵方法包括以下步骤：原料前处理、接种酵母、发酵处理、灭活处理等步骤。澄清过滤得到发酵酒液。采用本发明的改良阿斯蒂缺氮发酵方法可避免传统发酵工艺中容易出现的杂菌感染的问题，制备工艺流程缩短，采用本发明上述技术方案制备的发酵酒液香气物质含量高、酒体醇厚、甜度适中、口感好。

Description

一种改良阿斯蒂缺氮发酵方法及其应用

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，特别涉及一种改良阿斯蒂缺氮发酵方法及其应用。

背景技术

荔枝是我国南方地区重要的经济作物，其种植历史悠久、品种繁多、种植广泛，且从业人口多。荔枝每年6至7月成熟，但收获窗口期仅为20余日，具有成熟时间集中、单日产量大(即快产)的特点。荔枝保鲜期短，极不耐储藏，采后必需以“快销”途径尽快销售，但受到市场环境、物流、仓储等诸多因素的影响，荔枝的“快销”一直很难实现。2021年，全国荔枝大面积增收，导致荔枝消费市场过度饱和，荔枝价格大幅缩水。在此期间，广东、广西、福建各地荔枝甚至出现了大量滞销的现象，使果农承担了巨大的经济损失。由此可见，找到一种持续、稳定的荔枝“快销”途径，解决荔枝滞销问题，关系到众多果农的民生。

果酒加工技术开发，对解决荔枝果农“三农问题”具有明确的现实意义。工业化精深加工可为农产品提供持续稳定的销路，也是提高农产品市场价值的主要方法。荔枝加工主要集中在罐头、果酱、果脯、果汁、果酒等方面，其中，荔枝酒的生产过程机械化程度高，可在短时间内消耗大量荔枝，是可行的“快销”手段；与此同时，高品质荔枝酒的附加值显著高于其它产品，也可为创造可观收益。但果酒普遍存在装瓶后的“二次发酵”问题，尤其是荔枝含糖量高(150g/L果汁)，残余糖分很容易使酵母在装瓶后再次启动二次发酵，导致果酒丧失原本浓郁的香气与口感，并使成酒的品质和质量大幅下降。

目前用于实践生产的可减少“二次发酵”影响的方法主要包括果实品控、人工调香和发酵控制三种。其中，果实品控主要利用农业技术增加果实中的呈香物质含量，是减少二次发酵负面影响的常用手段之一。目前国内外的研究主要集中在栽培技术(如果实选育、修枝、灌溉、植物激素调节)和成熟度控制两个方面。栽培技术需要长期大量的基础研究工作，明确其对果实品质和呈香物质含量的影响，部分农业技术甚至需要几十年的实践摸索才能找到实际可行的方法(如酿酒葡萄的选育)。栽培技术的研究具有周期长、见效慢的缺陷，并不能立即解决荔枝酒二次发酵引起的品质下降问题。人工调香则主要通过酿造后使用食品添加剂进行调香，是一种最直接的方法。针对“二次发酵”后果酒缺失的香气和香味成分，施以相应的香精、调味剂等，能够有效提高果酒香气、香味表现。但是，消费者对食品添加剂存在普遍的抵触心理，受到这一因素的影响，人工调香的果酒市场价值、销量都不高。发酵控制中的阿斯蒂(Asti)缺氮发酵技术是意大利阿斯蒂地区针对甜型葡萄酒二次发酵问题最新开发的酿造技术，该技术充分利用酵母的氮源需求，从根本上阻止二次发酵的产生，常规的阿斯蒂(Asti)缺氮发酵工艺如图1所示。以阿斯蒂缺氮发酵技术生产的莫斯卡托(Moscato)葡萄酒，具有“小甜水”的美誉，广受消费者青睐。

