CN111423441B - 一类具有抗肿瘤活性的卤代吲哚苦参碱衍生物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类具有抗肿瘤活性的卤代吲哚苦参碱衍生物及制备方法和应用。本发明提供了具有抗肿瘤活性的卤代吲哚苦参碱衍生物，其为式(I)所示的化合物，其中R为氟或碘，所述R的取代位点为吲哚环上4、5、6或7位取代中的一种或几种。本发明通过将槐果碱与卤代吲哚在水相和弱碱催化体系中进行化学反应与转换，得到一类具有抗肿瘤活性高、制法简便、成本低廉的卤代吲哚苦参碱衍生物。该卤代吲哚苦参碱衍生物与无取代的吲哚苦参碱衍生物、苦参碱相比，具有更高的抗肿瘤活性，在抗肿瘤领域具有良好的应用前景；

Description

一类具有抗肿瘤活性的卤代吲哚苦参碱衍生物及制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一类具有抗肿瘤活性的卤代吲哚苦参碱衍生物及制备方法和应用。

背景技术

新型抗肿瘤药物创制是现代药物化学的最基本，也是重点发展的方向之一。植物来源的抗肿瘤药物在化学结构和作用机制方面均具有多样性。因此，基于对天然产物结构的修饰和改造，结合抗肿瘤活性及机理研究对推动新药研发具有重要的意义。我国抗肿瘤、抗菌类的药物市场潜力巨大，市场前景十分广阔。但同时因为目前药物疗效的局限性，新的抗肿瘤药物市场有待大力开发，抗肿瘤及抗菌药物开发已是药物开发的一大热门。而从植物中寻找开发有效抗肿瘤新药的前景是广阔的。

苦参碱类化合物是中国传统中草药苦参的重要活性成分，具有广泛的生物学活性，如抗肿瘤活性、抗菌活性、抗炎、抗病毒等作用，是目前开发新型抗肿瘤药物的重要先导化合物。但苦参碱类化合物药物主要以植物提取的天然化合物成分为主，其产量低且针对性弱。以苦参碱为先导化合物的新衍生药物研究和创制虽然得到重视，但也因未能优选到明显高效的新衍生物，苦参碱类新药开发进展缓慢。

肿瘤和微生物引发的各种疾病已成为人类生存和发展所面临的重要问题，以苦参碱等有活性天然化合物为先导化合物，通过结构修饰合成，创制抗肿瘤和抗菌新药成为解决这一问题的重要突破口。鉴于此，将苦参碱类化合物通过化学转化与取代吲哚基进行拼合，分析总结构效关系，发现抗肿瘤活性更强，毒性更低的化合物，对治疗肿瘤疾病具有重要意义。中国专利文献CN 201710412481.0公开了一种杂环苦参碱衍生物及其制备方法和应用，其中含有吲哚基苦参碱，但其抗肿瘤活性较低。

发明内容

本发明的首要目的是克服上述现有技术的缺陷和不足，以苦参碱为先导化合物经结构修饰，获得新的一类具有抗肿瘤活性高、制法简便、成本低廉的新型卤代吲哚苦参碱衍生物及制备方法和应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一类卤代吲哚苦参碱衍生物，其为式(I)所示的化合物，或式(I)所示的化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、药学上可接受的盐及前药、水合物、溶剂化物或代谢产物，

其中，R为氟或碘，所述R的取代位点为吲哚环上4、5、6或7位取代中的一种或几种。

优选地，所述R为吲哚环上4和/或5位取代的氟或碘。

本发明还提供了所述卤代吲哚苦参碱衍生物的制备方法，所述卤代吲哚苦参碱衍生物是由所述卤代吲哚、槐果碱、催化剂和溶剂，于60～140℃油浴条件下反应2.5～10h形成式(I)所示的化合物。

优选地，所述催化剂为弱碱盐；所述催化剂选自碳酸铯、氟化铯或磷酸三钾等中的一种或几种弱碱盐。对催化剂的选择方面，通过TLC检测发现，当合成产物5-氟吲哚苦参碱、5-碘吲哚苦参碱时，使用碳酸铯为催化剂，反应速度快且基本没有副产物生成。

优选地，所述溶剂选自无水乙醇、乙腈、二甲基亚砜、四甲氧基硅烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、1,4-二氧六环或无水甲醇中的一种或几种；优选为1,4-二氧六环、无水甲醇或二甲基亚砜。反应过程中需添加溶剂，通过TLC检测实时监测合成过程中目标产物的生成情况，发现溶剂为1,4-二氧六环时，合成产物5-氟吲哚苦参碱、5-碘吲哚苦参碱的产物的生成量较多，且副产物生成量较少。在合成过程中需要及时添加溶剂以防造成反应物干涸。

优选地，当合成产物为4-氟吲哚苦参碱、5-氟吲哚苦参碱、4-碘吲哚苦参碱、5-碘吲哚苦参碱时，选择催化剂为氟化铯、碳酸铯、磷酸三钾等，溶剂为二甲基亚砜、1,4-二氧六环。

优选地，所述卤代吲哚苦参碱衍生物的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.将槐果碱、所述卤代吲哚、催化剂和溶剂混合后，在搅拌条件下恒温油浴于60～140℃加热反应2.5～10h，反应结束后，加入5～15mL二氯甲烷或乙醇，搅拌后过滤，滤液蒸去溶剂后得粗产品；

S2.采用硅胶柱层析法对粗产品进行分离纯化，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为6～14:1的混合物，进行薄层色谱检测，并收集含有目标产物的流分段，浓缩结晶，即得。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，当合成产物为5-氟吲哚苦参碱时，选择加热温度为80～115℃，反应时间为8～10h，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为4～10:1的混合物；

