CN114292825A

CN114292825A - 一种托品酮的合成方法

Info

Publication number: CN114292825A
Application number: CN202111549905.0A
Authority: CN
Inventors: 瞿旭东; 林芝
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN114292825B

Abstract

本发明公开了一种托品酮的合成方法，合成生物学和酶催化技术领域。本发明通过联用能产生4‑(1‑甲基‑2‑吡咯烷基)‑3‑氧代丁酸的工程菌株与能催化4‑(1‑甲基‑2‑吡咯烷基)‑3‑氧代丁酸转化成托品酮的单胺氧化酶合成了托品酮。所述的工程菌株含有合成4‑(1‑甲基‑2‑吡咯烷基)‑3‑氧代丁酸的相关基因；所述的单胺氧化酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质(即MAO‑N)。本发明为托品酮的合成提供了一条绿色高效的新路线，具有较好的工业应用前景。

Description

一种托品酮的合成方法

技术领域

本发明属于合成生物学和酶催化技术领域，更具体地，涉及一种托品酮的合成方法。

背景技术

托品酮(Tropinone)是一类植物来源含有叔胺结构的莨菪烷类生物碱，可以用于合成阿托品等天然托品烷类药物，其化学名称为8-甲基-8氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-酮。目前托品烷类药物主要是从植物中提取得到。虽然化学家们很早就已经实现了托品酮的化学全合成(Robinson,R.LXIII.A synthesis of tropinone.Chem.Soc.,Trans.,1917,111,762-768.)，但是因难以控制后续合成托品烷类药物的手性结构，环境污染等问题而没有得到很好的应用。因此，研究者们开始关注托品烷类天然产物的生物合成途径解析以及生物合成方法，期望能获得更加绿色高效的合成方法。

近年来发展的合成生物学技术，通过将目标化合物生物合成途径上相关的基因导入微生物底盘中，实现了一些植物来源重要药用化合物的异源高效合成(Kotopka,B.J.etal.Synthetic biology strategies toward heterologous phytochemicalproduction.Natural product reports 2018,35,902-920；Li,S.et al.Strategies formicrobial synthesis of highvalue phytochemicals.Nature Chemistry 2018,10,395-404.)。随着托品酮生物合成途径被阐明，合成生物学家们也通过模拟托品酮的天然生物合成途径，将相关的合成基因导入异源微生物底盘中，实现了托品酮的微生物合成(图2)，然而效率都十分的低下(Huang,J.et al.Tropane alkaloids biosynthesis involves anunusual typeⅠIⅠpolyketide synthase and non-enzymatic condensation.NatureCommunications,2019,10,4036；Ping,Y.et al.Building Microbial Hosts forHeterologous Production of N-Methylpyrrolinium.[J].ACS Synthetic Biology,2019,8,257-263；Ping,Y.et al.De Novo Production of the Plant-Derived Tropineand Pseudotropine in Yeast.ACS Synthetic Biology,2019,8,1257-1262；CN111826355 A)。

已有研究表明，无论在植物还是微生物代谢工程中，托品酮生物合成均是托品烷类天然产物生物合成的关键限速步骤，极大地限制了下游药用托品烷生物碱的积累。而托品酮生物合成的最关键的限速步骤就是细胞色素P450介导的催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸形成托品酮这一步。植物的P450为膜蛋白，具有表达量低下、不够稳定，以及难以利用酶工程改造等缺陷。近期我们筛选到一种黄素依赖型的单胺氧化酶(monoamineoxidase，MAO)可以替代原本的P450催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸形成托品酮，使得该步合成效率有了显著提升。基于上述背景，本发明将该单胺氧化酶与可合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的工程菌株巧妙的联合使用，获得了托品酮从头合成的新路线，使得托品酮的产量相较于原本途径有了显著，为托品类药物微生物生产工艺的发展奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中生物合成托品酮存在的问题，提供一种托品酮的合成方法。本发明联用能产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸工程菌株与能催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸转化成托品酮的单胺氧化酶合成托品酮，为托品酮的合成提供了一条新路线，于托品烷类药物微生物生产具有较好的应用价值。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种托品酮的合成方法，其联用能产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的工程菌株与能催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸转化成托品酮的单胺氧化酶合成托品酮，合成路线如图1所示。

