CN114292275B

CN114292275B - 一类脂肪链取代的三环核苷衍生物及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN114292275B
Application number: CN202111683272.2A
Authority: CN
Inventors: 孙文武; 吴滨; 邓婷婷; 谢宜兵; 马世杰; 黄洁
Original assignee: South Central University for Nationalities
Current assignee: South Central Minzu University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-02-07
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114292275A

Abstract

本发明属于化学合成领域，具体公开了一类脂肪链取代的三环核苷衍生物及其合成方法和应用。所述三环核苷衍生物的结构式如式(I)：

其中R为C2‑C6的烷基、苄基、甲氧基苄基、甲基苄基、氯代苄基或溴代苄基。式(I)化合物采取以下合成反应路线制备：

该合成方法使用对环境友好的AcOH作为溶剂，Ac₂O为添加剂，通过一步环合反应得到。该实验过程操作简单，方便，收率高，反应选择性好。制得的脂肪链取代的三环核苷衍生物具有一定的抑制HSV‑1病毒活性，在制备抗HSV‑1病毒的药物中具有一定前景。

Description

一类脂肪链取代的三环核苷衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于化学合成领域，具体地，涉及式(I)所示的一类脂肪链取代的三环核苷衍生物及其合成方法和应用。

背景技术

病毒感染已经成为严重威胁全世界人类健康的主要公共卫生问题之一。近年来，病毒的迅速传播，已经导致了多起爆发性疾病，严重危害着人类的健康和生命。虽然免疫学的发展为我们提供了有效防治某些病毒感染的方法，但由于许多病毒没有或难以找到合适的疫苗，新病毒株的不断被发现，病毒的变异较快，使原疫苗失败，因此不宜采用免疫方法防治，从而对抗病毒药物的研究与开发也变得越来越重要，研究表明，核苷类药物不仅抑制病毒复制的酶，而且能作为底物类似物参与竞争性渗合入病毒复制的DNA中，阻断DNA链的延长，因此研发核苷类抗病毒药物仍然是抗病毒新药研究的重要方向。

核苷类抗病毒药物的结构由碱基(嘌呤或嘧啶)与核糖基两部分组成，新药研究中对核苷类抗病毒药物的合成设计大多基于这两个组成部分进行修饰或改变。经过修饰和改造的核苷类化合物，结构与天然核苷十分相似。这些非天然核苷无法被病毒识别，但是可以参与病毒的代谢，从而干扰病毒基因的表达。因此对天然核苷的结构进行修饰或改造就可能获得新的抗病毒药物，核苷类药物的碱基杂环结构修饰工作主要包括引入取代基、碱基杂环上的原子替代、环系改变等几方面，而引入取代基的方法常见的有嘧啶环的5’位引入卤素、羟基等取代。核糖部分的结构修饰主要包括在核糖上引入新取代基、核糖环上的官能团替换和原子替换、核糖环的开环及开环核糖链的取代与修饰等方面。

相对于上述的研究工作，对碱基进行结构修饰和改造，合成含有附加环的核苷衍生物的方法起步较晚。直到1991年Boryski等报道合成了一类乙烯型三环核苷化合物，国内外研究人员才逐步开展对三环核苷的研究工作，可喜的是部分三环核苷衍生物具有超过或相当于阿昔洛韦和更昔洛韦的抗HSV和HCMV效果，显示出良好的研究应用前景。用附加环修饰核苷的杂环碱基部分通常会产生新的有趣的物理化学性质(例如，增强的亲脂性、荧光性)或生物学性质。一般来说，具有附加环的核苷类似物表现出作为关键病毒酶抑制剂的选择性和有效活性，或表现出一定的抗癌活性。因此我们开发了一种构建新型取代的三环核苷衍生物的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一类脂肪链取代的三环核苷衍生物及其合成方法和应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：一类脂肪链取代的三环核苷衍生物，其结构式如式(Ι)所示：

