CN112472693A - 一种体型结构的植物单宁抗菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属杀生剂领域，公开了一种体型结构的植物单宁抗菌剂和制备方法及应用，采用亲核试剂对植物单宁进行降解，再通过酚醛缩合反应，既增加了植物单宁抗菌剂产物的分子量，也增加了C6‑C6键的数量，使得所得产物更具“空间体型”的结构特点；同时，在酚醛缩合反应过程中，借助微波场的非热效应使反应过程能够均一化进行，同时也加快了反应速度，最终获得分子结构具有高度支链化、分子量大、物理化学状态稳定的植物单宁抗菌剂；同时，本发明通过先降解，后缩合的方式，避免了不经降解直接缩合而出现分子量难以调控或者分子量过大易形成沉淀的缺陷。本发明所述的植物单宁抗菌剂是一种广谱抗菌剂，适用于制备杀生剂中，应用前景广泛。

Description

一种体型结构的植物单宁抗菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于杀生剂技术领域，具体涉及一种体型结构的植物单宁抗菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
牛蛙(Rana catesbeiana)属于脊索动物门(Chordata)、脊椎动物亚门(Vertebrate)、两栖纲(Amphibia)、无尾目(Aunra)、蛙科(Ranidae)、蛙属(Rana)。因其雄性鸣叫声如牛而得名，是世界上最著名的食用蛙类。牛蛙是一种大型可食用蛙类，其肉质洁白细嫩、味道鲜美、营养丰富，每100克蛙肉中含蛋白质19.9克，脂肪0.3克，是一种高蛋白、低脂肪、低热量、低胆固醇的动物性营养保健食品。牛蛙的皮、内脏、油、激素、腺体和胆汁等可作为工业、养殖业及医药业等行业的原材料，而具有极高的应用价值。牛蛙具有适应性强、生长快、繁殖力高、味道鲜美、营养丰富等特点，因此养殖利润较高，养殖范围和规模推广很快。目前牛蛙养殖已基本覆盖全国各地，是我国特种水产养殖的主要经济动物之一。
牛蛙在野外自然条件下很少生病，是因为牛蛙皮肤会分泌多种杀菌素并保护皮肤，同时牛蛙自身的免疫系统，也能杀灭入侵体内的病原菌。但是牛蛙的抗病能力是有限的，随着养殖规模和养殖密度的不断加大，生物性健康饵料供不应求、种质资源退化、养殖环境恶化、养殖技术匮乏等诸多问题也不断显现，养殖病害逐渐增多并日趋严重，牛蛙也会感染各种疾病。与其他水产养殖动物一样，在人工养殖条件下，养殖密度较大，个别牛蛙得病，不及时加以控制，就会引发传染病，造成牛蛙的大量感染，大批的死亡，给养殖户造成了严重的经济损失，严重阻碍了牛蛙养殖业的健康发展。
目前已报道的牛蛙疾病主要有由虹彩病毒等引起的疾病，由车轮虫、舌杯虫、斜管虫和锚头蚤等引起的寄生虫病，以及由假单胞菌、气单胞菌、爱德华氏菌、链球菌、葡萄球菌、变形菌、不动杆菌、伊丽莎白菌和耶尔森氏菌等引起的细菌性疾病。在牛蛙疾病中以细菌性病害的危害最严重，近年来，很多牛蛙养殖场经常发生和流行爱德华氏菌病、红腿病和腐皮病，导致患病蛙大量死亡，造成经济损失严重，因而细菌性传染病是牛蛙养殖疾病防控的主要对象。其中，腐皮病是牛蛙养殖过程中最常见的疾病，在部分养蛙地区，此病对人工养殖牛蛙的危害程度已经成为决定牛蛙养殖成败的一个重要因子，腐皮病又叫烂皮病、脱皮病，包括营养性腐皮病和创伤性腐皮病。发病初期，牛蛙头部背面、背部和躯干部皮肤失去光泽，皮肤湿度降低，体色变黑，出现白斑花纹，随后表皮层脱落，真皮层开始腐烂，显露肌肉，眼球逐渐变白，食欲减退至停食，有的可见关节肿胀，伏于阴暗处，严重者死亡。营养性腐皮病是由于长期摄食缺乏维生素饲料所导致，全年可发生，成蛙比幼蛙和青年蛙多发，是由于饲料单调而缺乏多种维生素特别是维生素A、D而发病，以蚕蛹等动物性饲料为饵料的蛙场发病率较高。病蛙特征症状是视力下降，烂眼。创伤性腐皮病是牛蛙腐皮病防治的主要对象，因牛蛙相互撕咬、碰伤导致体表皮肤破损致使病原菌侵入引起发病。多在四肢和头部出现腐皮症状，刚变态的幼蛙发病率最高，致病菌复杂多样，主要为奇异变形菌、克氏耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌等。放养密度高，管理不善，水质不良等因素促发，流行广，传染快，难于控制，死亡率为30％以上，有的高达90％，且此病常与由嗜水气单胞菌引起的红腿病并发，给牛蛙养殖业带来巨大经济损失。
随着牛蛙放养密度不断增加和水体养殖环境的污染，蛙类腐皮病的发生越来越频繁，危害越来越严重。同时养殖户对抗生素的不合理使用，为了控制病害发生而不断增加抗菌药，过量乱用滥用抗菌药物，增强了病原菌的耐药性，致使细菌性病害防控难度增加，最终给食品安全带来巨大隐患。随着国家对抗生素类药物的使用限制，寻找抗生素替代物是发展牛蛙绿色生态养殖的必然趋势。