当合成产物为5-碘吲哚苦参碱时，选择加热温度为80～120℃，反应时间为6～10h，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为4～10:1的混合物；

当合成产物为4-氟吲哚苦参碱时，选择加热温度为80～140℃，反应时间为4～9h，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为8～14:1的混合物；

当合成产物为4-碘吲哚苦参碱时，选择加热温度为60～80℃，反应时间为2～4h，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为10～14:1的混合物。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，含有0.0005wt％～99wt％(优选0.005wt％～10wt％，最好在0.01wt％与1wt％之间)所述卤代吲哚苦参碱衍生物、或所述制备方法制得的产物，以及药学上可接受的载体。

上述的卤代吲哚苦参碱衍生物，或上述制备方法制得的产物，或上述的组合物在制备防治癌症的药物中的应用，也在本发明的保护范围之内。

本发明的化合物能用作预防和治疗广泛的癌症。优选地，所述癌症包括于宫颈癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌和非小细胞肺癌。

此外，本发明的这些卤代吲哚苦参碱衍生物可单独作为唯一活性抗肿瘤成分，也可与其他抗肿瘤的活性成分一起联合使用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明公开的卤代吲哚苦参碱衍生物是由卤代吡唑和槐果碱类化合物在水相和弱碱催化体系中反应制得的，该卤代吲哚苦参碱衍生物与无取代的吲哚苦参碱衍生物、苦参碱相比，具有更高的抗肿瘤活性，在抗肿瘤领域具有良好的应用前景。

(2)本发明提供的卤代吲哚苦参碱的制备方法简单便捷，条件温和，适合大规模生产。

附图说明

图1为4-氟吲哚苦参碱的红外谱图。

图2为4-氟吲哚苦参碱的质谱图。

图3为4-氟吲哚苦参碱的氢谱图。

图4为4-氟吲哚苦参碱的碳谱图。

图5为槐果碱的高效液相色谱图。

图6为4-氟吲哚苦参碱的高效液相色谱图。

图7为4-碘吲哚苦参碱的红外谱图。

图8为4-碘吲哚苦参碱的质谱图。

图9为4-碘吲哚苦参碱的氢谱图。

图10为4-碘吲哚苦参碱的碳谱图。

图11为4-碘吲哚苦参碱的高效液相色谱图。

图12为4-碘吲哚苦参碱的单晶衍射图。

图13为5-氟吲哚苦参碱的红外谱图。

图14为5-氟吲哚苦参碱的质谱图。

图15为5-氟吲哚苦参碱的氢谱图。

图16为5-氟吲哚苦参碱的碳谱图。

图17为5-氟吲哚苦参碱的高效液相色谱图。

图18为5-氟吲哚苦参碱的单晶衍射图。

图19为5-碘吲哚苦参碱的红外谱图。

图20为5-碘吲哚苦参碱的质谱图。

图21为5-碘吲哚苦参碱的氢谱图。

图22为5-碘吲哚苦参碱的碳谱图。

图23为5-碘吲哚苦参碱的高效液相色谱图。

图24为正常细胞的显微形态图(20×)，其中图A为细胞正常生长24h的形态图，B为细胞正常生长48h的形态图，C为细胞正常生长72h的形态图。

图25为4-F-Ind-Mat作用下细胞生长的显微形态图(20×)，其中图A为药物作用24h细胞生长的形态图，B为药物作用48h细胞生长的形态图，C为药物作用72h细胞生长的形态图。

图26为4-I-Ind-Mat作用下细胞生长的显微形态图(20×)，其中图A为药物作用24h细胞生长的形态图，B为药物作用48h细胞生长的形态图，C为药物作用72h细胞生长的形态图。

图27为5-F-Ind-Mat作用下细胞生长的显微形态图(20×)，其中图A为药物作用24h细胞生长的形态图，B为药物作用48h细胞生长的形态图，C为药物作用72h细胞生长的形态图。

图28为5-I-Ind-Mat作用下细胞生长的显微形态图(20×)，其中图A为药物作用24h细胞生长的形态图，B为药物作用48h细胞生长的形态图，C为药物作用72h细胞生长的形态图。

图29为将人宫颈癌细胞(Hela 229细胞)经苦参碱及其衍生物处理48h，通过DAPI和罗丹明123染色后，在荧光显微镜下观察细胞核与线粒体的形态变化图(20×)；其中图A为空白对照组，图B为3mmol/L Mat作用下细胞生长的形态图，图C为200μmol/L 4-F-Ind-Mat作用下细胞生长的形态图，图D为1.4mmol/L 4-I-Ind-Mat作用下细胞生长的形态图，图E为200μmol/L 5-F-Ind-Mat作用下细胞生长的形态图，图F为40μmol/L 5-I-Ind-Mat作用下细胞生长的形态图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

表1实验仪器与器材

表2主要试剂及耗材

实施例1制备4-氟吲哚苦参碱

1、合成步骤

提前洗净、烘干50mL三颈烧瓶、冷凝管、梨形瓶等实验器材，预热电子天平，使油浴锅升至140℃，打开冷凝回流器制冷，装好冷凝管并用铁夹固定，自下而上接上冷凝橡胶管待用；准备好需要称量的药物；准确称取0.8g槐果碱、0.4g 4-氟吲哚和0.6g碳酸铯，加入到三颈烧瓶中，加入搅拌子，用移液枪移取mL的1,4-二氧六环于三颈烧瓶，再用橡胶塞塞上两端烧瓶口；固定三颈烧瓶在油浴锅上方，接上冷凝管后通水，然后把烧瓶浸入油浴锅并开启搅拌，反应开始进行并计时。每隔0.5h进行TLC检测，期间发现有一种副产物；反应刚开始时反应物几乎不溶，加热一段时间后反应液变为乳白混合液，随着反应进行浑浊逐渐消失，溶液底部出现淡黄色油状液并随着时间增长而增多，反应时间为9h。