其中，R为C2-C6的烷基、苄基、甲氧基苄基、甲基苄基、氯代苄基或溴代苄基。

优选的，R为C2-C4的烷基、苄基、邻甲氧基苄基、对甲基苄基、对氯苄基或对溴苄基。

更优选的，R为乙基、正丁基、苄基、邻甲氧基苄基、对甲基苄基、对氯苄基或对溴苄基，具体的，式(Ι)化合物的结构式为如下之一：

更优选的，R为苄基、对氯苄基或对溴苄基，具体的，式(Ι)化合物为：

最优选的，式(Ι)化合物为：

式(Ι)化合物是一类含有三元氮杂稠环骨架的化合物，三环骨架为平面型刚性结构，本发明的式(Ι)稠环核苷碱基化合物具有一定的抗病毒活性。

本发明的技术方案之二是：上述式(Ι)脂肪链取代的三环核苷衍生物的合成方法，所述合成反应路线如下：

所述合成方法具体包括以下步骤：

以化合物1和TMOP为原料，加入添加剂以及溶剂，在平行反应仪中发生环合反应得到。

所述化合物1为9位R基取代的鸟嘌呤，所述TMOP为1,1,3,3-四甲氧基丙烷，所述添加剂为乙酸酐，所述溶剂是乙酸，所述反应温度为110℃，所述反应时间为2小时。

所述环合反应：化合物1：TMOP：添加剂：溶剂的用量关系为1mmol：1.2mmol：10mmol：4mL。

为了确保产物的品质，上述合成方法还包括对反应液进行后处理的步骤，即浓缩反应液，通过柱层析分离纯化。

需要说明的是：以上合成方法中，所述添加剂乙酸酐的加入，大大提升了目标产物的收率以及反应速率。合成过程中若不添加乙酸酐，其目标产物的得率仍是可观的。

本发明的技术方案之三是：上述式(Ι)脂肪链取代的三环核苷衍生物或上述方法合成得到的式(Ι)脂肪链取代的三环核苷衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用，优选在制备抗HSV-1(单纯疱疹病毒1型)病毒的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

本发明提供了一类结构新颖的脂肪链取代的三环核苷衍生物及其合成方法。现有的合成方法需要首先构建三环核苷碱基，再与卤代烷烃在强碱作用下发生 SN₂反应获得目标化合物，此类方法操作复杂，强碱条件下会导致嘧啶环开环，目标产物的收率低，分离困难。本文发展的合成方法使用对环境友好的AcOH 作为溶剂，Ac₂O为添加剂，该实验过程操作简单，方便，收率高，该反应的化学选择性好，能高效构建一系列结构新颖的脂肪链取代的三环核苷衍生物。本发明制得的脂肪链取代的三环核苷衍生物具有一定的抑制HSV-1病毒活性，其中化合物3c与阳性药阿昔洛韦接近，因此，本发明提供的一类脂肪链取代的三环核苷衍生物在制备抗HSV-1病毒的药物中具有一定前景。

附图说明

图1是光学显微镜下细胞形态图，其中图1(左图)指：正常Vero细胞(*100) 图；图1(右图)指：化合物3c给药后的细胞毒性情况(*100)图。

图2是荧光显微镜下细胞形态图，其中图2(左图)指：正常Vero细胞(*400)；图2(中图)指：HSV-1感染细胞病变情况(*400)；图2(右图)指：化合物 3c给药组细胞病变情况(*400)。

具体实施方式

以下具体实施例仅用于详细说明本发明的具体实施方式，并不限制本发明的权利要求书请求保护的范围。

以下具体实施方式中，

TMOP指1,1,3,3-tetramethoxypropane(1,1,3,3-四甲氧基丙烷)(98％,伊诺凯)；

Ac₂O指Acetic anhydride(乙酸酐)(98.5％，国药集团化学试剂有限公司)； AcOH指Acetic acid(乙酸)(99.5％，阿拉丁)；

化合物1a来源于Angel Pharmatech(纯度为95-98％)；1b、1c、1d、1e、1f、 1g均来源于Chemieliva Pharmaceutical(纯度均为95-98％)。