植物单宁是植物体内一类含有酚基团的次生代谢化合物，广泛存在于各种水果、蔬菜、茶类及各种饮品中，在植物体内，除纤维素、半纤维素和木质素外，植物单宁的含量最高。由于植物单宁结构的独特性，使其具有极高的营养价值和抗氧化、抑菌、抗病毒、抗癌以及预防心脑血管疾病等多种生理功能，在食品、医药行业、化妆品以及保健品等方面得到了广泛的应用。植物单宁是多酚中的一种，它的基本骨架为苯环，苯环上有多羟基取代基。植物单宁不仅与植物的诱导抗病性密切相关，而且还具有显著的抑菌活性。由于植物单宁的天然性、抑菌的广谱性和对人体的无毒性，被称为天然的抗菌剂，同时越来越多的研究者致力于植物单宁抑菌的研究。目前研究比较多的是茶单宁，茶单宁的抑菌范围比较广泛，研究表明茶单宁具有广谱、强效的抑菌性，对自然界中的上百种细菌都有一定的抑制作用，对革兰氏阴性需氧杆菌和球菌、兼性厌氧细菌、球菌及球杆菌、革兰氏阳性球菌、产芽胞杆菌都有明显的抑制作用。葡萄单宁也可以作为天然的抗菌剂，葡萄单宁对多种细菌具有较强的抑制作用，这些细菌既包括革兰氏阴性菌，也包括革兰氏阳性菌，其抑菌效果随着葡萄单宁浓度的增加而增加。我国植物资源非常丰富，开发植物单宁在抗菌剂中的应用有着良好的前景。
虽然植物单宁具备成为牛蛙致病微生物抑制剂的巨大潜力，但不得不承认的是，与现今普遍使用的人工合成抗生素相比，天然植物单宁的抑菌能力明显较弱。因而很难直接替代抗生素在牛蛙养殖过程中使用。
发明内容
本发明提出一种体型结构的植物单宁抗菌剂及其制备方法和应用，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
为了克服上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种植物单宁抗菌剂，其结构式为式(1)或具有式(1)结构的衍生物：
Figure BDA0002808408110000031
其中，
Figure BDA0002808408110000032
Figure BDA0002808408110000033
且为正整数。
作为上述方案的进一步改进，所述植物单宁抗菌剂的平均粒径为220-260nm、平均聚合度为3.2-52.4。
作为上述方案的进一步改进，所述植物单宁抗菌剂中的各个结构单元在结构单元总量中的摩尔占比分别为：C6-C6连接键35-65％，表儿茶素棓酰酯12-48％，表棓儿茶素棓酰酯6-25％，表儿茶素4-33％，儿茶素9-21％，棓儿茶素6-12％，表棓儿茶素7-15％。
作为上述方案的进一步改进，所述植物单宁抗菌剂主要由以下原料制得：植物单宁、亲核试剂、抗氧化剂、极性溶剂、无机酸、中和试剂、醛类物质和表面活性剂。
作为上述方案的进一步改进，所述植物单宁抗菌剂主要由以下原料制得：植物单宁100份、亲核试剂15-350份、抗氧化剂10-120份、极性溶剂10-200份、无机酸0.5-15份、中和试剂0.2-10份、醛类物质0.4-40份和表面活性剂0.2-10份。
作为上述方案的进一步改进，所述植物单宁选自杉单宁、马占相思单宁、杨梅单宁、柚柑单宁、橡椀单宁、落叶松单宁、荆树皮单宁、坚木单宁、五棓子单宁、葡萄籽单宁、柿子单宁、啤酒花单宁中的至少一种；所述亲核试剂为间苯三酚、苄硫醇、半胱胺、半胱胺盐酸盐中的至少一种；所述抗氧化剂为抗坏血酸、没食子酸、生育酚琥珀酸酯钙盐中的至少一种；所述极性溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、丙酮、乙腈中的至少一种；所述无机酸为硫酸、盐酸、磷酸、硝酸、硼酸中的至少一种；所述中和试剂为氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸钠、乙酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾中的至少一种；所述醛类物质为甲醛、乙醛、丙醛、壬醛、癸醛、戊二醛中的至少一种；所述表面活性剂为月桂基磺化琥珀酸单酯二钠、脂肪醇聚氧乙烯醚-3-磺基琥珀酸单酯二钠、椰油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠、单月桂基磷酸酯、单十二烷基磷酸酯钾、月桂醇醚磷酸酯、月桂醇醚磷酸酯钾、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵、椰油酸单乙醇酰胺、椰油酸二乙醇酰胺、椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基氧化胺中的至少一种。表面活性剂增加了产物的稳定性，有效避免由于分子量过大而使得产物沉淀。