反应结束后，关闭油浴锅与冷凝，拆除装置，取出三颈烧瓶使其冷却至室温；过滤，收集滤液于5mL梨形瓶并于50℃下旋蒸浓缩至2mL。

2、色谱柱的制备

用500mL的烧杯量取150mL的硅胶粉(打实)，加入乙酸乙酯至250mL处，搅拌浸泡，泡一天后待用；将400mm*25mm i.d.的色谱柱用铁夹固定于铁架台上，开始装柱。用玻璃棒搅匀前天所泡硅胶粉，然后再搅拌溶液至均匀，开启色谱柱阀门，边搅拌边沿柱壁加入到柱中，让洗脱液自然滴下于洁净烧杯中，让硅胶粉自然下沉至铺填均匀，注意检查色谱柱中是否存在气泡以及断层，若有，重新装柱。色谱柱中溶液不可流干，若流干也需重新装柱，可用流下的溶液反复循环加入硅胶柱，约冲洗4～5次，此过程约为0.5h。

本实验在其他条件相同的情况下，分别以乙酸乙酯：甲醇＝10:1、乙酸乙酯：甲醇＝9:1、乙酸乙酯：甲醇＝20:1、乙酸乙酯：乙醇＝10:1、乙酸乙酯：乙醇＝14:1、乙酸乙酯：氯仿＝6:1、氯仿作为洗脱液，最终发现，乙酸乙酯：乙醇＝10:1为最佳选择，其分离和提纯效果最佳。

3、目标产物的分离与提纯

待色谱柱中的洗脱液流至与硅胶面相切后，用一次性滴管吸取浓缩样液沿柱壁缓慢加到色谱柱中，这时更换另一洁净烧杯开始接液并计数，再沿柱壁缓慢加入洗脱液至距硅胶面约5cm，接上加液球后大量加入洗脱液，整个过程色谱柱中溶液不能流干，硅胶面尽量保持平整，流速不宜过快。洗脱过程中可根据柱中样品的颜色位置来判断各物质的洗脱位置，若样品颜色较淡或无色，可用紫外灯照射观察其荧光以便确认；当物质洗脱位置到阀门上方，开始用10mL的离心管接取洗脱液，并且做好编号，全程TLC监测，待目标产物分离完毕后结束洗脱。

4、浓缩结晶

收集含有目标产物的流分段，旋蒸浓缩。加入溶剂无水乙醇，摇匀，而后直至油状物完全溶解。溶液转入样品瓶，瓶口用滤纸封住，纸上留5个小孔，于通风橱内静置挥发大部分溶剂后，得到4-氟吲哚苦参碱，收率35％。

5、结构表征

(1)红外IR

如图1所示，2929cm^-1为吲哚基团的C＝C伸缩振动；1634cm^-1为C＝O伸缩振动；1229cm^-1为芳香胺的C-N神作振动；1130为C-F伸缩振动；741cm^-1为一取代苯的特征峰，因此推断所合成物质为4-氟吲哚苦参碱。

(2)质谱MS

如图2所示，从结构是上看，4-氟吲哚苦参碱的理论相对分子质量为381.22，由质谱图图可知m/z＝382.8与4-氟吲哚苦参碱的[M+1]相吻合，因此推断合成产物为4-氟吲哚苦参碱。

(3)核磁NMR

核磁NMR分析结果如图3和图4所示。

¹H NMR(Chloroform-d,500MHz):δ(ppm)1.69,1.75,1.94,2.41,2.57,2.96,3.13,3.44,3.90,4.79,6.61,7.07,7.11,7.28.

¹³C NMR(Chloroform-d,126MHz):δ(ppm)21.24,26.77,27.83,30.93,35.06,35.92,39.34,47.22,50.94,52.05,57.28,63.93,98.68,104.89,105.38,117.78,122.56,123.93,138.43,157.71,166.50。

(4)高效液相色谱(HPLC)

如图6所示，样品4-氟吲哚苦参碱的保留时间为8.137，而槐果碱的保留时间6.776(见图5所示)，可能是新引进的基团改变了极性，样品的极性较槐果碱的小。

实施例2制备4-碘吲哚苦参碱

1、合成步骤

提前洗净、烘干50mL三颈烧瓶、冷凝管、梨形瓶等实验器材，预热电子天平，使油浴锅升至60℃，打开冷凝回流器制冷，装好冷凝管并用铁夹固定，自下而上接上冷凝橡胶管待用；准备好需要称量的药物；准确称取0.30g槐果碱、0.015g 4-碘吲哚和0.20g K₃PO₄，加入到三颈烧瓶中，加入搅拌子，用移液枪移取4mL的无水甲醇于三颈烧瓶，再用橡胶塞塞上两端烧瓶口；固定三颈烧瓶在油浴锅上方，接上冷凝管后通水，然后把烧瓶浸入油浴锅并开启搅拌，反应开始进行并计时。每隔0.5h进行TLC检测，期间发现有一种副产物；反应刚开始时反应物几乎不溶，加热一段时间后反应液变为乳白混合液，随着反应进行浑浊逐渐消失，溶液底部出现淡黄色油状液并随着时间增长而增多，反应时间为2.5h。