但是，常规的阿斯蒂缺氮发酵技术具有以下缺陷：(1)发酵结束前的过滤工序耗时长，过滤是缺氮发酵的核心工序，目的在于减少酵母菌的数量，以减缓酵母代谢产酒精的速度，提前终止酒精发酵过程。常用的过滤手段包括硅藻土过滤和膜过滤，但由于酒体中含有大量的蛋白、多糖、纤维素等不易溶解的大分子物质，若不经过澄清、下胶工序处理就直接进入过滤环节，过滤速度很慢，耗时长，且容易堵塞滤膜。(2)糖度不易控制，常规的缺氮发酵工艺，依靠过滤后残余的酵母继续代谢酒体中的糖分，但过滤后酒体中残余酵母量的控制受到滤膜孔径、通过速度等因素的影响，需要经过大量的尝试才可以掌握。若剩余酵母过多，则后续发酵速度会过快，导致酒体的酒精度过高；若剩余酵母过少，则后续发酵则难以再次启动，造成酒体酒精度过低、糖含量过高的生产事故。(3)过滤处理容易引起杂菌污染且耗材昂贵，过滤设备(如板框压滤机、气囊压滤机)内部结构复杂，零部件繁多，在过滤处理前需要大量的时间和精力对其进行清洗、消毒处理。若清洗、消毒处理不彻底，容易导致设备中的细菌、霉菌等杂菌进入酒体。值得注意的是，这些设备原本是用于成酒(酒精度10％以上)的过滤工序，而缺氮发酵工艺的过滤工序要求在发酵过程中(酒精度5％以下)进行。酒体中酒精含量更低，成酒品质更容易受到杂菌的影响。(4)多次过滤容易导致香气物质损失，传统的缺氮发酵工艺要求在酿酒过程中进行一次或多次的过滤处理，显而易见的是，过滤的次数越多，香气物质和呈味物质的损失就越为严重。因而缺氮发酵技术具有一定的矛盾，若过滤次数不够，酵母去除效率不高，容易引起二次发酵，导致成酒的品质下降；若过滤次数太多，香气和呈味物质损失严重，导致成酒的品质下降。如何把握过滤次数和香气的损失，需要根据果酒中香气物质的含量、过滤设备的具体条件(滤膜孔径、硅藻土的吸附性等)，进行多次的实验与调整，这就极大的限制了缺氮发酵技术的应用。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种改良阿斯蒂缺氮发酵方法及其应用。

为实现上述目的，第一方面，本发明提出了一种改良阿斯蒂缺氮发酵方法，包括以下步骤：

(1)原料前处理：以水果为原料，削皮、去核后得发酵原料；

(2)接种酵母：往所述发酵原料中接种酵母菌；

(3)发酵处理：控制发酵温度为10-30℃，发酵时间为4-120h；

(4)灭活处理：发酵结束后，加入纳米单宁并采用微波辐照辅助技术对残余酵母菌进行灭活处理；

(5)澄清过滤得到发酵酒液。

碳源和氮源是酿酒酵母生长和繁殖过程中的必要营养元素，碳源来自于葡萄糖，而氮源(yeast assimilable nitrogen，YAN)主要来自于果汁或人工添加至果汁中的铵离子和部分氨基酸。酵母的生命周期包括增殖和生长代谢两个重要阶段，传统的阿斯蒂缺氮发酵技术的原理在于：在发酵启动后立即过滤或离心处理，除去大部分活跃酵母，而剩余酵母缺乏增殖阶段所需氮源，待氮源消耗殆尽，无法继续增殖，发酵自然终止。

植物单宁具有显著的微生物毒性，能够通过氢键-疏水作用力协同作用的方式与蛋白质(酶)结合，从而起到抑制微生物生长的作用。基于此，发明人将植物单宁应用于缺氮发酵过程中以起到抑制酵母菌繁殖的作用。但在实验过程中发现，单纯的使用单宁抑制酒体中酵母的繁殖，效果较为有限，若单宁的量添加过多，会使成酒变得过于涩口，反而引起成酒品质下降。对比，本发明技术方案中，发明人采用经由植物单宁改性得到的纳米单宁作为抑制酵母菌增殖的物质。相较于游离态的植物单宁，纳米单宁具有较大的比表面积，增加了其与微生物接触并结合的概率，也增大了单宁对酵母的抑制能力。