一种如本发明所述的植物单宁抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)按所述的植物单宁抗菌剂的配方称取原料，将植物单宁、亲核试剂和抗氧化剂溶解于极性溶剂中，加入无机酸，混合，进行降解，加入中和试剂，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)所得的植物单宁降解产物中加入醛类物质和表面活性剂，进行微波处理，得所述植物单宁抗菌剂。
值得说明的是，单宁的分子结构特征包括：平均聚合度、结构单元组成、空间构型三个方面，其中，平均聚合度和空间构型，对单宁与蛋白质的结合能力密切相关。
(1)平均聚合度
发明人以胶原蛋白的氨基酸序列为模板，在Object Technology Framework(OTF，加利福尼亚大学，美国)平台中的gencollagen模块中搭建原胶原分子模型，利用Discoverystudio对该模型的空间立体结构进行了优化，并以该模型为基础，进行了单宁-原胶原对接实验，结果发现单宁的分子量越大，与原胶原分子形成结合的氨基酸数目就越多的现象，如图1所示，其中，a是聚合度为3的单宁与原胶原分子上A链Hyp18、B链Met21、Hyp24共3个氨基酸残基形成4个氢键结合；b是聚合度为2的单宁分子通过C链Hyp27和Gln32共2个氨基酸残基形成2个氢键相互结合；c是聚合度为2的单宁通过A链Hyp18，B链Pro23，Met24，共3个氨基酸形成3个氢键相互结合；d是聚合度为5的单宁与原胶原分子上A链Hyp18、B链Gly19、Met21和Hyp24共4个氨基酸残基形成7个氢键结合；e是聚合度为6的单宁通过A链Arg35，B链Gly25、Hyp30和C链Gln32、Asp33共5个氨基酸残基形成7个氢键相互结合；f是聚合度为8的单宁分子通过A链Lys9、Ser14、Hyp18、Asp21，B链Met21、Hyp24，C链Lys23、Thr24共8个氨基酸形成9个氢键；因而单宁具有分子量越大，与胶原蛋白形成氢键的数目更多的特点。
为了验证分子模拟获得结果的可靠性，分别使用聚合度为3、5、7、9、11、13、15、30和50的单宁对胶原进行胶原处理，反应结束后测试其热变性温度(图2)。从图2可以看出，分子模拟获得的单宁聚合度越大，胶原热稳定性越高的结论，在实际生化实验中也是成立的。因而可以推导出以下结论：单宁的分子量越大，与蛋白质结合能力越强。
(2)空间构型
按照单宁结构单元间的连接方式，通常将单宁分为“线型”和“体型”两种空间构型。结构单元间以C4-C8位连接形成的单宁为“线型”，而以C6-C6位连接的单宁为“体型”。前人提出具有“体型”空间结构的单宁分子“结构刚性”显著，而“线型”空间结构的单宁分子“刚性”羸弱。分子结构刚性的差异，是造成单宁与蛋白质结合能力显著不同的主要原因之一(图3，从图3可以看出，单宁分子的分子刚性越强，则与蛋白质结合能力越强)。这一理论通过比较荆树皮单宁、坚木单宁、马占相思单宁、原花青定B2和原花青定C1与蛋白质结合性能的差异获得了证实(Bley M.,Covington A.D.Presentation and acceptance ofthe2012John Arthur Wilson memorial lecture scrollournal.American LeatherChemists Association107(8):271-271)。
由此可见，单宁的分子结构与其蛋白质结合能力密切相关，单宁的平均聚合度越大，其蛋白质结合能力越强；体型结构单宁的蛋白质结合能力较线型结构单宁强。基于此理论，发明人尝试通过调节单宁分子量、增加单宁的C6-C6连接数目为目的，对天然的植物单宁进行化学改性处理。
传统的单宁改性方法主要为以下几个途径：1)基于单宁分子中邻位酚羟基金属离子能够发生配位反应的特点，使用3价、4价金属离子(如Fe、Ti、Al、Zr等)与单宁结合，达到增加单宁分子体积的目的；2)利用曼尼希反应，对单宁进行胺甲基化改性处理，能够向单宁分子中引入甲基；3)利用酚醛缩合反应，使单宁分子相互缩合，增大单宁的分子量；4)亚硫酸化处理，向单宁分子中引入亲水的磺酸基并降低单宁的分子量；5)氧化降解降低单宁的分子量等。不难看出的是，上述改性方法仅能单纯的增加或降低单宁的分子量或向其分子中引入其它基团，而对于增加单宁的末端单元含量和支链数目方面，上述方法无法实现。此外，上述方法1)、2)、3)都为直接使单宁相互缩合，缩合反应条件极难控制，十分容易发生缩合过度并形成沉淀的现象，降低反应产物得率。