平行反应仪：联华玻璃仪器(ETS-D5)。

旋转蒸发仪：EYELA (OSB-2100)；真空隔膜泵：WELCH(115046)。

以下涉及的“equiv”是指物质的量当量。

对比例1

化合物3b的制备：

操作如下：将1b(20.7mg,0.1mmol),MeOH(1.0mL)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(25uL,0.15mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中60℃下搅拌12小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3b(3.6 mg,15％yield).Yellow solid,mp:145–147℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.47– 9.42(m,1H),8.96–8.92(m,1H),7.92(s,1H),7.08(dd,J＝7.2and3.8Hz,1H), 4.31–4.24(m,2H),1.96–1.84(m,2H),1.43–1.32(m,2H),0.98–0.90(m,3H).¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃)δ160.9,152.9,150.3,149.4,142.2,137.6,118.7, 109.6,43.6,31.8,19.4,13.1.HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺Calcdfor C₁₂H₁₄N₅O 244.1198, Found244.1193；IR(KBr)v(cm^-1):1719,1537,1488,1385,1366,778.

对比例2

化合物3b的制备：

操作如下：将1b(20.7mg,0.1mmol),MeOH(1.0mL)，浓HCl(12mol/L,12.5uL,0.15mmol)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(25uL,0.15mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌12 小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3b(7.3mg,30％yield).Yellowsolid,mp:145– 147℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.47–9.42(m,1H),8.96–8.92(m,1H),7.92(s,1H),7.08(dd,J＝7.2and 3.8Hz,1H),4.31–4.24(m,2H),1.96–1.84(m,2H), 1.43–1.32(m,2H),0.98–0.90(m,3H).¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃)δ160.9, 152.9,150.3,149.4,142.2,137.6,118.7,109.6,43.6,31.8,19.4,13.1.HRMS(ESI) m/z:[M+H]⁺CalcdforC₁₂H₁₄N₅O 244.1198,Found 244.1193；IR(KBr)v(cm^-1):1719, 1537,1488,1385,1366,778.

对比例3

化合物3b的制备：

操作如下：将1b(20.7mg,0.1mmol),AcOH(0.4mL)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(25uL,0.15mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌12小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF 为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3b (12.7mg,52％yield).Yellow solid,mp:145–147℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ 9.47–9.42(m,1H),8.96–8.92(m,1H),7.92(s,1H),7.08(dd,J＝7.2and3.8Hz, 1H),4.31–4.24(m,2H),1.96–1.84(m,2H),1.43–1.32(m,2H),0.98–0.90(m, 3H).¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃)δ160.9,152.9,150.3,149.4,142.2,137.6, 118.7,109.6,43.6,31.8,19.4,13.1.HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺Calcdfor C₁₂H₁₄N₅O 244.1198,Found244.1193；IR(KBr)v(cm^-1):1719,1537,1488,1385,1366,778.

对比例4

化合物3b的制备：

操作如下：将1b(20.7mg,0.1mmol),AcOH(0.4mL)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(25uL,0.15mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF 为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3b (13.9mg,57％yield).Yellow solid,mp:145–147℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ 9.47–9.42(m,1H),8.96–8.92(m,1H),7.92(s,1H),7.08(dd,J＝7.2and3.8Hz, 1H),4.31–4.24(m,2H),1.96–1.84(m,2H),1.43–1.32(m,2H),0.98–0.90(m, 3H).¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃)δ160.9,152.9,150.3,149.4,142.2,137.6, 118.7,109.6,43.6,31.8,19.4,13.1.HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺Calcdfor C₁₂H₁₄N₅O 244.1198,Found244.1193；IR(KBr)v(cm^-1):1719,1537,1488,1385,1366,778.

