CN114507158B - 一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α‑氰基肉桂酸酯类化合物及其制备方法与应用，属于医药化学技术领域。首先将含不同取代基的苯甲醛类化合物制成相对应的α‑氰基肉桂酸，再将含不同取代基的α‑氰基肉桂酸与截短侧耳素溶于有机溶剂或离子液体中发生反应，合成了一类未见报道的截短侧耳素α‑氰基肉桂酸酯类化合物。该合成方法成熟，反应条件简单，反应产率较高，适用于工业化生产。体外抗菌实验表明本发明合成的截短侧耳素α‑氰基肉桂酸酯类化合物具有较强的抗菌活性；体外细胞毒性实验表明本发明合成的截短侧耳素α‑氰基肉桂酸酯类化合物具有较高的安全性，对由致病菌，尤其是耐药菌引起的感染性疾病具有较好的治疗作用及应用前景。

Description

一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，具体涉及一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
目前细菌耐药问题日趋严重，对人类健康造成极大威胁，成为全球关注的热点。耐药菌的出现增加了感染性疾病治愈的难度，随着耐药细菌的增多，耐药范围和耐药程度也不断增大。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有耐药趋向，革兰氏阳性菌的耐药问题更为严重。因此探索具有新型抗菌作用机制和良好生物利用度且广谱的抗菌药物具有重要意义。
截短侧耳素是一种带有刚性的5-6-8三环结构碳骨架的二萜类化合物，研究显示，它对革兰阳性菌和支原体具有良好的抑制作用。截短侧耳素的抗菌机制不同于市场上现有抗生素的抗菌机制，主要是通过与细菌核糖体肽酰转移中心(PTC)发生作用，干扰tRNA与P-位点和A-位点结合，从而抑制蛋白质的合成，由于PTC高度的保守性，使其耐药率较低。由于截短侧耳素及其衍生物特殊的抗菌机制和耐药缓慢的特点，使其成为目前抗生素研究的热点之一。但是目前通过α-氰基肉桂酸对截短侧耳素进行改造获得新的化合物来治疗感染性疾病还未见报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物及其制备方法与应用，治疗感染性疾病。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物，为式Ⅰ化合物或其在药学上可接受的盐，以及所述式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐的溶剂化合物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物：
Figure GDA0004132125800000011
其中：R1、R2、R3、R4和R5取代基可独立选自氢、卤素、硝基、甲氧基、三氟甲基、甲基、二甲基氨基或氰基。
优选地，代表性化合物结构式如下：
Figure GDA0004132125800000021
优选地，所述药学上可接受的盐为具有如式Ⅰ所示结构的化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、富马酸、马来酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、谷氨酸或天冬氨酸形成的盐。
本发明还公开了上述具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸类化合物的制备方法，合成路线I如下：
步骤1)以含有不同取代基的苯甲醛与氰基乙酸为原料，在反应溶剂和催化剂的共同作用下，加热回流，制备α-氰基肉桂酸类化合物；
其中，α-氰基肉桂酸类化合物为
Figure GDA0004132125800000022
步骤2)将步骤1)制得的α-氰基肉桂酸类化合物和酰氯化试剂反应，制备中间体1；
其中，中间体1为
Figure GDA0004132125800000023
步骤3)将步骤2)制得的中间体1与截短侧耳素反应，制得截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物。
本发明还公开了上述具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸类化合物的制备方法，合成路线II如下：
步骤1)以含有不同取代基的苯甲醛与氰基乙酸为原料，在反应溶剂和催化剂的共同作用下，加热回流，制备α-氰基肉桂酸类化合物；
其中，α-氰基肉桂酸类化合物为
Figure GDA0004132125800000031
步骤2)将步骤1)得到的α-氰基肉桂酸类化合物与截短侧耳素溶于离子液体中，制得截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物。
优选地，合成路线I中，步骤1)中，含有不同取代基的苯甲醛与氰基乙酸的摩尔比为1:2；步骤2)中，α-氰基肉桂酸类化合物和酰氯化试剂的摩尔比为1:1.5-1:5：1.4；步骤3)中，中间体1和截短侧耳素的摩尔比为1:1-1:1.4。
进一步优选地，步骤1)中，反应溶剂为甲苯，催化剂为醋酸胺，反应温度为100℃，加热回流时间为12小时；步骤2)中，酰氯化试剂为草酰氯、氯化亚砜或三氯化磷；反应温度为20℃-60℃；步骤3)中，反应时间为3-8小时。
优选地，合成路线II中，步骤2)中，α-氰基肉桂酸类化合物与截短侧耳素的摩尔比为1:1-1:1.4。
进一步优选地，步骤2)中，离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，反应的温度为30℃-60℃。
本发明还公开了上述具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物在制备抗耐药菌药物制剂中的应用。
优选地，所述抗耐药菌药物为治疗感染性疾病的药物。
优选地，所述感染性疾病为耐药菌引起的感染性疾病。
进一步优选地，所述耐药菌为多重耐药铜绿假单胞菌、多重耐药肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素粪肠球菌或耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌。