醋酸菌污染是酿酒过程中最容易出现的问题，醋酸菌往往存在于果皮、未彻底清洁的管路和发酵罐外环境中。传统的阿斯蒂缺氮发酵工艺涉及发酵前期的过滤处理，很容易使发酵液沾染醋酸菌，而发酵前期酒精度含量并不高，这就更容易使醋酸菌繁殖。单宁是一种抗氧化性质极强的天然多酚，它的使用能有效降低发酵液中酒精氧化转为醋酸的途径，本申请所采用的纳米单宁具有和植物单宁几乎相同的功能基团，因而，本申请纳米单宁的引入，还能降低发酵液中醋酸菌繁殖的风险。

此外，微波能够产生热效应和非热效应，热效应能够起到迅速升高微生物体内温度的作用，而非热效应则能使微生物中的蛋白质变性。热效应与非热效应共同作用可起到杀灭微生物的作用。但常规的微波处理方法往往会引起样品温度升高至70℃以上，对于易挥发香味物质含量较高的食品、饮料(尤其是果酒)，高温处理容易引起芳香类化合物大量损失，造成产品的品质下降，因而在果酒的加工过程中需要尽量避免高温处理。为此，本发明技术方案中，发明人创新性地将微波辐照辅助的手段引入纳米单宁作用过程中，即将纳米单宁与微波辐照辅助技术有机结合，极大程度的减少了对酵母杀灭过程所需的微波能量，也巧妙的避免了微波灭菌引起的样品温度过高的问题。

本发明的改良阿斯蒂缺氮发酵方法可避免传统发酵工艺中容易出现的杂菌感染的问题，制备工艺流程缩短，采用本发明上述技术方案制备的发酵酒液香气物质含量高、酒体醇厚、甜度适中、口感好。

作为本发明所述改良阿斯蒂缺氮发酵方法的优选实施方式，按重量份数计，所述发酵原料为100份、所述酵母菌为0.01-0.2份、所述纳米单宁为0.5-14.5份。

作为本发明所述改良阿斯蒂缺氮发酵方法的优选实施方式，所述步骤(1)中的水果为荔枝、葡萄、火龙果、蜜柚、桑葚、橄榄、柚柑中的至少一种。

作为本发明所述改良阿斯蒂缺氮发酵方法的优选实施方式，所述步骤(2)中的酵母菌为非酿酒酵母；优选地，所述非酿酒酵母为乳酸克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母和戴尔有孢圆酵母中的至少一种。

作为本发明所述改良阿斯蒂缺氮发酵方法的优选实施方式，所述步骤(4)中微波辐照频率为500-2500MHz，输出功率为500-4000W，辐照时间为0.5-20min。

作为本发明所述改良阿斯蒂缺氮发酵方法的优选实施方式，所述纳米单宁为单宁-金属离子的配位化合物。

本发明的纳米单宁的制备方法包括如下步骤：按重量份数计，将单宁1-20份、表面活性剂0.2-6.5份、金属盐0.01-0.2份、碱性物质0.01-0.02份和水100-500份混合搅拌均匀即得。其利用软模板法使单宁与金属离子之间发生配位化学反应形成配位化合物，本发明技术方案中的纳米单宁粒径约为20-50nm。采用上述制备方法制备纳米单宁，提高了单宁的比表面积，进而增加了其与微生物接触并结合的概率，从而增大了单宁对酵母的抑制能力。

作为本发明所述改良阿斯蒂缺氮发酵方法的优选实施方式，将所述步骤(2)-(4)循环2-4次。

如前所述，传统的阿斯蒂缺氮发酵工艺条件不易控制，若过滤工序处理的不充分，则剩余酵母容易大量繁殖；若过滤太过彻底，后续发酵不易启动，糖度不好控制。

发明人经过大量试验发现，通过重复本发明发酵方法步骤(2)-(4)，即使用多次接种、多次发酵、多次灭活的技术手段，可确保发酵液中酵母的起始浓度维持稳定状态，使酵母的起始浓度不会过低，又能确保酵母将氮源消耗殆尽，最终可达到精确控制发酵液糖度的效果。