反应结束后，关闭油浴锅与冷凝，拆除装置，取出三颈烧瓶使其冷却至室温；过滤，收集滤液于5mL梨形瓶并于50℃下旋蒸浓缩至2mL。

2、色谱柱的制备

用500mL的烧杯量取150mL的硅胶粉(打实)，加入乙酸乙酯：乙醇为14：1的洗脱液至250mL处，搅拌浸泡，泡一天后待用；将400mm*25mm i.d.的色谱柱用铁夹固定于铁架台上，开始装柱。用玻璃棒搅匀前天所泡硅胶粉，然后再搅拌溶液至均匀，开启色谱柱阀门，边搅拌边沿柱壁加入到柱中，让洗脱液自然滴下于洁净烧杯中，让硅胶粉自然下沉至铺填均匀，注意检查色谱柱中是否存在气泡以及断层，若有，重新装柱。色谱柱中溶液不可流干，若流干也需重新装柱，可用流下的溶液反复循环加入硅胶柱，约冲洗4～5次，此过程约为0.5h。

本实验在其他条件相同的情况下，分别以乙酸乙酯：甲醇＝10:1、乙酸乙酯：甲醇＝9:1、乙酸乙酯：甲醇＝20:1、乙酸乙酯：乙醇＝10:1、乙酸乙酯：乙醇＝14:1、乙酸乙酯：氯仿＝6:1、氯仿作为洗脱液，最终发现，乙酸乙酯：乙醇＝14:1为最佳选择，其分离和提纯效果最佳。

3、目标产物的分离与提纯

待色谱柱中的洗脱液流至与硅胶面相切后，用一次性滴管吸取浓缩样液沿柱壁缓慢加到色谱柱中，这时更换另一洁净烧杯开始接液并计数，再沿柱壁缓慢加入洗脱液至距硅胶面约5cm，接上加液球后大量加入洗脱液，整个过程色谱柱中溶液不能流干，硅胶面尽量保持平整，流速不宜过快。洗脱过程中可根据柱中样品的颜色位置来判断各物质的洗脱位置，若样品颜色较淡或无色，可用紫外灯照射观察其荧光以便确认；当物质洗脱位置到阀门上方，开始用10mL的离心管接取洗脱液，并且做好编号，全程TLC监测，待目标产物分离完毕后结束洗脱。

4、浓缩结晶

收集含有目标产物的流分段，旋蒸浓缩。加入溶剂无水乙醇，摇匀，而后直至油状物完全溶解。溶液转入样品瓶，瓶口用滤纸封住，纸上留5个小孔，于通风橱内静置挥发大部分溶剂后，得到4-碘吲哚苦参碱，收率52.6％。

5、结构表征

(1)红外IR

如图7所示，由于发生Michael加成反应，共轭消失，又存在诱导效应，C＝O伸缩振动为1632cm^-1，对比槐果碱，发生了红移；同时C＝C-C＝O中C＝C伸缩振动消失；初步推断产物是4-碘吲哚苦参碱。

(2)质谱MS

如图8所示，从结构是上看，4-碘吲哚苦参碱的理论相对分子质量为489.43，由质谱图图可知m/z＝490.4与4-碘吲哚苦参碱的[M+1]相吻合，同时苦参碱的理论相对分子质量248.19，其基团与图中M/z＝247.5基本一直，因此推断合成产物为4-碘吲哚苦参碱。

(3)核磁NMR

核磁NMR分析结果如图9和图10所示。

¹H NMR(Chloroform-d,700MHz):δ(ppm)1.52,1.53,1.72,1.74,1.95,2.30,2.46,2.56,2.77,2.82,2.92,3.09,3.51,4.39,4.45,5.85,7.19,7.37,7.48,7.53,10.38.

¹³C NMR(Chloroform-d,176MHz):δ(ppm)20.66,26.17,27.22,31.18,35.27,41.05,43.81,54.16,55.42,56.64,63.29,87.68,108.66,111.03,121.89,123.03,128.66,134.06,137.14,165.44。

(5)高效液相色谱(HPLC)

如图11所示，样品4-碘吲哚苦参碱的保留时间为7.625，而槐果碱的保留时间6.776(图5)，可能是新引进的基团改变了极性，样品的极性较槐果碱的小。

(6)单晶衍射XRD分析

如图12所示，C₂₃H₂₈IN₃O(M＝489.40g/mol):orthorhombic,space group P212121(no.19),

Z＝N/A,T＝N/A K,μ(Cu Ka)＝12.463mm-1,Dcalc＝1.5919g/cm³,9467reflectionsmeasured(7.32°≤2θ≤148.2°),3980unique(Rint＝0.0364,Rsigma＝0.0293)which wereused in all calculations.The final R1 was 0.0363(I>＝2u(I))and wR₂ was 0.0916(all data)。

实施例3制备5-氟吲哚苦参碱

1、合成步骤

将油浴锅预热，温度设为115℃，称量0.25g槐果碱、0.13g的5-氟吲哚及0.05g碳酸铯，放入50mL三口烧瓶中，再加入3mL的1,4-二氧六环，调好搅拌子的速率，反应过程中每隔1h取一次样并进行TCL检测，发现反应物及产物的量没有明显变化时，停止反应，最终反应时间为10h。

后处理：稍冷却后，加入10mL乙醇溶解，过滤后进行旋蒸浓缩，得到粗产品。

2、分离提纯

用分配比为乙醇：乙酸乙酯＝1：6(体积比)的洗脱剂进行分离提纯，收集含有目标产物的馏分段，旋蒸浓缩。

3、产物结晶

将含有目标产物的离心管收集起来，旋蒸浓缩后用乙酸乙酯溶解，再转移到结晶瓶中，避光挥发大部分溶剂后，可得红棕色针状晶体，即为5-氟吲哚苦参碱，收率36％。

4、结构表征

5-氟吲哚苦参碱的红外IR如图13所示，质谱MS图谱如图14所示，核磁NMR图谱如图15和图16所示，液相色谱图如图17所示，单晶衍射图如图18所示。这些结果表明产物是5-氟吲哚苦参碱。