所述的能产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的工程菌株，其含有合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的相关基因，可通过将合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的相关基因中的一个或多个导入到宿主菌株中获得。所述的宿主菌株包括原核生物、真核生物，优选为大肠杆菌、酵母。更为优选的，所述的宿主菌株为酿酒酵母。

所述的合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的相关基因包括：可催化L-鸟氨酸形成腐胺的鸟氨酸脱羧酶编码基因，可催化腐胺形成N-甲基腐胺的N-甲基转移酶编码基因，可催化N-甲基腐胺形成N-甲基氨基丁醛的二胺氧化酶编码基因，以及可催化N-甲基吡咯啉与两轮丙二酰辅酶A介导的脱羧缩合形成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的III型聚酮合酶编码基因。

所述的单胺氧化酶能够生物转化或体外催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸转化成托品酮，其包括但不局限于下述蛋白质：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的由(1)衍生的蛋白质；

(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有80％以上同源性的蛋白质，优选地95％以上同源性，更优选地98％以上同源性。

上述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的单胺氧化酶的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的托品酮的合成方法包括如下步骤：

(1)将能产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸工程菌株接种到液体培养基中进行发酵培养，离心收集发酵上清液，冻干浓缩发酵上清液，优选冻干浓缩至原体积的1/40～1/10。

(2)将单胺氧化酶、以及FAD和/或过氧化物酶加入到浓缩的发酵上清液中，通过单胺氧化酶转化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸合成托品酮。其中，单胺氧化酶的终浓度优选为5～200μg/mL，FAD的终浓度优选为0.1～2mM，过氧化物酶的终浓度优选为5～200μg/mL。进一步地，所述的单胺氧化酶为含有单胺氧化酶编码基因的异源表达菌株被诱导表达积累足够的单胺氧化酶后，收集菌体，用缓冲液重悬，破碎菌体后冻干得到。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明将可产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的工程菌株与可催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸形成托品酮的单胺氧化酶联用，创建了一条绿色高效的合成托品酮的新方法。相较于原来的生物合成方法托品酮产量有了显著提升，具有较高的应用价值。

附图说明

图1：本发明托品酮合成路线；

图2：托品酮传统微生物合成途径以及本发明途径；

图3：单胺氧化酶异源表达粗酶液蛋白胶图；

图4：托品酮的LC-MS检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，分子生物学实验包括蛋白表达，培养基和试剂配制等等，如无特殊说明，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。

本发明中涉及菌株：大肠杆菌(Escherichia coli BL21)购自北京全式金生物技术有限公司，工程菌株PL1-AaPKS来自中国科学院上海植物生理生态研究所周志华课题组，该工程菌株以酿酒酵母为地盘，转入了可以合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的相关基因，包括：可催化L-鸟氨酸形成腐胺的鸟氨酸脱羧酶编码基因，可催化腐胺形成N-甲基腐胺的N-甲基转移酶编码基因，可催化N-甲基腐胺形成N-甲基氨基丁醛的二胺氧化酶编码基因，以及可催化N-甲基吡咯啉与两轮丙二酰辅酶A介导的脱羧缩合形成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的III型聚酮合酶编码基因(Ping,Y.et al.Building MicrobialHosts for Heterologous Production of N-Methylpyrrolinium.[J].ACS SyntheticBiology,2019,8,257-263；Ping,Y.et al.De Novo Production of the Plant-DerivedTropine and Pseudotropine in Yeast.ACS Synthetic Biology,2019,8,1257-1262；)。