实施例1

化合物3a的制备：

操作如下：将1a(17.9mg,0.1mmol),Ac₂O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和 1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3a(20.9mg,97％yield).Yellow solid,mp:243–245℃.¹H NMR (500MHz,CDCl₃)δ9.43(dd,J＝7.2and 2.3Hz,1H),8.95(dd,J＝3.7and 2.4Hz,1H),7.97(s,1H),7.09(dd,J＝7.2and 3.8Hz,1H),4.34(dd,J＝14.7and 7.4Hz, 2H),1.55(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃)δ161.0,152.9,150.1, 149.4,141.8,137.6,118.5,109.7,38.8,15.2.HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺Calcd for C₁₀H₁₀N₅O 216.0885,Found216.0874；IR(KBr)v(cm^-1):3097,1712,1563,1537, 1488,1365,900.

实施例2

化合物3b的制备：

操作如下：将1b(20.7mg,0.1mmol),Ac₂O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和 1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3b(18.9mg,78％yield).Yellow solid,mp:145–147℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.47–9.42(m,1H),8.96–8.92(m,1H),7.92(s,1H), 7.08(dd,J＝7.2and 3.8Hz,1H),4.31–4.24(m,2H),1.96–1.84(m,2H),1.43– 1.32(m,2H),0.98–0.90(m,3H).¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃)δ160.9,152.9, 150.3,149.4,142.2,137.6,118.7,109.6,43.6,31.8,19.4,13.1.HRMS(ESI)m/z: [M+H]⁺Calcdfor C₁₂H₁₄N₅O 244.1198,Found244.1193；IR(KBr)v(cm^-1):1719,1537, 1488,1385,1366,778.

实施例3

化合物3c的制备：

操作如下：将1c(24.1mg,0.1mmol),Ac₂O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和 1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以体积比DCM:THF＝1:1作为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3c(20.8mg,75％yield).Yellowsolid, mp:225–227℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.46(dd,J＝7.2and 2.3Hz,1H), 8.97(dd,J＝3.8and 2.4Hz,1H),7.90(s,1H),7.36–7.29(m,5H),7.10(dd,J＝7.2 and 3.8Hz,1H),5.46(s,2H).¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃)δ161.1,153.0,150.3, 149.6,142.1,137.7,135.5,129.4,128.8,128.3,118.5,109.7,47.2.HRMS(ESI)m/z: [M+H]⁺Calcd forC₁₅H₁₂N₅O 278.1042,Found 278.1035；IR(KBr)v(cm^-1):1728, 1537,1519,1486,1375,720.

实施例4

化合物3d的制备:

操作如下：将1d(27.1mg,0.1mmol),Ac₂O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和 1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以体积比DCM:THF＝1:1作为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3d(24.2mg,79％yield).Yellowsolid,mp:199–201℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃:AcOH-d₄＝18:1)δ9.43(dd,J ＝7.2and2.2Hz,1H),8.98(t,J＝2.7Hz 1H),8.08(s,1H),7.21(t,J＝7.9Hz,1H), 7.12(dd,J＝7.2and 3.8Hz,1H),6.89(d,J＝7.7Hz,1H)6.86(s,1H),6.80(dd,J＝ 8.3and 1.9Hz,1H),5.40(s,2H),3.72(s,3H).¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃: AcOH-d₄＝18:1)δ161.4,160.4,152.6,150.0,149.5,142.7,137.8,136.7,130.4, 120.4,117.6,114.00,113.97,110.1,55.0,47.2.HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺Calcd for C₁₆H₁₄N₅O₂ 308.1147,Found 308.1140；IR(KBr)v(cm^-1):1720,1573,1538,1519, 1488,1366,778.