实施例4制备5-碘吲哚苦参碱

1、合成步骤

将油浴锅预热，温度设为110℃，称量0.25g槐果碱、0.24g的5-碘吲哚及0.05g碳酸铯，放入50mL三口烧瓶中，再加入3mL的1,4-二氧六环，调好搅拌子的速率，反应时间为9h。反应过程中体系的颜色逐渐加深，最终长时间保持红褐色粘稠状；反应过程中注意溶剂的添加以防反应物干涸，反应后期每隔1h取样进行TLC检验，发现反应已基本完成后停止反应。

温度的探索：合成初期在90℃的条件下反应，通过一小时后的TLC检测发现并未反应，因此加高温度到105℃，之后使用温度为110℃，每小时进行TLC检测监控产物的生成情况并进行对比，发现105℃下反应一小时未有产物生产，且反应9h后产量不高，而110℃时反应产物的量多且副产物少，故选用温度为110℃的反应条件。

后处理：稍冷却后，加入10mL二氯甲烷溶解，搅拌后过滤，滤液进行旋蒸浓缩蒸去溶剂，得到粗产品。

2、柱层析分离提纯

(1)装柱：量取150mL硅胶放入250mL烧杯中，加入适量洗脱剂(洗脱剂乙酸乙酯：乙醇的体积比为6：1)，充分搅拌使气泡逸出，静置0.5h后，打开层析柱阀门通过漏斗边搅拌边加入400mm*30mm i.d.层析柱。装柱完成后，反复用当前流动相冲洗硅胶柱；用灯照层析柱确认无气泡或断层，硅胶沉积面上方保持5cm以上液面，封口，静置过夜。

(2)上样与洗脱：粗产品溶于尽可能少的洗脱剂中。打开柱子下端活塞，使柱内液体流出，小心使液面降至贴近硅胶沉积面，然后关闭活塞，将样品沿柱内壁缓缓加入层析柱，打开活塞，样品渗入硅胶柱后再用少量洗脱剂冲洗柱内壁，小心使液面降至硅胶沉积面即加入大量洗脱剂开始洗脱(注意防止冲起沉积面)。准备100mL锥形瓶和10mL离心管，离心管编号，每根离心管收集10mL流出液，旋蒸除去大部分溶剂后留下约1mL保存于2mL样品管内用于TLC检测。

(3)TLC检测：取出GF-254硅胶板，用玻璃刀裁出所需大小，距底部20mm处画起点线，距顶部10mm处画前沿线，左右间隔均匀布置样品点。用0.3mm毛细管点样，样品点控制直径大小为1.5～2mm。将层析缸洗净，烘干，倒入约1cm的展开剂，放入点样完成的硅胶板展开；待溶剂前沿到达前沿线，取出硅胶板，置于通风橱内挥干溶剂，然后均匀喷洒显色液，待显色液挥发干后检查样品在硅胶板的分离情况。

3、产物结晶

收集含有目标产物的流分段，旋蒸浓缩。加入溶剂无水乙醇，摇匀，而后直至油状物完全溶解。溶液转入样品瓶，瓶口用滤纸封住，纸上留5个小孔，于通风橱内静置挥发(瓶内需留有一定量液体，不可挥干)。每隔8h查看一次，得到淡黄色的油状物质，即为5-碘吲哚苦参碱，收率59％。

4、结构表征

5-碘吲哚苦参碱的红外IR如图19所示，质谱MS图谱如图20所示，核磁NMR图谱如图21和图22所示，液相色谱图如图23所示。这些结果表明产物是5-碘吲哚苦参碱。

实施例5制备6-氟吲哚苦参碱

50mL三口烧瓶，加入槐果碱、碳酸铯、6-氟吲哚与1,4-二氧六环，组装冷凝装置及通入N₂，油浴锅110℃反应8h。反应结束后，关闭油浴锅与冷凝，自上而下拆除装置。用分配比为乙酸乙酯：乙醇为6：1(体积比)的洗脱剂进行硅胶柱层析分离提纯；收集含有目标产物的馏分段，旋蒸浓缩，加入溶剂无水乙醇，摇匀，而后直至油状物完全溶解，静置挥发大部分溶剂后，得到6-氟吲哚苦参碱。

实施例6制备7-氟吲哚苦参碱

50mL三口烧瓶，加入槐果碱、碳酸铯、7-氟吲哚与1,4-二氧六环，组装冷凝装置及通入N₂，油浴锅120℃反应9h。反应结束后，关闭油浴锅与冷凝。用分配比为乙酸乙酯：乙醇为6：1(体积比)的洗脱剂进行硅胶柱层析分离提纯；收集含有目标产物的馏分段，旋蒸浓缩，加入溶剂无水乙醇，摇匀，而后直至油状物完全溶解，静置挥发大部分溶剂后，得到7-氟吲哚苦参碱。

实施例7制备6-碘吲哚苦参碱

50mL三口烧瓶，加入槐果碱、碳酸铯、6-碘吲哚与1,4-二氧六环，组装冷凝装置及通入N₂，油浴锅110℃反应9h。反应结束后，关闭油浴锅与冷凝。用分配比为乙酸乙酯：乙醇为6：1(体积比)的洗脱剂进行硅胶柱层析分离提纯；收集含有目标产物的馏分段，旋蒸浓缩，加入溶剂无水乙醇，摇匀，而后直至油状物完全溶解，静置挥发大部分溶剂后，得到6-碘吲哚苦参碱。