优选地，所述药物制剂含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物，利用α-氰基肉桂酸对截短侧耳素进行结构改造，获得了一类截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物，经初步生物活性测试和安全性评价表明该类截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物具有较好的抗耐药菌活性和安全性：体外抗耐药菌活性测定(包括标准菌株和临床耐药菌)证明本发明合成的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有不同程度的抑制作用，优选化合物3、4和10能对大部分受试菌株产生不弱于上市药物(瑞他莫林、泰妙菌素和沃尼妙林)的作用，特别是化合物3对表皮葡萄球菌ATCC 12228和大肠杆菌的抑制作用远高于三种上市药物；细胞毒性测定证明本发明合成的化合物在安全性方面也具有一定的优势，优选化合物3对测试的三种细胞(HepG2、HEK293和A549细胞)的毒性较小，可应用于治疗感染性疾病，特别是耐药菌引起的感染性疾病，具有很好的医药开发价值。
本发明提供的上述截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物的制备方法，将含不同取代基的α-氰基肉桂酸与截短侧耳素溶于有机溶剂中或离子液体中发生反应即可合成截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物，该制备方法成熟，操作方便、反应条件简单、成本低廉，产率为87.4％-93.5％，产率高，适用于工业化生产。
附图说明
图1是化合物3在氘代氯仿中的核磁氢谱图；
图2是化合物3在氘代氯仿中的核磁碳谱图；
图3是化合物3对金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的体外抗菌活性测定结果图；
图4是化合物3对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC 33591)的体外抗菌活性测定结果图；
图5是化合物3对鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)的体外抗菌活性测定结果图；
图6是化合物4对表皮葡萄球菌(ATCC 12228)的体外抗菌活性测定结果图；
图7是化合物4对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)的体外抗菌活性测定结果图；
图8是化合物10对金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的体外抗菌活性测定结果图；
图9是化合物10对大肠杆菌(ATCC 25922)的体外抗菌活性测定结果图；
图10是经不同浓度泰妙菌素处理的HepG2、HEK293和A549细胞存活率图；
图11是经不同浓度化合物3处理的HepG2、HEK293和A549细胞存活率图；
图12是经不同浓度化合物4处理的HepG2、HEK293和A549细胞存活率图；
图13是不同浓度化合物10处理的HepG2、HEK293和A549细胞存活率图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明提供的一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物，为式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐，以及所述式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐的溶剂化合物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物：
Figure GDA0004132125800000041
其中：R1、R2、R3、R4和R5取代基可独立选自氢、卤素、硝基、甲氧基、三氟甲基、甲基、二甲基氨基或氰基。
本发明提供的上述具有抗耐药菌的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物的制备方法，合成路线有两种：先以含有不同取代基的苯甲醛与氰基乙酸为原料，在甲苯和醋酸胺共同作用下，100℃回流12h，制备相应的α-氰基肉桂酸类化合物，合成路线Ⅰ为先将含有不同取代基的α-氰基肉桂酸类化合物与酰氯化试剂反应制备中间体1，然后中间体1与截短侧耳素在有机碱的存在下反应，即得目标化合物；合成路线Ⅱ为以含有不同取代基的α-氰基类化合物和截短侧耳素以及适量的催化剂硅钼酸溶于离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐中，通入氮气保护，反应即可得目标化合物。
本发明提供的所述化合物的合成路线Ⅰ如下所示：
步骤(1)：将含有不同取代基的苯甲醛溶于甲苯，加入氰基乙酸和催化剂醋酸铵，在100℃下加热回流12h，在TLC检测下反应完成后，将3M盐酸缓慢滴入混合物中至沉淀完全，然后将沉淀经过滤收集，冷水洗涤，真空干燥，制得α-氰基肉桂酸类化合物，反应式如下：
Figure GDA0004132125800000051
其中：R1、R2、R3、R4和R5取代基可独立选自氢、卤素、硝基、甲氧基、三氟甲基、甲基、二甲基氨基或氰基；含有不同取代基的苯甲醛与氰基乙酸的摩尔比为1:2；
步骤(2)：将步骤(1)制得的α-氰基肉桂酸类化合物置于反应器中，有机溶剂溶解，同时通入N2保护，后于反应体系中加入一定量的酰氯化试剂，在20℃-60℃温度下反应3小时，反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去有机溶剂和过量的酰氯化试剂得到中间体1备用，反应式如下；
Figure GDA0004132125800000052
其中，酰氯化试剂可选为草酰氯、氯化亚砜或三氯化磷，进一步优选为草酰氯；α-氰基肉桂酸类化合物和酰氯化试剂的摩尔比为1:1.5-1:5，进一步优选为1:3；反应温度优选为30℃；
步骤(3)：将一定量截短侧耳素溶于有机溶剂，置于反应器中，加入有机碱，同时通入氮气保护，后将一定量步骤(2)制得的的中间体1溶于有机溶剂中并逐滴滴加到反应器中，室温下反应3-8小时，薄层色谱法跟踪反应至完全，将反应混合体系减压浓缩除去有机溶剂，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化，干燥得到目标化合物；
Figure GDA0004132125800000053
其中，中间体1和截短侧耳素的摩尔比为1:1-1:1.4，进一步优选为1:1.2；反应时间优选为6小时；有机碱可选三乙胺、吡啶或DIEA，进一步优选为三乙胺。
本发明提供的所述化合物的合成路线Ⅱ如下所示：
步骤(1)：制备α-氰基肉桂酸类化合物与合成路线Ⅰ中的步骤(1)一致；