实施例5

化合物3e的制备:

操作如下：将1e(25.6mg,0.1mmol),Ac₂O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和 1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以体积比DCM:THF＝3:1作为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3e(22.0mg,76％yield).Yellowsolid, mp:212–214℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.48–9.44(m,1H),8.97(dd,J＝ 3.7and2.4Hz,1H),7.88(s,1H),7.24(d,J＝8.0Hz,2H),7.14(d,J＝8.0Hz,2H), 7.09(dd,J＝7.2and 3.8Hz,1H),5.41(s,2H),2.31(s,3H).¹³C{1H}NMR(125MHz, CDCl₃)δ161.0,153.0,150.3,149.6,142.1,138.8,137.7,132.4,130.0,128.4,118.5, 109.7,47.0,20.7.HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺Calcd for C₁₆H₁₄N₅O 292.1198,Found 292.119；IR(KBr)v(cm^-1):3446,1716,1633,1541,534,516,437,421,409.

实施例6

化合物3f的制备:

操作如下：将1f(27.5mg,0.1mmol),Ac₂O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和 1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以体积比DCM:THF＝2:1作为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3f(25.8mg,83％yield).Yellowsolid,mp:242–244℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ9.48(dd,J＝7.2and 2.3Hz, 1H),8.98(dd,J＝3.8and 2.3Hz,1H),7.91(s,1H),7.34–7.27(m,4H),7.11(dd,J＝ 7.2and 3.8Hz,1H),5.44(s,2H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ161.2,153.0,150.3, 149.7,141.9,137.8,135.0,134.0,129.7,129.6,118.6,109.8,46.5.HRMS(ESI)m/z: [M+H]⁺Calcd for C₁₅H₁₁ClN₅O312.0652,Found 312.0646；IR(KBr)v(cm^-1):1728, 1631,1537,1486,1376,1364,776.

实施例7

化合物3g的制备:

操作如下：将1g(32.0mg,0.1mmol),Ac₂O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和 1,1,3,3-四甲氧基丙烷2a(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以体积比DCM:THF＝2:1作为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物3g(32.4mg,90％yield).Yellowsolid,mp:225–227℃.¹H NMR(500MHz,CDCl₃:AcOH-d₄＝8:1)δ9.40(dd,J＝ 7.2and 2.3Hz,1H),8.97(dd,J＝3.9and 2.3Hz,1H),8.18(s,1H),7.39(d,J＝8.4 Hz,2H),7.22(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(dd,J＝7.2and 3.9Hz,1H),5.37(s,2H). ¹³C{1H}NMR(125MHz,CDCl₃:AcOH-d₄＝8:1)δ161.6,152.5,149.9,149.4,142.9, 137.9,134.3,132.3 130.1,122.8,117.3,110.2,46.6.HRMS(ESI)m/z:[M+H]⁺Calcd for C₁₅H₁₁BrN₅O 356.0147,Found356.0142；IR(KBr)v(cm^-1):1727,1574,1532, 1485,1369,776.

实施例1-7制备的化合物对疱疹病毒(HSV-1)的作用实验

1.材料

样品：实施例1-7制备的化合物3a,3b,3c,3d,3e,3f,3g.

仪器:电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；多功能搅拌机，常州国华仪器厂；4℃离心机，Thermo公司；光学显微镜，荧光显微镜，OLYMPUS 公司；TS-8S摇床，Qilinbeier公司；低速离心机，中科创新股份有限公司；0.22 uM滤膜，Milipore公司；-80℃冰箱，Thermo公司；CO₂恒温培养箱，Thermo 公司；96孔细胞培养板，Thermo公司；流式细胞分选仪，BD公司；旋涡震荡仪，海门市其林贝尔仪器有限公司；超净工作台，苏州净化设备公司；高压灭菌锅，SANYO；电子恒温水浴锅，上海森信仪器公司；制冰机，德国SCOTSMRA 公司。

