CN115109083B - Pyridostatin类化合物及其制备方法、应用、药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了Pyridostatin类化合物及其制备方法、应用、药物组合物，属于肿瘤医药领域。本发明的Pyridostatin类化合物具有式a所示结构。与现有技术相比，本发明在Pyridostatin类G‑四链体配体末端引入氧化响应性基团，得到Pyridostatin类化合物，该类化合物能够在肿瘤细胞中消除氧化响应性基团，释放药物活性分子，而不在正常细胞中释放药物活性分子，实现了选择性抑制肿瘤细胞增殖。

Description

Pyridostatin类化合物及其制备方法、应用、药物组合物
技术领域
本发明涉及肿瘤医药领域，更具体地说，涉及Pyridostatin类化合物及其制备方法、应用、药物组合物。
背景技术
肿瘤严重威胁人类的健康。由于肿瘤细胞增殖速度快、发病机制复杂，抗肿瘤药物很难靶向作用于肿瘤细胞，大部分抗肿瘤药物杀死癌细胞的同时也对正常细胞造成了严重伤害，导致患者在治疗过程中正常器官受到损伤，甚至威胁生命。
Pyridostatin类G-四链体配体可以选择性稳定端粒G-四链体结构，抑制端粒酶活性，对肿瘤细胞具有较大的毒性，但也对正常细胞具有较强的杀伤力。大多数Pyridostatin类G-四链体配体无法“区分”肿瘤细胞和正常细胞，导致这类配体的无法大规模应用。例如，Balasubramanian等人报道了一系列吡啶类G-四链体配体，虽然这些配体具有突出的G-四链体结构稳定性，对肿瘤细胞具有较大的毒性，但多数配体对正常细胞也具有较强的致死性，限制了配体的进一步应用[Org.Biomol.Chem.,2012,10:6537-6546.]。因此，如何让抗肿瘤药物靶向作用于肿瘤细胞，成为人们关注的焦点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供Pyridostatin类化合物及其制备方法、应用、药物组合物，本发明制备的Pyridostatin类化合物，实现了选择性抑制肿瘤细胞增殖，该类化合物可用于制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂，或者，预防和/或治疗肿瘤的药物。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
如式a所示的Pyridostatin类化合物或其药学上可接受的盐，
式a中，2≤n≤6；R1为Ra和Rb独立地为C1～C6烷基，或者，Ra和Rb与其连接的O形成环；R2为H、卤素、取代或未取代的烷氧基中的一种。
在本发明中，Ra和Rb与其连接的O形成的环优选为R2优选为/> 2≤l≤6，1≤k≤6，1≤m≤5，Q为氧原子或氮原子，Rc为H 或C1～C4烷基。
在本发明中，所述Pyridostatin类化合物如下表所示：
在本发明的一个实施例中，Pyridostatin类化合物的结构式为
在本发明中，所述盐为无机酸盐或有机酸盐；所述无机酸盐为盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐；所述有机酸盐为乙酸盐、三氟乙酸盐、丙二酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐。
本发明还提供了一种Pyridostatin类化合物的制备方法，包括以下步骤：在碱性条件下，将式b所示的化合物和R1-G进行反应；
R1-G中，G为离去基团；所述离去基团优选为氯原子、溴原子、咪唑基、琥珀酰亚胺氧基、4-硝基苯氧基或烷氧基；
R1为Ra和Rb独立地为 C1～C6烷基，或者，Ra和Rb与其连接的O形成环。
式b中，2≤n≤6；R2为H、卤素、取代或未取代的烷氧基中的一种。
在本发明中，Ra和Rb与其连接的O形成的环优选为R2优选为/> 2≤l≤6，1≤k≤6，1≤m≤5，Q为氧原子或氮原子，Rc为H 或C1～C4烷基。
在碱性条件下，将式b所示的化合物和R1-G进行反应；在本发明中，碱性条件优选由有机碱和无机碱提供；所述有机碱为三乙胺、二异丙基乙胺中的一种或多种，优选为三乙胺；所述无机碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯中的一种或多种。
在本发明中，式b所示的化合物和所述R1的摩尔比为1:(2～10)，更优选为1:10；所述反应的温度为0～60℃，优选为60℃；时间为24-96h，更优选为24-48h，再优选为24h；所述反应优选在稀有气体的氛围下进行，更优选地，所述稀有气体为氩气。
在本发明中，所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为本领域常见的有机溶剂，优选为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和三乙胺(TEA)的混合溶液；待反应结束后，蒸馏除去溶剂，重结晶，固液分离，取固体进行柱色谱分离；所述蒸馏为减压蒸馏；所述重结晶使用的溶剂和柱色谱分离使用的洗脱剂均为二氯甲烷/甲醇(DCM/MeOH)混合溶剂；所述固液分离为过滤。
在本发明的一个实施例中，Pyridostatin类化合物的结构式为