LB培养基：酵母浸粉0.5g、胰蛋白胨1.0g、氯化钠1.0g、去离子水100mL；

LA培养基：酵母浸粉0.5g、胰蛋白胨1.0g、氯化钠1.0g、琼脂2.0g、去离子水100mL；

脱盐Buffer：HEPES 50mM、NaCl 100mM、10％甘油，pH＝7.5；

YPD酵母培养基：酵母膏1g、葡萄糖2g、蛋白胨2g、去离子水100mL。

实施例1：工程菌株PL1-AaPKS发酵积累4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸

从-80℃冰箱中取出工程菌株PL1-AaPKS，接种到5mL YPD培养基中，在30℃摇床中培养(转速200rpm)2～3天，按10％～15％的接种量接种至100mL YPD培养基，30℃培养5天，离心收集发酵上清液，冻干浓缩至原来体积5～10mL。

实施例2：单胺氧化酶的粗酶液冻干粉制备

单胺氧化酶基因序列(SEQ ID NO.2所示)合成及单胺氧化酶表达质粒pET28a-MAO-N构建由金唯智生物科技有限公司完成。将大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21从-80℃冰箱中取出并置于冰上，用移液枪吸取1微升构建的单胺氧化酶表达质粒pET28a-MAO加入感受态中，轻轻混匀后，冰浴30分钟，然后放于42℃水浴锅热激90s，立刻放于冰上冰浴2min，向转化体系中加入1mL LB。37℃摇床培养40-60min后取出低速离心3min，弃去大部分上清，用移液枪轻轻吹打重悬菌体，将其涂布在含50μg/mL卡那霉素抗生素的LA平板上，37℃培养箱中培养8-12h，获得的带有卡那霉素抗性的转化子即为单胺氧化酶异源表达菌株。

取单胺氧化酶异源表达菌株接种到5mL LB(含50μg/mL卡那霉素抗生素)中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，转接至500mL LB(含50μg/mL卡那霉素抗生素)中，37℃摇床震荡培养(转速220rpm)至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，18℃诱导表达18-20h，离心收集菌体，使用10mL脱盐Buffer重悬，超声破碎菌体后，12000rpm低温离心，取上清液20μL，加入5μL的5×loading buffer混匀，煮沸10min使蛋白变性。离心取10μL上清点样。配制12.5％的SDS蛋白凝胶，用凝胶电泳仪电压90V浓缩样品，160V分离不同大小的蛋白。跑胶完成后，将蛋白电泳胶放入蛋白胶染色仪中，检查染色仪中染色液与脱色液是否足够，开启染色仪染色，结束后查看结果是否含有55kDa大小的单胺氧化酶(蛋白胶如图3)，如果有则将剩余上清冻干得粗酶冻干粉。

通过上述方法成功表达包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的MAO-N在内的11种不同来源的单胺氧化酶，采用体外生物转化方式对这些单胺氧化酶的活性进行测试，发现只有MAO-N可以催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸形成托品酮。

实施例3：生物转化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸生成托品酮

往200μL实施例1浓缩的发酵液中加入单胺氧化酶粗酶冻干粉至终浓度为50μg/mL，同时加入FAD至终浓度为1mM，过氧化物酶至终浓度为25μg/mL；4℃转化5～7天，冻干反应液，用200μL乙腈重悬，离心取上清用LC-MS检测托品酮的生成(MS检测结果如图4)，结果显示该反应的转化率高达90％。

LC-MS检测条件：

仪器：SHIMADZU LCMS-2020UPLC-MS；

分析柱：R227-32015-03Shim-pack Velox Biphenyl(2.7μm，2.1x100 mm，岛津公司)，流速为0.4mL min^-1，检测的流动相为(A＝去离子水，B＝含0.1％甲酸的CH₃CN)。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种托品酮的合成方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Ser Arg Asp Gly Tyr Gln Trp Thr Pro Glu Thr Gly Leu Thr