实施例8制备7-碘吲哚苦参碱

50mL三口烧瓶，加入槐果碱、碳酸铯、7-碘吲哚与1,4-二氧六环，组装冷凝装置及通入N₂，油浴锅120℃反应8h。反应结束后，关闭油浴锅与冷凝。用分配比为乙酸乙酯：乙醇为6：1(体积比)的洗脱剂进行硅胶柱层析分离提纯；收集含有目标产物的馏分段，旋蒸浓缩，加入溶剂无水乙醇，摇匀，而后直至油状物完全溶解，静置挥发大部分溶剂后，得到7-碘吲哚苦参碱。

实施例9抗肿瘤生物活性分析

一、四个衍生物对宫颈癌细胞Hela 229细胞抑制活性实验

1、实验试剂与耗材

表3实验主要试剂

表4实验主要仪器设备

2、实验方法

试验化合物：修饰前的先导化合物苦参碱(Mat)、吲哚基苦参碱(Ind-Mat)；本发明四种新的苦参碱衍生物：4-氟吲哚苦参碱(4-F-Ind-Mat)、4-碘吲哚苦参碱(4-I-Ind-Mat)、5-氟吲哚苦参碱(5-F-Ind-Mat)和5-碘吲哚苦参碱(5-I-Ind-Mat)。

细胞培养：通过倒置显微镜观察细胞，当细胞融合度超过80％，或裸眼观察培养液由粉红色变成黄色时，弃去旧的培养液，加入PBS缓冲溶液漂洗细胞，弃液后加入0.25％胰蛋白酶(含EDTA)进行消化，肉眼可见细胞开始脱壁时，弃去胰蛋白酶，加入新鲜培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为1×10⁴～1×10⁵个/mL。完成后将细胞移出超净工作台放回37℃，5％CO₂培养箱中培养。每3天传代一次。

MTT检测细胞活力：选择状态良好的细胞，在灭菌后超净台中以常规传代操作得到均匀细胞悬液，并调整细胞密度至8×10⁴～1×10⁵个/mL，以每孔100μL接种到96孔板中，于37℃、5％CO₂培养箱培养24h。24h后根据实验，进行试验。如细胞生长曲线的测定，则设置12、24、36、48、60、72h六个时间点，每组每个点4个重复，并且实验分两组：调零组只加新鲜培养液不接种细胞，实验组换新鲜培养液正常培养；到时间点后，向对应的孔，加入以每孔10μL加入MTT溶液，于培养箱避光孵育4h。弃去孔板中的液体，每孔加入150μL的DMSO溶解结晶甲瓒。待结晶完全溶解后，测定λ＝429mm下对应孔的吸光度(OD值)，OD＝OD(实验组)-OD(调零组)。

倒置相差显微镜(IPCM)形态观察：选择形态良好的细胞，在灭菌后超净台中以常规传代操作得到均匀细胞悬液，并调整细胞密度至0.5×10⁵～1×10⁶个/mL，向6或12孔板中以每孔1mL加入稀释后的细胞悬液，封口膜封口，记录日期后于培养箱培养24h；24h后细胞进入增殖旺期，取出，小心弃去旧液，保留一个孔只加入新鲜培养液，一个孔加入含0.5％乙醇的新鲜培养液，其余根据实验加入所需的Mat、Ind-Mat、4-F-Ind-Mat等药物的系列浓度溶液，封口后于培养箱继续正常培养，记录每孔的药物和药物浓度；分别在0、24、48、72h用IPCM观察，拍下照片记录细胞形态并注明药物和浓度。

DAPI染色：取状态良好Hela 229细胞以0.5×10⁶～1×10⁶个/mL的密度铺板于12孔细胞培养板中，24h后待细胞进入增值旺期，开始按照实验计划的时间点加苦参碱或其衍生物到供试浓度，药物处理完毕后，吸去培养上清，加入4％多聚甲醛室温固定15min，PBS漂洗细胞2次。首先加入Rhodamine 123(0.5mg/mL)，置于37℃CO₂培养箱中避光孵育30min，弃液，PBS冲洗。加入终浓度1mg/L的DAPI染液室温染色15min；即为染色完成。PBS漂洗细胞1次，加入1mL新鲜培养基后，至于倒置荧光显微镜下拍照。其中荧光显微镜下紫外光激发DAPI后，细胞核呈蓝色，激发Rh 123后，线粒体成绿色。

2、结果分析

表5不同浓度的Mat对肿瘤细胞生长影响

注：*表示p＜0.05。

表6不同浓度的Ind-Mat对肿瘤细胞生长影响

注：*表示p＜0.05。

表7不同浓度的4-F-Ind-Mat对肿瘤细胞生长影响

注：*表示p＜0.05。

表8不同浓度的4-I-Ind-Mat对肿瘤细胞生长影响

注：*表示p＜0.05。

表9不同浓度的5-F-Ind-Mat对肿瘤细胞生长影响

注：*表示p＜0.05。

表10不同浓度的5-I-Ind-Mat对肿瘤细胞生长影响

注：*表示p＜0.05。

由表5可知，较低浓度(＜2mmol/L)处理细胞时，48h内抑制率逐渐增强，但最高只能达到约35％，并在72h后小幅下降；高浓度的Mat对Hela229细胞才显示较明显的抑制作用，并随作用浓度加大，抑制率变高，但是抑制率增幅不明显。3mmol/L的Mat作用细胞72h抑制率最高仅为49.09％。