需要注意的是，在重复本发明发酵方法步骤(2)-(4)的过程中，第二次接种酵母的对象为第一次灭活处理后的发酵体系，同理，第三次接种酵母的对象为第二次灭活处理后的发酵体系，第四次接种酵母的对象为第三次灭活处理后的发酵体系。

作为本发明所述改良阿斯蒂缺氮发酵方法的优选实施方式，将所述步骤(2)-(4)循环3次，包括如下(a)-(d)中的至少一项：

(a)第一次酵母菌接种量为0.004-0.09重量份；第二次酵母菌接种量为0.003-0.06重量份；第三次酵母菌接种量为0.005-0.05重量份；

(b)第一次发酵处理的发酵温度为15-25℃，发酵时间为4-72h；第二次发酵处理的发酵温度为20-30℃，发酵时间为12-120h；第三次发酵处理的发酵温度为10-25℃，发酵时间为4-48h；

(c)第一次灭活处理中纳米单宁的用量为0.02-10份；第二次灭活处理中纳米单宁的用量为0.02-1.5份；第二次灭活处理中纳米单宁的用量为0.5-3份；

(d)第一次灭活处理中的微波辐照频率为500MHz，输出功率为2000-4000W，辐照时间为5-15min；第二次灭活处理中的微波辐照频率为2500MHz，输出功率为500-1500W，辐照时间为0.5-12min；第三次灭活处理中的微波辐照频率为1000MHz，输出功率为1000-2000W，辐照时间为5-20min。

第二方面，本发明还提出一种改良阿斯蒂缺氮发酵方法在制备发酵果酒中的应用。

本发明技术方案中所提出的改良阿斯蒂缺氮发酵方法可应用于各种发酵果酒中的制备。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明技术方案通过对传统的阿斯蒂缺氮发酵工艺进行改进，将微波辐照辅助的手段与纳米单宁共同作用进行发酵后灭活处理，并与其他工艺步骤有机结合。采用本发明的改良阿斯蒂缺氮发酵方法可避免传统发酵工艺中容易出现的杂菌感染的问题，制备工艺流程缩短，采用本发明上述技术方案制备的发酵酒液香气物质含量高、酒体醇厚、甜度适中、口感好。

附图说明

图1为常规阿斯蒂缺氮发酵技术的工艺流程简图；

图2为本发明实施例1-9中的改良阿斯蒂缺氮发酵工艺流程简图；

图3为本发明实施例1制备的纳米单宁的扫描电子显微镜照片；

图4为本发明实施例1制备的纳米单宁的红外光谱图；

图5为本发明实施例1制备的纳米单宁的荧光光谱图；

图6为本发明实施例1中典型的荔枝香型物质的谱图，其中，A-乙酸异丁酯，B-丁酸乙酯；C-L(-)-乳酸乙酯；D-乙酸异戊酯；E-3-甲基戊基醋酸酯；F-己酸乙酯；G-正己基乙酸酯；H-顺-3-甲基-1,3-二烯基-5-羟基戊脂；I-乳酸异戊酯；J-甲基苯乙基醚。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将通过具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1-9