试剂：DMSO，Sigma公司；L-谷氨酰胺，胎牛血清，GIBCO公司； 0.01mol/LpH7.4 PBS缓冲液干粉，索莱宝；DMEM培养基，Thermo公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，美国SIGMA公司；阿昔洛韦，湖北科益制药有限公司。

实验细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)来自ATCC；HSV-1病毒由武汉大学医学病毒学研究所提供。

2.实验方法

(1)谷氨酰胺溶液：称取谷氨酰胺粉末2.922g，溶于100mL灭菌水中，配成200mmol/L的溶液，待粉末溶解完全，过0.22um微孔滤膜除菌，分装至1mLEP 管，-20℃保存。

(2)细胞维持液：含2％胎牛血清、1％双抗溶液(青霉素、链霉素)和1％谷氨酰胺溶液的DMEM培养液，密封4℃保存。

(3)MTT溶液用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液溶解，配成5mg/mL溶液，0.22 um滤膜过滤除菌，分装，避光4℃保存。

(4)DMEM完全培养基：含10％胎牛血清、1％双抗溶液(青霉素、链霉素) 和1％谷氨酰胺溶液的DMEM培养液，4℃保存备用。

(5)化合物3a,3b,3c,3d,3e,3f,3g的溶解

用电子天平称取一定质量的化合物固体粉末，用DMSO溶解为所需浓度。

(6)细胞培养

Vero细胞用DMEM完全培养基连续传代3次，保持对数生长期供实验用。

(7)病毒培养

(a)Vero细胞长至单层，弃培养液。取出-80℃保存的HSV-1病毒，迅速融解，将200uL的病毒悬液加入培养瓶(25mL)，于37℃，5％CO₂培养箱中吸附 2h，期间每隔15min缓慢摇晃几次，使吸附均匀。

(b)2h后，加入细胞维持液9mL，继续培养。当观察到培养瓶中的细胞变圆并且开始有大量脱落时，将培养瓶立即转移到-80℃冰箱中，在存冻期间将培养瓶拿出来，反复冻融三次，使细胞裂解充分并将病毒释放出来，并按照每管 1.5mL的比例将病毒分装到事先放好的2mL病毒冻存管中，-80℃保存备用。

(8)病毒滴度测定

(a)将生长良好的Vero细胞以每孔100μL，细胞密度为1.5×10⁵cells/mL 铺在96孔板中；

(b)待细胞长成致密单层后，小心的取出病毒原液，将病毒原液放在冰上进行溶解；

(c)在生物安全柜中拿出10个已经灭过菌的血清瓶，依次排好并做好标记，先依次在10个血清瓶中分别加入900μL的细胞维持液，再吸取100μL已经完全溶解好的病毒原液加入到其中一个血清瓶中，将这个浓度标记为10^-1，接着从 10^-1浓度的血清瓶中吸出100μL的病毒混合液加入到另外一个血清瓶中，将这个浓度标记为10^-2，按照同样的方法，以此类推，分别稀释出10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、 10^-7、10^-8、10^-9、10^-10的浓度梯度；

(d)小心的取出96孔板，弃去板中原有的细胞生长液，然后用枪头将残余的细胞培养基吸净，向96孔板中缓慢地加入事先稀释好的病毒浓度梯度，每个浓度梯度做8个复孔，每个孔加100μL，同时取8个复孔设置成没有感染病毒组，即为细胞对照组，每个复孔加入100μL的细胞维持液，然后放到培养箱中继续培养；

(e)每隔2h仔细观察细胞的病变情况，同时做好详细的实验记录，记录下每个浓度梯度的致细胞病变效应(CPE)值，单个孔的细胞病变情况评价方法用“+”表示(“++++”：75％～100％细胞病变；“+++”：50％～75％细胞病变；“++”：25％～50％细胞病变：“+”：0～25％细胞病变)；

(f)直到观察发现细胞的病变情况不再发生变化后方可停止观察记录，将每个浓度梯度中的细胞的病变孔数统计下来，利用Reed Muench公式计算HSV-1的半数组织感染量(TCID₅₀)。