由表6可知，利用MTT法检测不同浓度Ind-Mat(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mmol/L)对Hela229细胞增殖的影响。而且显微镜观察发现，Ind-Mat诱导Hela229细胞24和48h，5个浓度均对细胞增殖起到明显的促进作用；72h开始各浓度均能抑制细胞的增殖。在2.0mmol/L的浓度下作用72h，到达最高的抑制率为48.22％。在相同浓度组内，处理72h的细胞增殖抑制率比24h和48h明显增加，这表明Ind-Mat对Hela 229细胞增殖抑制存在一定时效性。

由表7可知，利用MTT法检测不同浓度4-F-Ind-Mat(100、120、140、160、180、200μmol/L)对Hela229细胞增殖的影响。在低浓度下(低于160μmol/L)，4-F-Ind-Mat诱导Hela229细胞24h，出现促进细胞生长的现象，但随浓度的增大而降低。4-F-Ind-Mat诱导Hela229细胞48h、72h，各浓度均对细胞增殖起到明显的抑制作用(除100μmol/L作用下)，且随药物的浓度和作用时间的增加而增大，表现出浓度和时间依赖性；当4-F-Ind-Mat的浓度大于160μmol/L的条件下诱导细胞72h，抑制率基本接近最高值约80％。

由表8可知，利用MTT法检测不同浓度4-I-Ind-Mat(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L)对Hela229细胞增殖的影响。在低于1.4mmol/L的浓度下，4-I-Ind-Mat诱导Hela229细胞24h，有促进细胞增殖的作用。其诱导Hela229细胞48和72h，各浓度均对细胞增殖有明显的抑制效果(0.8mmol/L作用48h外)，且随药物的浓度增大而增大，表现出一定的浓度依赖性；在相同浓度组内，处理24、48和72h的细胞在浓度间的增殖抑制率逐步增加，表明4-I-Ind-Mat对Hela229细胞增殖抑制存在一定时效性；4-I-Ind-Mat的浓度为1.4mmol/L的条件下诱导细胞72h，抑制率达到最大值为76.23％。

由表9可知，利用MTT法检测不同浓度5-F-Ind-Mat(140、160、180、200、220μmol/L)对Hela229细胞增殖的影响。作用24h，各浓度的5-F-Ind-Mat诱导Hela229细胞，均有明显的促增殖作用，且随浓度增加而增强。其诱导Hela229细胞48和72h，各浓度均对细胞增殖有明显的抑制效果，且随药物的浓度增大而增强，表现出一定的浓度依赖性；在相同浓度组内，处理48和72h的细胞在浓度间的增殖抑制率逐步增加，表明5-F-Ind-Mat对Hela229细胞增殖抑制存在一定时效性；5-F-Ind-Mat的浓度为200μmol/L的条件下诱导细胞72h，抑制率达到最大值为69.95％。

由表10可知，利用MTT法检测不同浓度5-I-Ind-Mat(5、20、40、60、80μmol/L)对Hela229细胞增殖的影响。5-I-Ind-Mat诱导Hela229细胞24h、48h、72h，除低浓度外，各浓度均对细胞增殖有明显的抑制效果，且随药物的浓度增大而增大，表现出一定的浓度依赖性；在相同浓度组内，处理24h、48h和72h的细胞在浓度间的增殖抑制率逐步增加，表明5-I-Ind-Mat对Hela229细胞增殖抑制存在一定时效性；5-I-Ind-Mat的浓度为40μmol/L的条件下诱导细胞72h，抑制率达到最大值为80.94％。

由图24可知，由图可知，细胞在接种第一天后数量倍增，进入对数生长阶段。在倒置显微镜下观察Hela 229细胞的生长情况。由图29可见，三个时间点的Hela 229细胞生长势态良好，细胞增殖旺盛，形态表现为不规则多边形，细胞边缘光滑，排列规律紧密，核形规则，贴壁完全。细胞生长24h、48h均可见到分裂细胞，生长无接触性抑制。细胞在铺满瓶底后继续生长，72h时有出现重叠生长的现象。

由图25可知，与空白对照组相比，经180μmol/L的4-F-Ind-Mat处理后24h，Hela229细胞生长受到抑制，贴壁细胞数量减少，细胞膜的透亮度降低且模糊，细胞间隙增大，细胞贴壁延伸部分回缩，多数细胞变圆。处理48h和72h，细胞逐渐皱缩、脱落，培养液中漂浮细胞增多，细胞呈凋亡或坏死状态，且随作用时间的增加，细胞凋亡或坏死的程度增加，表明4-F-Ind-Mat的作用具有时间依赖性。

由图26可知，与空白对照组相比，经1.4mmol/L的4-I-Ind-Mat处理24h，Hela 229细胞生长状态良好，出现细胞堆积生长现象。处理48h、72h，细胞生长增殖明显受到抑制，贴壁细胞数量减少，细胞之间不相连，胞体缩小、皱缩，呈长梭形或圆形。细胞膜的透亮度降低，细胞间隙增大。培养液中出现颗粒样物质，细胞呈凋亡或坏死状态，且随作用时间的增加，细胞凋亡或坏死的程度增加，表明4-I-Ind-Mat的作用具有时间依赖性。

由图27可知，与空白对照组相比，经200μmol/L的5-F-Ind-Mat处理24h，Hela 229细胞生长状态良好，出现细胞堆积生长现象。处理48h、72h，细胞生长增殖明显受到抑制，贴壁细胞数量锐减，细胞之间不相连，胞体缩小、皱缩。细胞膜的透亮度降低、无光泽。72h后大部分细胞呈圆形小体积，培养液中出现颗粒样物质，细胞呈凋亡或坏死状态，且随作用时间的增加，细胞凋亡或坏死的程度增加，表明5-F-Ind-Mat的作用具有时间依赖性。