C4-C8型连接形成直链线型空间结构，而C6-C6型连接形成支链型空间结构。天然单宁结构单元间连接方式大多为C4-C8型，少见C6-C6型。因而自然界中单宁都以线型结构为主，仅有少量的如杨梅单宁、荆树皮单宁含有非常有限的支链型结构。事实上，单宁的C4-C8连接(线型结构)能够与部分亲核试剂发生反应，反应过程中单宁结构单元间的C4-C8连接键随之断裂，此时C环C4位带有正电荷，因而该位置是与亲核试剂发生结合的唯一结合位点。反应结束后，单宁的末端单元脱落，延伸单元的C4位被亲核试剂占据，并以延伸单元-亲核试剂衍生物的形式脱落(如图4所示，亲核试剂与植物单宁发生反应，使单宁延伸单元、末端单元脱落并占据末端单元C4位)。
本发明正是利用了单宁与亲核试剂反应，C4-C8位连接键断裂的同时，C4位被亲核试剂占据的特点，首先用亲核试剂对单宁进行降解反应，在亲核试剂降解过程中，增大亲核反应过程中试剂的用量，提高亲核反应温度、延长反应时间，同时利用抗氧化剂避免过于激烈的反应条件造成产物氧化的现象，最终将大量的单宁分子转化为C4位被亲核试剂占据的植物单宁降解产物的结构单元。
总的来说，本发明首先采用亲核试剂对植物单宁进行降解，降解反应结束后，所得降解产物与醛类物质发生酚醛缩合反应，反应位置为单宁分子A环C6、C8位和C环C4位(如图4和图5所示，从图5可以看出，酚醛缩合反应可导致C6-C6位连接键的形成)，此时由于深度降解产物中结构单元中的C4位已经被占据，因而下一步的酚醛缩合反应无法在C4位进行，而在A环的C6和C8位进行，由此，通过酚醛缩合反应，既增加了植物单宁抗菌剂产物的分子量，又增加了C6-C6键的数量，使得单宁具有“空间体型”结构特点；同时，在酚醛缩合反应过程中，借助微波场的非热效应使反应过程能够均一化进行的同时，也加快了反应进行的速度，通过对植物单宁进行的如上化学改性，最终获得分子结构具有高度支链化、分子量大、物理化学状态稳定的植物单宁抗菌剂。
作为上述方案的进一步改进，步骤1)中，所述降解的温度为25-75℃；所述降解的时长为15-360min。
作为上述方案的进一步改进，步骤2)中，所述微波处理的功率为50-750W；所述微波处理的温度为25-50℃；所述微波处理的时长为15-240min。
如本发明所述的植物单宁抗菌剂在杀生剂领域，尤其是牛蛙致病菌领域中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种体型结构的植物单宁抗菌剂和制备方法及应用，首先采用亲核试剂对植物单宁进行降解，并占据了植物单宁中C4，因而下一步的酚醛缩合反应即在A环的C6和C8位进行，由此，通过酚醛缩合反应，既增加了植物单宁抗菌剂产物的分子量，并且增加了C6-C6键的数量，使得单宁更具有“空间体型”的结构特点；同时，在酚醛缩合反应过程中，借助微波场的非热效应使反应过程能够均一化进行的同时，也加快了反应速度，通过对植物单宁的如上化学改性，最终获得分子结构具有高度支链化、分子量大、物理化学状态稳定的植物单宁抗菌剂；同时，本发明通过先降解，后缩合的方式，避免了不经降解直接缩合而出现分子量难以调控或者分子量过大易形成沉淀的缺陷。此外，本发明所述的植物单宁抗菌剂是一种广谱抗菌剂，适用于制备杀生剂中，具有抑制常见水生致病菌生长的作用，可预防和治疗水产动物的细菌性疾病，不仅可以防控蛙类动物的疾病，也可以用于鱼、虾、贝类等水产动物的防控，满足水产养殖中的大规模实际应用，应用前景广泛。
附图说明
图1是利用分子模拟(Discovery studio)研究原胶蛋白与单宁的结合程度；
图2是单宁的平均聚合度与胶原热变性温度的关系曲线；
图3是具有不同结构刚性的单宁分子与蛋白质结合示意图；
图4是植物单宁抗菌剂制备方法中的步骤1)的过程示意图；
图5是植物单宁抗菌剂制备方法中的步骤2)的过程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明所作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时，下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例1植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份冷杉单宁中加入15份间苯三酚，10份抗坏血酸，并溶解于150份甲醇中，加入0.5份盐酸并充分混合后，在温度为25℃条件下，反应360分钟，反应结束后加入0.8份氢氧化钠，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入甲醛2份，脂肪醇聚氧乙烯醚-3-磺基琥珀酸单酯二钠10份，随后转移至微波反应器中，在功率600W，温度40℃条件下处理120分钟，得植物单宁抗菌剂成品1。