公式为：

TCID₅₀＝细胞病变大于50％的稀释度的对数值+距离比。

结果表明：病毒的TCID₅₀为10^-4，即接种滴度为10^-4的病毒每孔100μL，可使50％的细胞发生病变。因此确定实验用病毒滴度为100TCID₅₀，即10^-2。

(9)实施例1-7制备的化合物3a,3b,3c,3d,3e,3f,3g对Vero细胞毒性实验

将对数生长期的Vero细胞以1.5×10⁴/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁至单层时，弃掉旧培养基，PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入不同浓度的药物(药物用细胞维持液稀释)，每个浓度100μL，设三个复孔，同时设立阳性药对照组 (阿昔洛韦，ACV)、正常细胞对照组和空白组。37℃条件下5％CO₂培养箱培养3天后，培养孔中各加入浓度为5mg/mL的MTT溶液50uL，37℃条件下5％ CO₂培养箱培养4h后加入50uLDMSO，摇床震荡10分钟，待化合物完全溶解后，用酶标仪在570nm波长测定OD值。细胞存活率＝(实验组OD值-空白组 OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)*100％。

(10)实施例1-7制备的化合物3a,3b,3c,3d,3e,3f,3g在体外抗HSV-1病毒的药效学实验

将对数生长期的Vero细胞以1.5×10^-4/孔接种于96孔板中培养24h，待细胞贴壁至单层后，弃掉培养液，用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液洗涤细胞3次，每孔加入100TCID₅₀/100μL的病毒悬液，置37℃条件下5％CO₂培养箱吸附2h，弃掉病毒液，分别将不同浓度的药物加入96孔板中，200uL/孔，每个浓度设5 个复孔。同时设置阳性药对照组(阿昔洛韦，ACV)、病毒对照组和正常细胞对照组，置37℃条件下5％CO₂培养箱培养72h，观察细胞病变(CPE)。当病毒对照组达到75％-100％病变时，记录细胞病变情况，并用MTT法测定波长在 570nm时各组细胞的OD值。病毒抑制率＝(实验组OD值-病毒组OD值)/(对照组OD值-病毒组OD值)*100％。

(11)实施例1-7制备的化合物对Vero细胞毒性测试结果

光学显微镜下观察正常细胞对照组基本没有发生病变，生长良好，如图1 (左)；实施例1-7制备的化合物对Vero细胞的毒性作用表现为细胞皱缩、变圆、变长，颗粒增加，细胞界限模糊，其中化合物3c对Vero细胞的毒性作用图如图1(右)；用MTT法测得各组分OD值及各组存活率见表1-1、1-2，并测得在浓度为31.25ug/mL时，所对应的细胞存活率均大于80％。

表1-1阳性对照药和化合物3a、3b、3c对细胞存活率的影响

表1-2化合物3d、3e、3f、3g对细胞存活率的影响

(12)实施例1-7制备的化合物在体外抗HSV-1的药效学实验结果

把待观察的细胞做完细胞爬片和DAPI染色后，在荧光显微镜下观察到正常细胞对照组基本没有发生病变，生长良好，如图2(左)，实验所设病毒对照组细胞75％以上明显变圆，细胞间融合、脱落、碎裂，如图2(中)，给药组均有不同程度的细胞病变，但仍有部分细胞保持正常形态，其中化合物3c给药组细胞形态如图2(右)。

本申请检测了7个化合物的抗病毒活性，如表2-1、2-2所示。随着化合物浓度的增大，病毒所致细胞病变不同程度减少，在25ug/mL时均能有一定程度的抑制HSV-1所致细胞病变，化合物3c、3f、3g在浓度为25ug/mL和50ug/mL 时，对HSV-1抑制率达到50％以上，且化合物3c在浓度为50ug/mL时，对HSV-1 的抑制率达78.9％，与阳性药阿昔洛韦接近。