如图2所示，实施例1-9的改良阿斯蒂缺氮发酵方法包括以下步骤：

(1)原料前处理：以荔枝为原料，削皮、去核后得发酵原料；

(2)接种酵母：往发酵原料中接种酵母菌；

(3)发酵处理：控制发酵温度为10-30℃，发酵时间为4-120h；

(4)灭活处理：发酵结束后，加入纳米单宁并采用微波辐照辅助技术对残余酵母菌进行灭活处理；

(5)澄清过滤得到发酵酒液；

实施例1-9中将步骤(2)-(4)循环3次；

实施例1-9中采用的原料和各步骤参数设置情况如下表1所示。

表1.实施例1-9的原料和各步骤参数设置情况

实施例1-9中采用的纳米单宁的制备方法包括以下步骤：按重量份数计，将表2中各原料混合搅拌24h，即得纳米单宁。

实施例1-9中纳米单宁的原料组成情况(按重量份数计)和纳米单宁的粒径如下表2所示。

表2.实施例1-9中合成纳米单宁的原料组成及纳米单宁粒径测试结果

对比例1

本对比例采用常规阿斯蒂缺氮发酵技术，具体方法为：向100份荔枝发酵原料中，加入0.4份酵母菌BC1063(酿酒酵母)，在25℃条件下发酵48h，随后利用孔径为0.25um的微孔滤膜过滤，过滤后继续置于25℃条件下发酵至酒精含量不再上升，再进行常规硅藻土过滤后得产品。

实验例1

对实施例1制备的纳米单宁的扫描电子显微镜照片(A)红外光谱(B)和荧光光谱(C)如图1-3所示。由图1可知，纳米单宁的平均粒径为35nm。由图2可知，利用红外光谱对纳米单宁、单宁和金属离子分别进行了检测，可以看到单宁与金属离子形成纳米单宁后，其酰胺A、酰胺B、酰胺I、酰胺II和酰胺III带的吸收峰都发生了显著的变化，表明纳米单宁是基于单宁的邻位酚羟基与金属离子的配位反应发生的聚合。由图3可知，单宁与金属离子在280nm处观测到显著的荧光吸收峰，但二者发生反应后，该荧光峰出现了明显的猝灭现象，荧光吸收峰显著降低，单宁的荧光来自于苯环上的酚羟基，与金属离子反应后的荧光猝灭现象，进一步证明了纳米单宁的聚合是基于单宁与金属离子的配位反应产生的。

实验例2

采用顶空固相微萃取法(SPME)对实施例1-9制备的荔枝酒中香气物质进行收集，随后使用气象色谱-质谱联用(GC-MS)对其中的香气物质种类和含量进行考察，计算实施例1-9、对比例1制备的荔枝酒中香气物质的相对含量(以峰面积表示)测试结果如下表3所示。其中，实施例1中典型的荔枝香型物质的谱图如图6所示。

表3.实施例1-9、对比例1制备的荔枝酒中香气物质相对含量测试结果

由图3可知，实施例1采用改良阿斯蒂缺氮发酵方法制备的荔枝酒中，检测到10种典型的荔枝香气物质，包括：乙酸异丁酯，丁酸乙酯，L(-)-乳酸乙酯，乙酸异戊酯，3-甲基戊基醋酸酯，己酸乙酯，正己基乙酸酯，顺-3-甲基-1,3-二烯基-5-羟基戊脂，乳酸异戊酯，甲基苯乙基醚。随后对各个色谱峰的峰面积进行了积分，计算了各香气物质的相对含量。

荔枝中的香气物质主要为脂类，由表3可知，实施例1-9采用改良阿斯蒂缺氮发酵技术酿造的荔枝酒，具有的典型荔枝香气物质(乙酸异丁酯、丁酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、正己基乙酸酯和乳酸异戊酯)的含量显著高于对比例1(对比例由常规阿斯蒂缺氮酿造工艺获得)，表明采用本申请的改良阿斯蒂缺氮发酵技术酿造成酒，酒体中各有效物质含量较常规阿斯蒂缺氮酿造工艺明显提高，酒体更加浓郁、且适口。

实施例10

本实施例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本实施例采用葡萄替代荔枝作为原料。

实施例11

本实施例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本实施例采用火龙果替代荔枝作为原料。

实施例12

本实施例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本实施例采用桑葚替代荔枝作为原料。

实施例13

本实施例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本实施例仅将步骤(2)-(4)操作一次。

实施例14

本实施例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本实施例仅将步骤(2)-(4)循环两次。

实施例15

本实施例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本实施例将步骤(2)-(4)循环4次。

对比例2

本对比例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本对比例灭活处理中仅添加纳米单宁，而不采用微波辐照辅助。