1 5 10 15

Gln Gly Val Pro Ser Leu Gly Val Ile Ser Pro Pro Thr Asn Ile Glu

20 25 30

Asp Thr Asp Lys Asp Gly Pro Trp Asp Val Ile Val Ile Gly Gly Gly

35 40 45

Tyr Cys Gly Leu Thr Ala Thr Arg Asp Leu Thr Val Ala Gly Phe Lys

50 55 60

Thr Leu Leu Leu Glu Ala Arg Asp Arg Ile Gly Gly Arg Ser Trp Ser

65 70 75 80

Ser Asn Ile Asp Gly Tyr Pro Tyr Glu Met Gly Gly Thr Trp Val His

85 90 95

Trp His Gln Ser His Val Trp Arg Glu Ile Thr Arg Tyr Lys Met His

100 105 110

Asn Ala Leu Ser Pro Ser Phe Asn Phe Ser Arg Gly Val Asn His Phe

115 120 125

Gln Leu Arg Thr Asn Pro Thr Thr Ser Thr Tyr Met Thr His Glu Ala

130 135 140

Glu Asp Glu Leu Leu Arg Ser Ala Leu His Lys Phe Thr Asn Val Asp

145 150 155 160

Gly Thr Asn Gly Arg Thr Val Leu Pro Phe Pro His Asp Met Phe Tyr

165 170 175

Val Pro Glu Phe Arg Lys Tyr Asp Glu Met Ser Tyr Ser Glu Arg Ile

180 185 190

Asp Gln Ile Arg Asp Glu Leu Ser Leu Asn Glu Arg Ser Ser Leu Glu

195 200 205

Ala Phe Ile Leu Leu Cys Ser Gly Gly Thr Leu Glu Asn Ser Ser Phe

210 215 220

Gly Glu Phe Leu His Trp Trp Ala Met Ser Gly Tyr Thr Tyr Gln Gly

225 230 235 240

Cys Met Asp Cys Leu Ile Ser Tyr Lys Phe Lys Asp Gly Gln Ser Ala

245 250 255

Phe Ala Arg Arg Phe Trp Glu Glu Ala Ala Gly Thr Gly Arg Leu Gly

260 265 270

Tyr Val Phe Gly Cys Pro Val Arg Ser Val Val Asn Glu Arg Asp Ala

275 280 285

Val Arg Val Thr Ala Arg Asp Gly Arg Glu Phe Ala Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Val Cys Thr Ile Pro Leu Asn Val Leu Ser Ser Val His Phe Ser Pro

305 310 315 320

Pro Leu Ser Pro Gln Arg Met Ala Ala Ala Asn Ile Gly His Val Asn

325 330 335

Gln Cys Val Lys Val His Ala Glu Val Ser Cys Pro Asp Met Arg Ser

340 345 350

Trp Ser Gly Ile Ser Tyr Pro Phe Asn Lys Leu Ala Tyr Ala Ile Gly

355 360 365

Asp Gly Thr Thr Pro Ala Gly Asn Thr His Ile Val Cys Leu Gly Gly

370 375 380

Ala His Asn His Ile Gln Pro Glu Glu Asp Val Glu Ala Thr Lys Met

385 390 395 400

Ala Val Glu Asn Met Ser Pro Gly Asn Met Asp Ile Lys Arg Leu Val

405 410 415

Phe His Asn Trp Cys Lys Asp Glu Phe Ala Lys Gly Ala Trp Phe Phe

420 425 430

Ala Pro Pro Gln Leu Leu Ser Lys Ser Leu Asp Glu Leu Arg Cys Arg

435 440 445

His Gly Asn Val Leu Phe Ala Asn Ser Asp Trp Ala Leu Gly Trp Arg

450 455 460

Gly Phe Ile Asp Gly Ala Ile Glu Glu Gly Thr Arg Ala Ala Val Thr

465 470 475 480

Val Ile Glu Glu Leu Arg Pro Ala Pro Ala Val Arg Ser His Leu

485 490 495

<210> 2

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaccagcc gcgatggtta tcagtggacc ccggaaaccg gtctgaccca gggcgtgccg 60