步骤(2)：将一定量α-氰基肉桂酸类化合物和一定量的截短侧耳素以及适量的催化剂硅钼酸溶于离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐中，置于反应器中，通入氮气保护，在30℃-60℃温度下反应6小时，薄层色谱法跟踪反应至完全，将反应混合体系通过萃取和减压浓缩除去有机溶剂和离子液体，通过重结晶纯化，干燥得到目标化合物。
Figure GDA0004132125800000061
其中，α-氰基肉桂酸类化合物和截短侧耳素的摩尔比为1:1-1:1.4，进一步优选为1:1.2；反应温度优选为40℃。
1、合成化合物1-12的具体实施例
本发明代表性化合物结构式如下图所示：
Figure GDA0004132125800000062
下面给出上述化合物合成的实施例，具体合成步骤如下：
实施例1
(1)α-氰基肉桂酸类化合物的制备
以4-硝基苯甲醛为反应物合成2-氰基-3-(4-硝基苯基)丙烯酸为例：
Figure GDA0004132125800000063
将304.2mg(2.0mmol)4-硝基苯甲醛溶于12mL甲苯中，加入396.4mL(4.0mmol)氰基乙酸，并加入催化剂醋酸胺，加热回流12小时，将3M盐酸缓慢滴入混合物中至沉淀完全，抽滤，滤饼经冷水洗涤，真空干燥，得到2-氰基-3-(4-硝基苯基)丙烯酸354.3mg，产率为81.2％。
其他α-氰基肉桂酸类化合物可根据上述方法制得，产率为65％-85％。
(2)化合物1的合成
化合物1：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-(4-硝基苯基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000071
109.1mg(0.5mmol)2-氰基-3-(4-硝基苯基)丙烯酸、227.1mg(0.6mmol)截短侧耳素与8.5mg(0.005mmol)硅钼酸依次置于25mL反应器中，加入5mL离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐充分溶解后，通入N2保护，40℃反应6小时。薄层色谱法跟踪反应至完全，撤去保护装置。反应混合体系静止分层，将酯层经重结晶、干燥即得到化合物1，质量为258.1mg，产率为89.2％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.30(d,J＝8.2Hz,2H),7.83(d,J＝16.0Hz,1H),7.63(d,J＝8.1Hz,2H),6.50(dd,J＝17.5Hz,11.2Hz,1H),5.85(d,J＝8.3Hz,1H),5.39(d,J＝10.8Hz,1H),5.23(d,J＝17.3Hz,1H),4.73(dd,J＝16.2Hz,2H),3.44(d,J＝6.2Hz,1H),2.38(t,J＝7.1Hz,1H),2.27(m,2H),2.19–2.07(m,2H),1.88–1.53(m,7H),1.47(s,3H),1.43(d,J＝15.6Hz,2H),1.23(s,3H),0.94(d,J＝6.8Hz,3H),0.82(d,J＝6.8Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.93,166.55,165.11,148.72,143.17,140.16,138.82,130.47,128.84,121.09,117.37,101.85,74.59,69.93,61.63,58.08,45.46,44.65,44.08,41.87,36.65,36.08,34.46,30.42,26.85,26.46,24.82,16.62,14.77,11.45.
实施例2
化合物2：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧基-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧乙基-3-(3-氯苯基)-2-氰基丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000072
103.8mg(0.5mmol)3-(3-氯苯基)-2-氰基丙烯酸置于反应器中，用10mL CH2Cl2溶解，同时通入N2保护，后于反应体系中加入氯化亚砜0.11mL(1.5mmol)，60℃反应3小时。反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去CH2Cl2和过量的氯化亚砜得到3-(3-氯苯基)-2-氰基丙烯酰氯备用。将截短侧耳素265.0mg(0.7mmol)置于反应器中，用4mL CH2Cl2溶解，加入三乙胺0.07mL(0.5mmol)，同时通入N2保护，后将3-(3-氯苯基)-2-氰基丙烯酰氯(0.5mmol)溶于2.5mL CH2Cl2中并逐滴滴加到反应器中，室温下反应6小时。反应结束，将反应混合体系减压浓缩除去CH2Cl2，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化(200-300目硅胶粉为固定相，流动相为石油醚:乙酸乙酯(V:V)＝1:1)，干燥得到化合物2，质量为263.0mg，产率为92.6％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.73(d,J＝16.2Hz,1H),7.55(s,1H),7.41(m,3H),6.56(s,1H),6.52–6.50(m,1H),5.42–5.25(m,2H),4.72(dd,J＝38.6Hz,16.1Hz,2H),3.41(d,J＝6.2Hz,1H),2.38(t,J＝7.4Hz,1H),2.31–2.20(m,2H),2.17–2.12(m,2H),1.83–1.52(m,7H),1.51(s,3H),1.44–1.41(m,2H),1.22(s,3H),0.92(d,J＝7.1Hz,3H),0.87(d,J＝7.1Hz,3H).
13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm):216.79,166.62,165.51,144.54,138.83,135.96,135.03,130.45,130.18,127.92,126.35,118.26,117.35,101.86,74.56,69.75,61.42,58.12,45.46,44.65,44.07,41.86,36.67,36.07,34.44,30.43,26.85,26.43,24.84,16.62,14.76,11.42.