实施例2植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份马占相思单宁中加入75份半胱胺，80份没食子酸，并溶解于10份甲醇中，加入11份硫酸并充分混合后，在温度为30℃条件下，反应360分钟，反应结束后加入0.6份乙酸钾，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入癸醛0.4份，月桂基磺化琥珀酸单酯二钠10份，随后转移至微波反应器中，在功率500W，温度40℃条件下处理60分钟，得植物单宁抗菌剂成品2。
实施例3植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份杨梅单宁中加入350份半胱胺，15份抗坏血酸，并溶解于200份乙醇中，加入0.8份盐酸并充分混合后，在温度为50℃条件下，反应300分钟，反应结束后加入10份乙酸钾，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入甲醛10份，单月桂基磷酸酯8份，随后转移至微波反应器中，在功率750W，温度25℃条件下处理60分钟，得植物单宁抗菌剂成品3。
实施例4植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份柚柑单宁中加入100份间苯三酚，120份没食子酸，并溶解于20份乙醇中，加入11份硫酸并充分混合后，在温度为70℃条件下，反应15分钟，反应结束后加入0.2份氢氧化钠，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入戊二醛40份，椰油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠5份，随后转移至微波反应器中，在功率550W，温度25℃条件下处理120分钟，得植物单宁抗菌剂成品4。
实施例5植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份橡椀单宁中加入250份半胱胺盐酸盐，120份抗坏血酸，并溶解于200份丙醇中，加入12份磷酸并充分混合后，在温度为75℃条件下，反应30分钟，反应结束后加入5份磷酸氢二钠，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入乙醛5份，单十二烷基磷酸酯钾1份，随后转移至微波反应器中，在功率600W，温度50℃条件下处理15分钟，得植物单宁抗菌剂成品5。
实施例6植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份落叶松单宁中加入300份间苯三酚，10份抗坏血酸，并溶解于150份乙腈中，加入10份磷酸并充分混合后，在温度为25℃条件下，反应120分钟，反应结束后加入7份氢氧化钾，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入壬醛25份，月桂醇醚磷酸酯钾0.2份，随后转移至微波反应器中，在功率500W，温度50℃条件下处理240分钟，得植物单宁抗菌剂成品6。
实施例7植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份荆树皮单宁中加入180份苄硫醇，70份没食子酸，并溶解于20份丙醇，加入8份硼酸并充分混合后，在温度为50℃条件下，反应240分钟，反应结束后加入5份氢氧化钾，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入丙醛30份，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵0.2份，随后转移至微波反应器中，在功率550W，温度50℃条件下处理60分钟，得植物单宁抗菌剂成品7。
实施例8植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份坚木单宁中加入50份苄硫醇，80份没食子酸，并溶解于10份正丁醇中，加入0.5-6份硼酸并充分混合后，在温度为50℃条件下，反应120分钟，反应结束后加入6份磷酸氢二钠，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入癸醛15份，月桂醇醚磷酸酯10份，随后转移至微波反应器中，在功率50W，温度30℃条件下处理15分钟，得植物单宁抗菌剂成品8。