对比例3

本对比例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本对比例灭活处理中仅采用微波辐照辅助方法，而不添加纳米单宁。

对比例4

本对比例与实施例1的改良阿斯蒂缺氮发酵方法基本相同，所不同的是，本对比例灭活处理中采用未经改性处理的葡萄籽单宁代替纳米单宁。

实验例3

本实验例采用与实验例2相同的测试方法对实施例10-15、对比例2-4制备的酒体中香气物质种类和含量进行考察，并计算实施例10-15、对比例2-4制备的酒体中香气物质的相对含量(以峰面积表示)测试结果如下表4所示。

表4.实施例10-15、对比例2-4制备的酒体中香气物质相对含量测试结果

由表4可知，实施例10-12中采用不同水果作为发酵原料制备的酒体中各种香气成分的含量均在较高水平，表明本申请的改良阿斯蒂缺氮发酵方法可以应用于各种不同种类的果酒酿造中。

与实施例1相比，实施例13-15中步骤(2)-(4)的重复次数不同，实验结果显示，实施例13中仅将步骤(2)-(4)操作一次制备的荔枝酒体中各种香气成分的含量有高有低，均高于对比例制备的酒体中对应的香气物质含量。

与实施例1相比，对比例2、对比例3中将纳米单宁和微波辐照辅助技术单独使用，制备的酒体中香气物质含量明显降低，表明本申请的良阿斯蒂缺氮发酵方法中，需要将纳米单宁和微波辐照辅助技术结合使用，才能是制备的酒体具有较高含量的香气物质，两者缺一不可。

与实施例1相比，对比例4中直接采用未经改性处理的植物单宁，制备的酒体中香气物质含量明显降低。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种改良阿斯蒂缺氮发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)原料前处理：以水果为原料，削皮、去核后得发酵原料；

(2)接种酵母：往所述发酵原料中接种酵母菌；

(3)发酵处理：控制发酵温度为10-30℃，发酵时间为4-120h；

(4)灭活处理：发酵结束后，加入纳米单宁并采用微波辐照辅助技术对残余酵母菌进行灭活处理；

(5)澄清过滤得到发酵酒液。

2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，按重量份数计，所述发酵原料为100份、所述酵母菌为0.01-0.2份、所述纳米单宁为0.5-14.5份。

3.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)中的水果为荔枝、葡萄、火龙果、蜜柚、桑葚、橄榄、柚柑中的至少一种。

4.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酵母菌为非酿酒酵母；优选地，所述非酿酒酵母为乳酸克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母和戴尔有孢圆酵母中的至少一种。

5.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤(4)中微波辐照频率为500-2500MHz，输出功率为500-4000W，辐照时间为0.5-20min。

6.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述纳米单宁为单宁-金属离子的配位化合物。

7.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，将所述步骤(2)-(4)循环2-4次。

8.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，将所述步骤(2)-(4)循环3次，包括如下(a)-(d)中的至少一项：

(a)第一次酵母菌接种量为0.004-0.09重量份；第二次酵母菌接种量为0.003-0.06重量份；第三次酵母菌接种量为0.005-0.05重量份；

(b)第一次发酵处理的发酵温度为15-25℃，发酵时间为4-72h；第二次发酵处理的发酵温度为20-30℃，发酵时间为12-120h；第三次发酵处理的发酵温度为10-25℃，发酵时间为4-48h；

(c)第一次灭活处理中纳米单宁的用量为0.02-10份；第二次灭活处理中纳米单宁的用量为0.02-1.5份；第二次灭活处理中纳米单宁的用量为0.5-3份；

(d)第一次灭活处理中的微波辐照频率为500MHz，输出功率为2000-4000W，辐照时间为5-15min；第二次灭活处理中的微波辐照频率为2500MHz，输出功率为500-1500W，辐照时间为0.5-12min；第三次灭活处理中的微波辐照频率为1000MHz，输出功率为1000-2000W，辐照时间为5-20min。

9.如权利要求1-8任一项所述的发酵方法在制备发酵果酒中的应用。

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