实施例3
化合物3：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-苯丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000081
86.6mg(0.5mmol)2-氰基-3-苯基丙烯酸置于反应器中，用10mL CH2Cl2溶解，同时通入N2保护，加入DMF 0.1mL，后于反应体系中加入草酰氯0.10mL(1.1mmol)，20℃反应3小时。反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去CH2Cl2和过量的草酰氯得到2-氰基-3-苯基丙烯酰氯备用。将截短侧耳素246.1mg(0.65mmol)置于反应器中，用8mL CH2Cl2溶解，加入三乙胺0.07mL(0.5mmol)，同时通入N2保护，后将2-氰基-3-苯基丙烯酰氯(0.5mmol)溶于2.5mLCH2Cl2中并滴加加入到反应器中，室温下反应5小时。反应结束，将反应混合体系减压浓缩除去CH2Cl2，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化(200-300目硅胶粉为固定相，流动相为二氯甲烷:乙酸乙酯(V:V)＝5:1)，干燥得到化合物3，质量为241.7mg，产率为90.6％。化合物3在氘代氯仿中的核磁氢谱如图1所示，在氘代氯仿中的核磁碳谱如图2所示。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.35(s,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,2H),7.63(t,J＝7.3Hz,1H),7.56(t,J＝7.7Hz,2H),5.86(d,J＝8.4Hz,1H),5.40(d,J＝11.0Hz,1H),5.26(d,J＝17.4Hz,1H),4.76(dd,J＝40.8,16.4Hz,2H),3.40(d,J＝6.4Hz,1H),2.36(t,J＝6.8Hz,1H),2.29–2.20(m,2H),2.17–2.11(m,2H),1.83–1.52(m,6H),1.49–1.38(m,6H),1.22(s,3H),0.91(d,J＝6.9Hz,4H),0.84(d,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.84,165.73,162.01,156.27,138.69,133.77,131.31,129.39,117.51,115.07,101.84,74.58,70.21,62.62,58.06,45.45,44.63,44.05,41.90,36.66,36.05,34.44,30.40,26.84,26.41,24.83,16.65,14.76,11.46.
实施例4
化合物4：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000091
101.6mg(0.5mmol)2-氰基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酸、208.2mg(0.55mmol)截短侧耳素与17.1mg(0.01mmol)硅钼酸依次置于25mL反应器中，加入5mL离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐充分溶解后，通入N2保护，45℃反应6小时。薄层色谱法跟踪反应至完全，撤去保护装置。反应混合体系静止分层，将酯层经重结晶、干燥即得到化合物4，质量为258.7mg，产率为91.8％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(d,J＝15.6Hz,1H),7.53(d,J＝8.1Hz,2H),6.91(d,J＝8.2Hz,2H),6.43(d,J＝16.0Hz,1H),5.82(d,J＝8.2Hz,1H),5.37(d,J＝11.2Hz,1H),5.22(d,J＝17.5Hz,1H),4.72–4.60(m,2H),3.86(s,3H),3.42(d,J＝6.2Hz,1H),2.35(t,J＝7.3Hz,1H),2.27–2.18(m,2H),2.15–2.09(m,2H),1.83–1.52(m,6H),1.49–1.38(m,6H),1.21(s,3H),0.92(d,J＝6.9Hz,3H),0.85(d,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.96,166.95,166.37,161.66,145.93,138.81,129.98,126.95,117.38,114.43,114.18,101.85,74.62,69.61,61.25,58.15,55.43,45.45,44.62,44.06,41.92,36.72,36.02,34.46,30.42,26.84,26.38,24.83,16.65,14.84,11.46.
实施例5
化合物5：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000092
116.6mg(0.5mmol)2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酸置于反应器中，用10mLCH2Cl2溶解，同时通入N2保护，后于反应体系中加入三氯化磷0.13mL(1.5mmol)，35℃反应3小时。反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去CH2Cl2和过量的三氯化磷得到2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰氯备用。将截短侧耳素246.1mg(0.65mmol)置于反应器中，用8mL CH2Cl2溶解，加入三乙胺0.07mL(0.5mmol)，同时通入N2保护，后将2-氰基-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰氯(0.5mmol)溶于5mL CH2Cl2中并逐滴滴加到反应器中，室温下反应5.5小时。反应结束，将反应混合体系减压浓缩除去CH2Cl2，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化(200-300目硅胶粉为固定相，流动相为二氯甲烷:乙酸乙酯(V:V)＝3:1)，干燥得到化合物5，质量为440.3mg，产率为88.3％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.76(d,J＝16.2Hz,1H),7.15–7.08(m,2H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H),6.45(d,J＝15.9Hz,1H),5.86(d,J＝8.3Hz,1H),5.37(d,J＝10.8Hz,1H),5.26(t,J＝17.2Hz,1H),4.64(dd,J＝36.9,16.2Hz,2H),3.96–3.91(m,6H),3.44(s,1H),2.35(t,J＝6.7Hz,1H),2.26–2.18(m,2H),2.13–2.09(m,2H),1.86–1.54(m,7H),1.49(s,3H),1.45(m,2H),1.26(s,3H),0.93(d,J＝6.8Hz,3H),0.87(d,J＝6.9Hz,3H).
13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)216.94,166.93,166.16,151.49,149.35,146.11,138.87,127.23,122.87,117.27,114.43,111.16,109.87,101.85,74.62,69.68,61.29,58.12,55.95,55.94,45.46,44.63,44.08,41.86,36.75,36.06,34.43,30.43,26.83,26.43,24.83,16.62,14.82,11.41.