实施例9植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份五棓子单宁中加入30份半胱胺，20份生育酚琥珀酸酯钙盐，并溶解于80份正丁醇中，加入5份硝酸并充分混合后，在温度为45℃条件下，反应60分钟，反应结束后加入3份磷酸二氢钾，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入戊二醛35份，椰油酸单乙醇酰胺0.5份，随后转移至微波反应器中，在功率500W，温度50℃条件下处理240分钟，得植物单宁抗菌剂成品9。
实施例10植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份葡萄籽单宁中加入20份苄硫醇，50份生育酚琥珀酸酯钙盐，并溶解于180份丙酮中，加入2份硝酸并充分混合后，在温度为65℃条件下，反应60分钟，反应结束后加入0.8份氢氧化钾，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入丙醛8份，月桂酰胺丙基氧化胺1份，随后转移至微波反应器中，在功率550W，温度25℃条件下处理240分钟，得植物单宁抗菌剂成品10。
实施例11植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份柿子单宁中加入25份半胱胺盐酸盐，75份没食子酸，并溶解于150份丙酮中，加入1份硼酸并充分混合后，在温度为70℃条件下，反应50分钟，反应结束后加入6份磷酸二氢钾，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入乙醛0.4份，椰油酸二乙醇酰胺3份，随后转移至微波反应器中，在功率750W，温度45℃条件下处理90分钟，得植物单宁抗菌剂成品11。
实施例12植物单宁抗菌剂的制备
植物单宁抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)向100份啤酒花单宁中加入70份半胱胺盐酸盐，15份生育酚琥珀酸酯钙盐，并溶解于120份乙腈中，加入1.5份硝酸并充分混合后，在温度为75℃条件下，反应240分钟，反应结束后加入9份乙酸钠，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)获得的植物单宁降解产物中，加入甲醛40份，椰油酰胺丙基甜菜碱5份，随后转移至微波反应器中，在功率750W，温度40℃条件下处理60分钟，得植物单宁抗菌剂成品12。
产品性能检测1
结合Laetitia和Kennedy等人的方法(Mouls,L.；Fulcrand,H.UPLC-ESI-MS studyof the oxidation markers released from tannin depolymerization:toward abetter characterization of the tannin evolution over food and beverageprocessing.J.Mass Spectrom.2012,47,1450–1457；Kennedy,J.A.；Taylor,A.W.Analysisof proanthocyanidins by high-performance gel permeationchromatography.J.Chromatogr.A 2003,995,99–107)，利用热酸降解法对实施例1-12制备的植物单宁抗菌剂宁进行了二次降解处理，利用高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)对二次降解产物进行了定性与定量分析，获得植物单宁抗菌剂的平均聚合度、结构单元种类和结构单元含量，利用动态光散射(DLS)分析了其平均粒径，结果如表1所示。
表1实施例1-12分别所得的植物单宁抗菌剂的化学结构信息
Figure BDA0002808408110000111
由表1可以看出，该抗菌剂的平均粒径为220-260nm、平均聚合度为3.2-52.4，植物单宁抗菌剂的结构单元中，C6-C6连接键的数量为35-65％，表儿茶素棓酰酯占结构单元总量的12-48％，表棓儿茶素棓酰酯占结构单元总量的6-25％，表儿茶素占结构单元总量的4-33％，儿茶素占结构单元总量的9-21％，棓儿茶素占结构单元总量的6-12％，表棓儿茶素占结构单元总量的7-15％。
产品性能检测2
为了考察本发明的实施效果，采用琼脂扩散法(牛津杯法)测试实施例制备的单宁对牛蛙致病菌的抑菌能力。用无菌镊子夹取已高压蒸汽灭菌的牛津杯，轻轻平置于已涂布牛蛙致病菌液的培养皿表面，每种菌做3个平行。每个培养皿一字对称放置2只牛津杯，用无菌移液器分别加入植物单宁溶液，并以0.9％的无菌生理盐水和天然啤酒花单宁作对照，分别记为对比例1和对比例2。细菌平板于36℃恒温培养箱中培养48h，然后取出观察有无抑菌作用。结果如表2所示。