由图28可知，与空白对照组相比，经40μmol/L的5-I-Ind-Mat处理24h，Hela 229细胞生长增殖受到抑制，细胞密度明显减少，细胞形态固缩变小，贴壁附着力降低，并可见细胞碎片。处理48h、72h，细胞生长增殖明显受到抑制，细胞间连接消失，胞体明显皱缩，细胞膜的透亮度降低，细胞核固缩或碎裂，细胞呈凋亡或坏死状态。细胞随药物作用时间的增加，凋亡或坏死的程度增加，表明5-I-Ind-Mat的作用具有时间依赖性。

由图29可知，将Hela 229细胞经苦参碱及其衍生物处理48h，通过DAPI和罗丹明123染色后，在荧光显微镜下观察细胞核与线粒体的形态变化。空白对照的细胞核发出蓝色荧光，核轮廓清晰、核形态呈圆形，大小统一；线粒体的绿色荧光亮度强、形态规则，数量多且能完整地包裹着细胞核。实验组细胞胞核边缘不规则，细胞核染色体浓集，着色较重，并伴有细胞核固缩，核小体碎片增加；线粒体荧光亮度大大降低，数量锐减甚至消失。与空白对照组相比，Mat处理下的细胞核和线粒体荧光亮度及数量有所降低。在4-F-Ind-Mat、4-I-Ind-Mat、5-F-Ind-Mat和5-I-Ind-Mat 4个新化合物作用下细胞核皱缩浓集，呈亮蓝色甚至白色的小点，核呈碎裂状或分叶状，数量锐减。由此可以进一步判断在新化合物的作用下，细胞发生凋亡从而抑制细胞增殖。

利用MTT检测法得出4-F-Ind-Mat、4-I-Ind-Mat、5-F-Ind-Mat和5-I-Ind-Mat的最高抑制率分别为：80.17±4.01％(200μmol/L)、76.23±3.81％(1.4mmol/L)、69.96±3.50％(200μmol/L)和80.94±4.05％(40μmol/L)。4个新化合物在相应低浓度下的抑制率远比Mat(3mmol/L)和Ind-Mat(2mmol/L)的抑制率(49.09±1.42)％和(48.22±2.41)％高。

从IPCM的图片(图25至图28)分析可得，在新化合物的作用下，细胞密度明显减少，细胞形态固缩变小，贴壁附着力降低，并可见细胞碎片。细胞膜的透亮度降低，细胞核固缩或碎裂，细胞呈凋亡或坏死状态。从荧光图片分析可知(图29)，在新化合物的作用下，细胞核和线粒体的形态和数量均发生明显变化。细胞核染色体浓集，着色较重，核固缩，核小体碎片增加；线粒体荧光亮度大大降低，数量锐减甚至消失。同时线粒体不排列呈梭形包裹着细胞核，细胞核裸露。

综上，本发明的新卤代吲哚苦参碱衍生物是通过促进细胞凋亡或坏死来抑制肿瘤细胞的生长增殖，且抑制肿瘤细胞效果比苦参碱(Mat)和吲哚苦参碱(Ind-Mat)效果都要明显。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明权利要求书所限定技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一类卤代吲哚苦参碱衍生物，其为式(I)所示的化合物，或式(I)所示的化合物药学上可接受的盐，

其中，所述R为吲哚环上4和/或5位取代的氟或碘。

2.权利要求1所述卤代吲哚苦参碱衍生物的制备方法，其特征在于，是由所述卤代吲哚、槐果碱、催化剂和溶剂，于60～140℃油浴条件下反应2.5～10h形成式(I)所示的化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为弱碱盐；所述弱碱盐选自碳酸铯、氟化铯或磷酸三钾中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为无水乙醇、乙腈、二甲基亚砜、四甲氧基硅烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、1,4-二氧六环或无水甲醇中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将槐果碱、所述卤代吲哚、催化剂和溶剂混合后，在搅拌条件下恒温油浴于60～140℃加热反应2.5～10h，反应结束后，加入5～15mL二氯甲烷或乙醇，搅拌后过滤，滤液蒸去溶剂后得粗产品；

S2.采用硅胶柱层析法对粗产品进行分离纯化，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为6～14:1的混合物，进行薄层色谱检测，并收集含有目标产物的流分段，浓缩结晶，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，当合成产物为5-氟吲哚苦参碱时，选择加热温度为80～115℃，反应时间为8～10h，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为4～10:1的混合物；

当合成产物为5-碘吲哚苦参碱时，选择加热温度为80～120℃，反应时间为6～10h，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为4～10:1的混合物；

当合成产物为4-氟吲哚苦参碱时，选择加热温度为80～140℃，反应时间为4～9h，洗脱剂为乙酸乙酯和乙醇按照体积比为8～14:1的混合物；

当合成产物为4-碘吲哚苦参碱时，选择加热温度为60～80℃，反应时间为2～4h，洗脱剂为乙酸乙酯和甲醇按照体积比为10～14:1的混合物。

7.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，含有0.0005wt％～99wt％的权利要求1所述的卤代吲哚苦参碱衍生物、或权利要求2～6任一所述制备方法制得的产物，以及药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的卤代吲哚苦参碱衍生物，或权利要求2～6任一所述制备方法制得的产物，或权利要求7所述的组合物在制备防治癌症的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症包括于宫颈癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌和非小细胞肺癌。

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