实施例6
化合物6：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-(3-氟苯基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000101
95.58mg(0.5mmol)2-氰基-3-(3-氟苯基)丙烯酸置于反应器中，用10mL CH2Cl2溶解，同时通入N2保护，加入DMF 0.1mL，后加入草酰氯0.12mL(1.3mmol)于反应体系中，20℃反应3小时。反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去CH2Cl2和过量的草酰氯得到2-氰基-3-(3-氟苯基)丙烯酰氯备用。将截短侧耳素277.1mg(0.6mmol)置于反应器中，用8mL CH2Cl2溶解，加入三乙胺0.07mL(0.5mmol)，同时通入N2保护，后将2-氰基-3-(3-氟苯基)丙烯酰氯(0.5mmol)溶于5mL CH2Cl2中并逐滴滴加到反应器中，室温下反应6.5小时。反应结束，将反应混合体系减压浓缩除去CH2Cl2，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化(200-300目硅胶粉为固定相，流动相为二氯甲烷:乙酸乙酯(V:V)＝5:1)，干燥得到化合物6，质量为253.5mg，产率为91.9％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝16.2Hz,1H),7.48–7.36(m,2H),7.29(d,J＝9.6Hz,1H),6.63–6.49(m,2H),5.87(d,J＝8.1Hz,1H),5.42(d,J＝11.3Hz,1H),5.29(d,J＝17.1Hz,1H),4.67(d,J＝16.2Hz,2H),3.43(d,J＝6.1Hz,1H),2.35(t,J＝7.1Hz,1H),2.35–2.19(m,2H),2.16–2.06(m,2H),1.86–1.53(m,6H),1.47(s,3H),1.44–1.31(m,2H),1.23(s,3H),1.17–1.09(m,1H),0.95(d,J＝6.9Hz,3H),0.82(d,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.97,166.76,165.68,144.85,138.76,136.42,130.56,130.53,124.26,118.23,117.62,114.56,114.34,101.86,74.57,69.76,61.47,58.13,45.44,44.65,44.09,41.93,36.74,36.02,34.43,30.46,26.87,26.43,24.85,16.63,14.83,11.49.
实施例7
化合物7：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧乙基-2-氰基-3-(4-氰基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000111
99.1mg(0.5mmol)2-氰基-3-(4-氰基苯基)丙烯酸、274.8mg(0.6mmol)截短侧耳素与8.6mg(0.005mmol)硅钼酸依次置于25mL反应器中，加入5mL离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐充分溶解后，通入N2保护，35℃反应6小时。薄层色谱法跟踪反应至完全，撤去保护装置。反应混合体系静止分层，将酯层经重结晶、干燥即得到化合物7，质量为238.0mg，产率为87.4％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝16.3Hz,1H),7.74(d,J＝8.1Hz,2H),7.65(d,J＝8.3Hz,2H),6.65(d,J＝16.1Hz,1H),6.54(dd,J＝17.3Hz,11.2Hz,1H),5.84(d,J＝8.3Hz,1H),5.23(d,J＝17.2Hz,1H),4.78(dd,J＝37.0Hz,16.2Hz,2H),3.45(d,J＝6.3Hz,1H),2.35(t,J＝6.6Hz,1H),2.33–2.14(m,2H),2.11–2.07(m,2H),1.84–1.51(m,7H),1.45(s,3H),1.42–1.36(m,2H),1.22(s,3H),0.91(d,J＝6.8Hz,3H),0.81(d,J＝7.2Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.72,166.51,165.13,163.54,143.65,138.42,132.74,128.56,120.47,117.33,113.72,74.63,69.91,67.40,61.53,58.11,57.74,56.71,46.76,45.42,44.63,44.01,41.91,36.62,36.05,34.40,30.41,26.81,26.45,24.81,16.61,14.74,11.41.
实施例8
化合物8：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000121
108.12mg(0.5mmol)2-氰基-3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酸置于反应器中，用10mLCH2Cl2溶解，同时通入N2保护，后于反应体系中加入三氯化磷0.18mL(2mmol)，35℃反应3小时。反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去CH2Cl2和过量的三氯化磷得到2-氰基-3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰氯备用。将截短侧耳素265.0mg(0.7mmol)置于反应器中，用8mLCH2Cl2溶解，加入三乙胺0.07mL(0.5mmol)，同时通入N2保护，后将2-氰基-3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰氯(0.5mmol)溶于5mL CH2Cl2中并逐滴滴加到反应器中，室温下反应6.5小时。反应结束，将反应混合体系减压浓缩除去CH2Cl2，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化(200-300目硅胶粉为固定相，流动相为石油醚:乙酸乙酯(V:V)＝1:1)，干燥得到化合物8，质量为254.6mg，产率为88.3％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝15.9Hz,1H),7.52(d,J＝8.1Hz,2H),6.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.51(dd,J＝17.2,11.3Hz,1H),6.36(d,J＝15.9Hz,1H),5.87(d,J＝8.4Hz,1H),5.33(d,J＝10.8Hz,1H),5.23(d,J＝17.6Hz,1H),4.64(dd,J＝16.1Hz,2H),3.42(s,1H),3.09(s,6H),2.39(t,J＝7.1Hz,1H),2.32–2.16(m,2H),2.15–2.02(m,2H),1.87–1.52(m,6H),1.46(s,3H),1.42(d,J＝15.6Hz,2H),1.25(s,3H),1.14(d,J＝18.2Hz,1H),0.92(d,J＝7.0Hz,3H),0.82(d,J＝6.9Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ217.02,167.25,166.86,156.21,146.71,138.82,130.05,117.36,111.97,111.03,101.87,74.62,70.16,69.46,62.58,61.14,58.16,45.48,44.59,44.07,41.86,40.23,36.77,36.02,34.45,30.43,26.87,26.38,24.85,16.69,14.83,11.46.