表2-1阳性对照药和化合物3a、3b、3c对HSV-1的抑制率

表2-2化合物3d、3e、3f、3g对HSV-1的抑制率

表3显示了实施例1-7制备的化合物在浓度为3.125μg/mL-6.25μg/mL之间，大部分细胞均发生病变，最后发生病变性死亡，而化合物3a,3b,3d,3e在较高浓度下的细胞毒性过大，细胞大量发生非病变性变圆缩小、死亡脱落等现象，在浓度为12.5μg/mL-50μg/mL时，对HSV-1的抑制效果较弱。化合物3c、3f、3g在 50μg/mL浓度下能抑制>75％的HSV-1感染，其中化合物3c在50μg/mL和25 μg/mL时均能抑制>75％的HSV-1感染，因此化合物3c对HSV-1的抑制效果最好。

表3阳性对照药和实施例1-7制得的化合物对HSV-1的抑制效果

注：CPE等级“+”：1％～25％细胞发生病变；“++”：25％～50％细胞发生病变；“+++”：50％～75％细胞发生病变；“++++”：75％～100％细胞发生病变；“-”表示药物毒性过大导致细胞大量非正常死亡。

3.实验结论

用7个新合成的化合物采用CPE法，观察细胞病变效应和抗HSV-1病毒活性研究。用MTT法计算细胞存活率，在浓度为31.25ug/mL时，各化合物处理的细胞存活率均大于80％。各化合物在25ug/mL时均能有一定程度的抑制HSV-1 所致细胞病变，表现出具有一定的生物活性；化合物3c、3f、3g在浓度为25ug/mL 和50ug/mL时，对HSV-1抑制率达到50％以上。化合物3c作用于Vero细胞毒性最小，且HSV-1病毒抑制效果最好，与阳性药阿昔洛韦接近。

Claims

1.一类脂肪链取代的三环核苷衍生物，其特征在于，其结构式如式(Ι)所示：

其中取代基R为C2-C6的烷基、苄基、甲氧基苄基、甲基苄基、氯代苄基或溴代苄基。

2.根据权利要求1所述的脂肪链取代的三环核苷衍生物，其特征在于，所述取代基R为C2-C4的烷基、苄基、邻甲氧基苄基、对甲基苄基、对氯苄基或对溴苄基。

3.根据权利要求1所述的脂肪链取代的三环核苷衍生物，其特征在于，所述取代基R为乙基、正丁基、苄基、邻甲氧基苄基、对甲基苄基、对氯苄基或对溴苄基，具体的，式(Ι)化合物的结构式为如下之一：

4.根据权利要求1所述的脂肪链取代的三环核苷衍生物，其特征在于，所述取代基R为苄基、对氯苄基或对溴苄基，具体的，式(Ι)化合物为：

5.如权利要求1-4任一所述的脂肪链取代的三环核苷衍生物的合成方法，其特征在于，所述合成方法的反应路线如下：

所述合成方法具体包括以下步骤：

以化合物1和TMOP为原料，加入添加剂以及溶剂，发生环合反应得到；

所述TMOP为1,1,3,3-四甲氧基丙烷，所述添加剂为乙酸酐，所述溶剂是乙酸，所述反应温度为110℃，所述反应时间为2小时。

6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述化合物1：TMOP：添加剂：溶剂的用量关系为1mmol：(0-1.2)mmol：10mmol：4mL。

7.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述化合物1：TMOP：添加剂：溶剂的用量关系为1mmol：1.2mmol：10mmol：4mL。

8.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，还包括对反应完后的反应液进行后处理的步骤：浓缩反应液，通过柱层析分离纯化。

9.权利要求1-4任一所述的脂肪链取代的三环核苷衍生物或权利要求5-7任一所述方法合成的脂肪链取代的三环核苷衍生物在制备抗HSV-1病毒药物中的应用。