表2实施例1-12的植物单宁抗菌剂和对比例1-2分别的抑菌效果
Figure BDA0002808408110000121
从表2可以看出，实施例1-12所制备的植物单宁抗菌剂对奇异变形菌、克氏耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌的培养过程中，都发现了明显的抑菌圈，且抑菌圈的直径都大于对比例1和2的生理盐水及天然啤酒花单宁，这说明牛蛙致病菌有显著的抑制作用(抑菌圈直径大于生理盐水)，且经过本发明涉及的改性方法，抑菌作用显著增强(抑菌圈直径明显大于天然啤酒花单宁)。
对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。

Claims (10)

1.一种植物单宁抗菌剂，其特征在于，其结构式为式(1)或为具有式(1)结构的衍生物：
Figure FDA0002808408100000011
其中，
Figure FDA0002808408100000012
，n为正整数。
2.根据权利要求1所述的植物单宁抗菌剂，其特征在于：所述植物单宁抗菌剂的平均粒径为220-260nm、平均聚合度为3.2-52.4。
3.根据权利要求1所述的植物单宁抗菌剂，其特征在于，所述植物单宁抗菌剂中的各个结构单元的摩尔占比分别为：C6-C6连接键35-65％，表儿茶素棓酰酯12-48％，表棓儿茶素棓酰酯6-25％，表儿茶素4-33％，儿茶素9-21％，棓儿茶素6-12％，表棓儿茶素7-15％。
4.根据权利要求1所述的植物单宁抗菌剂，其特征在于：所述亲核试剂为间苯三酚、苄硫醇、半胱胺、半胱胺盐酸盐中的至少一种；所述醛类物质为甲醛、乙醛、丙醛、壬醛、癸醛、戊二醛中的至少一种。
5.权利要求1-4任一项所述的植物单宁抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将植物单宁、亲核试剂和抗氧化剂溶解于极性溶剂中，加入无机酸，混合，进行降解，加入中和试剂，获得植物单宁降解产物；
2)向步骤1)所得的植物单宁降解产物中加入醛类物质和表面活性剂，进行微波处理，得所述植物单宁抗菌剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的植物单宁抗菌剂，主要由以下原料制得：植物单宁100份、亲核试剂15-350份、抗氧化剂10-120份、极性溶剂10-200份、无机酸0.5-15份、中和试剂0.2-10份、醛类物质0.4-40份和表面活性剂0.2-10份。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述植物单宁选自杉单宁、马占相思单宁、杨梅单宁、柚柑单宁、橡椀单宁、落叶松单宁、荆树皮单宁、坚木单宁、五棓子单宁、葡萄籽单宁、柿子单宁、啤酒花单宁中的至少一种；所述抗氧化剂为抗坏血酸、没食子酸、生育酚琥珀酸酯钙盐中的至少一种；所述极性溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、丙酮、乙腈中的至少一种；所述无机酸为硫酸、盐酸、磷酸、硝酸、硼酸中的至少一种；所述中和试剂为氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸钠、乙酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾中的至少一种；所述表面活性剂为月桂基磺化琥珀酸单酯二钠、脂肪醇聚氧乙烯醚-3-磺基琥珀酸单酯二钠、椰油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠、单月桂基磷酸酯、单十二烷基磷酸酯钾、月桂醇醚磷酸酯、月桂醇醚磷酸酯钾、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵、椰油酸单乙醇酰胺、椰油酸二乙醇酰胺、椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基氧化胺中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述降解的温度为25-75℃；所述降解的时长为15-360min。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述微波处理的功率为50-750W；所述微波处理的温度为25-50℃；所述微波处理的时长为15-240min。
10.权利要求1-4任一项所述的植物单宁抗菌剂在制备杀生剂中的应用。
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