实施例9
化合物9：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-(间甲苯基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000122
100.6mg(0.5mmol)2-氰基-3-(间甲苯基)-2-烯酸置于反应器中，用10mL CH2Cl2溶解，同时通入N2保护，加入DMF 0.1mL，后于反应体系中加入草酰氯0.1mL(1.2mmol)，20℃反应3小时。反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去CH2Cl2和过量的草酰氯得到2-氰基-3-(间甲苯基)-2-烯酰氯备用。将截短侧耳素227.1mg(0.6mmol)置于反应器中，用8mL CH2Cl2溶解，加入三乙胺0.07mL(0.5mmol)，同时通入N2保护，后将2-氰基-3-(间甲苯基)-2-烯酰氯(0.5mmol)溶于5mL CH2Cl2中并逐滴滴加到反应器中，室温下反应7小时。反应结束，将反应混合体系减压浓缩除去CH2Cl2，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化(200-300目硅胶粉为固定相，流动相为石油醚:乙酸乙酯(V:V)＝1:1)，干燥得到化合物9，质量为256.0mg，产率93.5％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝15.6Hz,1H),8.23(m,3H),7.98(dd,J＝12.5Hz,8.2Hz,2H),7.86(d,J＝7.1Hz,1H),7.65–7.51(m,3H),6.51(dd,J＝17.3Hz,11.0Hz,3H),5.82(d,J＝8.3Hz,1H),5.41(d,J＝10.8Hz,3H),5.21(d,J＝17.3Hz,1H),4.81–4.65(m,2H),3.41(d,J＝6.5Hz,1H),2.31(t,J＝7.3Hz,1H),2.26–2.17(m,2H),2.14–2.11(m,7H),1.15(s,3H),0.96(d,J＝6.7Hz,4H),0.82(d,J＝7.2Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.04,165.91,143.25,138.81,131.44,130.83,128.74,126.31,119.31,117.44,101.81,74.60,73.68,69.72,69.49,68.13,67.14,65.49,63.23,61.45,58.11,45.44,44.03,41.87,36.72,36.01,34.45,30.42,26.85,24.81,16.71,14.85,11.49.
实施例10
化合物10：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000131
120.6mg(0.5mmol)2-氰基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙烯酸置于反应器中，用10mLCH2Cl2溶解，同时通入N2保护，加入DMF 0.1mL，后于反应体系中加入草酰氯0.11mL(1.3mmol)，20℃反应3小时。反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去CH2Cl2和过量的草酰氯得到2-氰基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙烯酰氯备用。将截短侧耳素246.2mg(0.7mmol)置于反应器中，用8mL CH2Cl2溶解，加入三乙胺0.07mL(0.5mmol)，同时通入N2保护，后将2-氰基-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙烯酰氯(0.5mmol)溶于5mL CH2Cl2中并逐滴滴加到反应器中，室温下反应5小时。反应结束，将反应混合体系减压浓缩除去CH2Cl2，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化(200-300目硅胶粉为固定相，流动相为二氯甲烷:乙酸乙酯(V:V)＝3:1)，干燥得到化合物10，质量为273.2mg，产率90.8％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(d,J＝16.2Hz,1H),7.62(d,J＝3.1Hz,4H),6.59–6.45(m,1H),5.87(d,J＝8.1Hz,1H),5.37(d,J＝11.0Hz,1H),5.26(d,J＝17.2Hz,1H),4.73(dd,J＝23.1Hz,2.4Hz,2H),3.43(s,1H),2.45–2.33(m,1H),2.32–2.18(m,2H),2.15(q,J＝8.2,7.3Hz,2H),1.88–1.51(m,7H),1.47(s,3H),1.48–1.34(m,2H),1.23(s,3H),0.92(d,J＝7.1Hz,3H),0.82(d,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.95,166.62,165.43,144.35,138.76,137.47,128.38,125.96,125.92,119.39,117.43,101.86,74.56,69.85,61.52,58.13,45.45,44.61,44.03,41.87,41.54,36.67,36.05,34.45,30.43,26.83,26.42,24.86,16.65,14.78,11.47.
实施例11
目标化合物11：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧基-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧乙基-3-(3-氯-4-氟苯基)-2-氰基丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000141
112.8mg(0.5mmol)3-(3-氯-4-氟苯基)-2-氰基丙烯酸、208.2mg(0.55mmol)截短侧耳素与17.1mg(0.01mmol)硅钼酸依次置于25mL反应器中，加入5mL离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐充分溶解后，通入N2保护，40℃反应6小时。薄层色谱法跟踪反应至完全，撤去保护装置。反应混合体系静止分层，将酯层经重结晶、干燥即得到化合物11，质量为259.6mg，产率为88.6％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝16.2Hz,1H),7.69(d,J＝6.8Hz,1H),7.43(t,J＝6.9Hz,1H),7.25(t,J＝8.6Hz,1H),6.52–6.43(m,1H),5.87(d,J＝8.3Hz,1H),5.42(d,J＝10.9Hz,1H),5.23(d,J＝17.2Hz,1H),4.68(d,J＝16.3Hz,2H),3.42(d,J＝6.2Hz,1H),2.41–2.33(m,1H),2.32–2.17(m,2H),2.12(d,J＝18.7Hz,2H),1.88–1.50(m,6H),1.49(s,3H),1.43(d,J＝15.9Hz,2H),1.24(s,3H),1.18(dd,J＝14.3Hz,4.2Hz,1H),0.92(d,J＝6.8Hz,3H),0.84(d,J＝6.9Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.92,166.65,165.57,143.59,138.75,131.57,130.28,128.16,128.13,117.93,117.41,117.38,117.15,101.87,74.56,69.79,61.48,58.07,45.45,44.62,44.06,41.84,36.67,36.08,34.47,30.43,26.85,26.37,24.83,16.62,14.81,11.45.