agcctgggcg tgattagtcc gccgaccaat attgaagata ccgataaaga tggtccgtgg 120

gatgttattg ttattggtgg tggttattgt ggtctgaccg caacccgtga tctgaccgtt 180

gcgggtttta aaaccctgct gctggaagca cgtgatcgca ttggtggtcg tagctggagc 240

agcaatattg atggttatcc gtatgaaatg ggtggcacct gggtgcattg gcatcagtca 300

catgtgtggc gtgaaattac ccgttataaa atgcataatg cactgtcacc gagctttaat 360

tttagccgtg gtgttaatca ttttcagctg cgtaccaatc cgaccaccag cacctatatg 420

acccatgaag cagaagatga actgctgcgt agcgcactgc ataaatttac caatgttgat 480

ggcaccaatg gtcgtaccgt tctgccgttt ccgcatgata tgttttatgt tccggaattt 540

cgtaaatatg atgaaatgag ctatagcgaa cgtattgatc agattcgtga tgaactgagc 600

ctgaatgaac gtagtagcct ggaagccttt attctgctgt gcagcggtgg caccctggaa 660

aattctagct ttggtgaatt tctgcattgg tgggcgatga gcggttatac ctatcagggt 720

tgtatggatt gtctgattag ctataaattt aaagatggtc agagcgcctt tgcccgtcgc 780

ttttgggaag aagcggcagg caccggtcgt ctgggctatg tttttggttg cccggttcgt 840

agcgtggtga atgaacgtga tgcggtgcgt gtgacagcgc gtgatggtcg tgaatttgcg 900

gcaaaacgtc tggtttgcac cattccgctg aatgttctga gtagcgttca tttttcaccg 960

ccgctgagcc cgcagcgcat ggccgcagcg aatattggtc atgtgaatca gtgtgttaaa 1020

gtgcatgcag aagttagctg cccggatatg cgtagttgga gcggtattag ttatccgttt 1080

aataaactgg cctatgccat tggtgatggt accaccccgg cgggtaatac ccatattgtg 1140

tgtctgggtg gtgcacataa tcatattcag ccggaagaag atgtggaagc caccaaaatg 1200

gcagttgaaa atatgagccc aggtaatatg gatattaaac gtctggtttt tcataattgg 1260

tgtaaagatg aatttgcgaa aggcgcatgg tttttcgccc cgccgcagct gctgagcaaa 1320

tcactggatg aactgcgttg tcgtcatggt aatgtgctgt ttgccaatag tgattgggca 1380

ctgggttggc gcggttttat tgatggcgcc attgaagaag gtacccgtgc agcggtgacc 1440

gtgattgaag aactgcgtcc ggccccggca gttcgtagcc atctgtaa 1488

Claims

1.一种托品酮的合成方法，其特征在于：所述的方法联用能产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的工程菌株与能催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸转化成托品酮的单胺氧化酶合成托品酮；

所述的单胺氧化酶包括但不局限于下述蛋白质：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有80％以上同源性的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的托品酮的合成方法，其特征在于：所述的能产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的工程菌株含有合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的相关基因。

3.根据权利要求1所述的托品酮的合成方法，其特征在于：所述的能产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的工程菌株通过将合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的相关基因中的一个或多个导入到宿主菌株中获得。

4.根据权利要求2所述的托品酮的合成方法，其特征在于：所述的宿主菌株为大肠杆菌或酵母。

5.根据权利要求2所述的托品酮的合成方法，其特征在于：所述的合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的相关基因包括但不局限于：鸟氨酸脱羧酶编码基因，N-甲基转移酶编码基因，二胺氧化酶编码基因，III型聚酮合酶编码基因。

6.根据权利要求1所述的托品酮的合成方法，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的单胺氧化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1-6任一项所述的托品酮的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将能产生4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸工程菌株接种到液体培养基中进行发酵培养，离心收集发酵上清液，冻干浓缩发酵上清液；

(2)将单胺氧化酶、以及FAD和/或过氧化物酶加入到浓缩的发酵上清液中，通过单胺氧化酶转化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸合成托品酮。

8.根据权利要求7所述的托品酮的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，发酵上清液冻干浓缩至原体积的1/40～1/10。

9.根据权利要求7所述的托品酮的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，单胺氧化酶的终浓度为5～200μg/mL，FAD的终浓度为0.1～2mM，过氧化物酶的终浓度为5～200μg/mL。

10.根据权利要求7所述的托品酮的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的单胺氧化酶为含有单胺氧化酶编码基因的异源表达菌株被诱导表达积累足够的单胺氧化酶后，收集菌体，用缓冲液重悬，破碎菌体后冻干得到。