实施例12
目标化合物12：2-((3aR，4R，5R，7S，8S，9R，9aS，12R)-8-羟基-4,7,9,12-四甲基-3-氧代-7-乙烯基十氢-4,9a-丙环戊[8]环烯-5-基)氧基)-2-氧代乙基-2-氰基-3-(2,3,6-三氟苯基)丙烯酸酯的制备
Figure GDA0004132125800000151
113.6mg(0.5mmol)2-氰基-3-(2,3,6-三氟丙基)丙烯酸置于反应器中，用10mLCH2Cl2溶解，同时通入N2保护，后于反应体系中加入氯化亚砜0.15mL(2mmol)，60℃反应3小时。反应完全后，撤去保护装置，减压浓缩除去CH2Cl2和过量的二氯亚砜得到2-氰基-3-(2,3,6-三氟丙基)丙烯酰氯备用。将截短侧耳素246.8mg(0.7mmol)置于反应器中，用8mLCH2Cl2溶解，加入三乙胺0.07mL(0.5mmol)，同时通入N2保护，后将2-氰基-3-(2,3,6-三氟丙基)丙烯酰氯溶于5mL CH2Cl2中并滴加加入到反应器中，室温下反应6小时。反应结束，将反应混合体系减压浓缩除去CH2Cl2，所得浓缩液经水洗涤，乙酸乙酯萃取，柱层析分离纯化(200-300目硅胶粉为固定相，流动相为二氯甲烷:乙酸乙酯(V:V)＝3:1)，干燥得到化合物12，质量为272.1mg，产率92.6％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝16.0Hz,1H),7.57(t,J＝9.1Hz,1H),7.38–7.27(m,1H),6.45(d,J＝16.3Hz,1H),5.82(d,J＝8.4Hz,1H),5.45(d,J＝11.1Hz,1H),5.26(d,J＝17.2Hz,1H),4.73(dd,J＝40.2Hz,16.1Hz,2H),3.43(d,J＝6.3Hz,1H),2.37(t,J＝6.6Hz,1H),2.32–2.19(m,2H),2.18–2.06(m,2H),1.86–1.53(m,7H),1.53(s,3H),1.47–1.39(m,2H),1.26(s,3H),0.93(d,J＝6.9Hz,3H),0.82(d,J＝6.9Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ216.94,166.72,165.58,143.83,138.74,131.36,125.04,118.07,121.12,117.95,117.47,116.63,116.45,101.86,74.64,69.76,61.47,58.13,45.48,44.63,44.06,41.87,36.72,36.07,34.49,30.41,26.82,26.37,24.82,16.65,14.83,11.52.
2.化合物体外抗耐药菌活性测定
采用微量肉汤稀释法，以莫西沙星为阳性对照品(购于上海麦克林生化科技有限公司)，测试截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物的最低抑菌浓度(Minimum inhibitoryconcentration,MIC)，同时与已上市的截短侧耳素类抗生素瑞他莫林(购于南京康满林化工实业有限公司)、泰妙菌素(购于上海源叶生物科技有限公司)和沃尼妙林(购于上海吉至生化科技有限公司)进行比较，以筛选出活性更优的截短侧耳素类衍生物。
标准菌株包括革兰氏阳性菌：表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、(ATCC 25923)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC 33591)；革兰氏阴性菌：鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)和大肠杆菌(ATCC 25922)，所有菌株均购自于美国模式培养物集存库。
临床耐药菌包括多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)18-126、多重耐药肺炎克雷伯菌(MDR-KP)18-893、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)18-171、耐万古霉素粪肠球菌(VRE)18-80和耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(CR-AB)18-882，所有临床耐药菌株均来源于复旦大学附属华山医院。
具体操作步骤如下：
(1)MHB培养基配制：称取MHB培养基(购于广州环凯微生物科技有限公司)20.0g，加入到1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，121℃高压灭菌15min，备用；
(2)实验菌株培养至对数生长期：无菌条件下，将复苏后的实验菌株接种到100mLMHB培养基中，置于37℃恒温恒湿培养箱中培养20-22h，备用；
(3)样品液制备：称取待测样品(本发明合成的化合物1-12、瑞他莫林、泰妙菌素和沃尼妙林)用DMSO溶液溶解，配制成浓度为10.24mg/mL的样品液；称取阳性对照品(莫西沙星)，用DMSO溶液溶解，配制成浓度为5.12mg/mL的样品液；
(4)菌悬液制备：无菌条件下，将培养至对数生长期的实验菌株用MHB培养基校正到0.5麦氏单位浊度标准后按1:200的比例进行稀释，备用；
(5)微量二倍稀释法测定MIC：取无菌96孔板，在第2孔加入10μL沃尼妙林样品液，第4-11孔加入10μL DMSO溶液，第3、4孔加入10μL按梯度设置稀释过的样品液，并对药物进行二倍稀释至第10孔，第11孔为溶剂对照。然后每孔加入190μL稀释过的菌悬液，使每孔最终的菌液浓度为5×105CFU/mL，置37℃恒温恒湿箱中培育20-22h。
(6)MIC终点判读：黑色背景下肉眼观察96孔板中所见能完全抑制细菌生长的浓度为该样品对该种细菌的最低抑菌浓度，记录结果见表1及图3-9。
表1受试药物最低抑菌浓度(μg/mL)
Figure GDA0004132125800000161
Figure GDA0004132125800000171
由表1可知，本发明合成的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有不同程度的抑制作用。化合物2、3、4、7、8和10对表皮葡萄球菌ATCC12228的抑制作用均不弱于瑞他莫林和沃尼妙林，而且化合物3还优于泰妙菌素，最低抑菌浓度能达到8μg/mL；受试化合物1-12对金黄色葡萄球菌ATCC 25923和大肠杆菌ATCC 25922的抑制作用均不弱于泰妙菌素，其中皆以化合物3的效果最好，对金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC 25922的最低抑菌浓度分别能达到4μg/mL和8μg/mL；化合物1-12对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 33591的抑制作用均不弱于泰妙菌素和沃尼妙林，其中化合物3和10的最低抑菌浓度能达到32μg/mL，与瑞他莫林相当；化合物3对鲍曼不动杆菌ATCC19606的抑制作用较为明显，其最低抑菌浓度能达到4μg/mL，低于瑞他莫林和泰妙菌素。上述数据和图3-9显示，化合物3、4和10能对大部分受试菌株产生不弱于上市药物的作用。
表2受试药物对临床耐药菌的最小抑菌浓度(μg/mL)
Figure GDA0004132125800000172
由表2可知，优选化合物3、4和10对五种测试的临床分离耐药菌均具有一定的抑制作用且不弱于瑞他莫林，其中化合物3的抗菌活性最优(MIC：8-64μg/mL),值得作为先导化合物进行进一步的研究。
3.代表性化合物的细胞毒性测定
采用MTT法评估含截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物体外细胞毒性。
取处于对数生长期的HepG2、HEK293和A549细胞(购于美国ATCC库)，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为105个/mL，每孔100μL接种于无菌96孔细胞培养板，置于37℃，5％ CO2恒温培养箱中培养24h。待细胞贴满孔板底部后，分别在每孔中加入浓度梯度的药液(泰妙菌素、化合物3、化合物4和化合物10)10μL，平行设6个复孔，同时设置调零组(不含细胞和药物组)和对照组(不含药物组)。置于37℃，5％ CO2恒温培养箱内孵育24h后，每孔加入5g/L MTT溶液20μL继续培养4h。培养结束后，轻轻吸去孔内培养液，每孔加入DMSO150μL，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解后，于酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率，并在光学显微镜下观察细胞的形态变化。根据半数抑制浓度(IC50)来评价药物对HepG2、HEK293和A549细胞的细胞毒性，部分记录结果见表3及图10-13。
Figure GDA0004132125800000181
表3代表性受试药物的半数抑制浓度(IC50)(μM)
Figure GDA0004132125800000182
表3显示了代表化合物3、4和10和泰妙菌素对HepG2细胞、HEK293细胞和A549细胞的半数抑制浓度，由表中数据可以得知化合物3、4和10对HepG2细胞的IC50值是泰妙菌素的2倍以上；而且化合物3和10对HEK293细胞的IC50值也均大于泰妙菌素；化合物3和4对A549细胞的IC50值均大于200μM，与泰妙菌素作用相当。结合图10-13，在高浓度(200μM)下，化合物3、4和10对HepG2细胞的存活率影响均好于泰妙菌素，且化合物3和10对HEK293细胞的存活率影响也均优于泰妙菌素，化合物3对A549细胞的存活率影响好于泰妙菌素，以上可以说明在高浓度(200μM)下，化合物3、4和10对不同细胞的毒性不同程度的低于泰妙菌素。在其他浓度下，化合物3、4和10对HepG2细胞、HEK293细胞和A549细胞的存活率影响与泰妙菌素相差不大。综合来看化合物3对测试的三种细胞的毒性较小，而且其药效相比泰妙菌素也有比较大的优势，可以做进一步的研究。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物，其特征在于，为式Ⅰ化合物或其在药学上可接受的盐，结构通式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0004132125790000011
其中：R1、R2、R3、R4和R5取代基独立地选自氢、卤素、硝基、甲氧基、三氟甲基、甲基、二甲基氨基或氰基。
2.根据权利要求1所述的一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物，其特征在于，所述式Ⅰ化合物选自以下结构式：
Figure FDA0004132125790000012
3.根据权利要求1所述的一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物，其特征在于，所述药学上可接受的盐为具有如式Ⅰ所示结构的化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、富马酸、马来酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、谷氨酸或天冬氨酸形成的盐。
4.权利要求1-3任意一项所述的一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸类化合物的制备方法，其特征在于，合成路线I如下：
步骤1)以含有不同取代基的苯甲醛与氰基乙酸为原料，在反应溶剂和催化剂的共同作用下，加热回流，制备α-氰基肉桂酸类化合物；
其中，α-氰基肉桂酸类化合物为
Figure FDA0004132125790000021
步骤2)将步骤1)制得的α-氰基肉桂酸类化合物和酰氯化试剂反应，制备中间体1；
其中，中间体1为
Figure FDA0004132125790000022
步骤3)将步骤2)制得的中间体1与截短侧耳素反应，制得截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物。
5.权利要求1-3任意一项所述的一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸类化合物的制备方法，其特征在于，合成路线II如下：
步骤1)以含有不同取代基的苯甲醛与氰基乙酸为原料，在反应溶剂和催化剂的共同作用下，加热回流，制备α-氰基肉桂酸类化合物；
其中，α-氰基肉桂酸类化合物为
Figure FDA0004132125790000023
步骤2)将步骤1)得到的α-氰基肉桂酸类化合物与截短侧耳素溶于离子液体中，制得截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，含有不同取代基的苯甲醛与氰基乙酸的摩尔比为1:2；步骤2)中，α-氰基肉桂酸类化合物和酰氯化试剂的摩尔比为1:1.5-1:5：1.4；步骤3)中，中间体1和截短侧耳素的摩尔比为1:1-1:1.4。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，α-氰基肉桂酸类化合物与截短侧耳素的摩尔比为1:1-1:1.4。
8.权利要求1-3任意一项所述的一类具有抗耐药菌活性的截短侧耳素α-氰基肉桂酸酯类化合物在制备抗耐药菌药物制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗耐药菌药物为治疗感染性疾病的药物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述感染性疾病为耐药菌引起的感染性疾病。
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