式b所示的化合物为/>R1-G为/>该Pyridostatin 类化合物的制备反应过程如下所示：
R1-G可以按照本领域技术人员熟知的方法制备，当R1-G为时，本发明优选按照以下方法制备：
将4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和N,N'-羰基二咪唑与二氯甲烷(DCM)混合，室温下反应1～16h，待反应完成后，减压蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯 (EtOAc)溶解，将有机相洗涤、干燥，再进行过滤、浓缩；所述4-(羟甲基) 苯硼酸频哪醇酯和N,N'-羰基二咪唑的摩尔比为1:1.6；用氯化铵溶液、氯化钠溶液对所述有机相进行依次洗涤；用硫酸钠对洗涤后的有机相进行干燥；反应过程如下所示：
本发明还提供了Pyridostatin类化合物或其药学上可接受的盐在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂或者预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
在本发明中，所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞和肺癌细胞中的一种或多种；所述宫颈癌细胞为HeLa；所述乳腺癌细胞为MCF-7；所述肝癌细胞为HepG2；所述肺癌细胞为A549。
本发明还提供了一种药物组合物，包括所述Pyridostatin类化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
本发明在Pyridostatin类G-四链体配体末端引入氧化响应性基团，得到Pyridostatin类化合物，由于肿瘤细胞中的ROS水平明显高于正常细胞， Pyridostatin类化合物能够在肿瘤细胞中消除氧化响应性基团，释放药物活性分子，而在正常细胞中，由于ROS浓度较低，Pyridostatin类化合物则无法释放药物分子，氧化响应性基团降低了该类化合物的细胞毒性，实现选择性抑制肿瘤细胞增殖，从而解决了抗肿瘤药物在杀死肿瘤细胞的同时也对正常细胞造成伤害的问题。
附图说明
图1是本发明实施例1中的Pyridostatin类化合物的高分辨质谱图；
图2是本发明实施例1中的Pyridostatin类化合物的核磁共振氢谱图；
图3是本发明实施例1中的Pyridostatin类化合物的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的原料均为市售商品。
实施例1
本实施例的Pyridostatin类化合物结构如下所示，
其制备方法包括以下步骤：
(1)将4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯(化合物1，1.10g，4.70mmol)和N,N′ -羰基二咪唑(化合物2，1.22g，7.52mmol)加入15mL DCM中，室温下反应3h，反应式如下所示。减压蒸馏除去溶剂DCM，加入EtOAc溶解，有机相依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩得到1.46g白色固体(化合物3)，产率95％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ 8.13(s,1H),7.84(d,J＝8.0Hz,2H),7.41(d,J＝7.0Hz,3H),7.04(s,1H),5.40(s,2H),1.32(s,12H).步骤(1)中的反应过程如下所示：
(2)将化合物4(70mg，0.13mmol)和化合物3(215mg，0.65mmol) 加入5mL无水DMF中，再加入TEA(0.20mL，1.43mmol)，氩气氛围下升温至60℃，反应24h。减压蒸馏除去溶剂，加入DCM/MeOH混合溶剂重结晶，过滤并收集滤饼，柱色谱分离提纯，洗脱剂为DCM/MeOH(20/1，v/v)，得到20mg白色固体(化合物5)，即Pyridostatin类化合物，产率15％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.42(s,2H),8.49(d,J＝7.6Hz,2H),8.20–8.14(m,3H),8.09 (d,J＝8.2Hz,2H),7.87(d,J＝8.0Hz,2H),7.79(d,J＝7.3Hz,4H),7.66(t,J＝7.0Hz,2H),7.46–7.34(m,6H),5.37(br,2H),5.18(s,4H),4.41(t,J＝4.8Hz, 4H),3.83(dd,J＝10.3,5.0Hz,4H),1.33(s,24H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6) δ163.5,162.2,156.4,152.5,149.0,147.0,140.5,139.9,134.5,134.2,130.6,126.8,126.6,126.1,124.5,122.1,119.2,94.9,83.6,67.5,65.1,24.7.ESI-HRMS:m/z 1080.4425([C57H61B2N7O12+Na]+calcd for 1080.4457).步骤(2)中的反应过程如下所示：
实施例2
本实施例的Pyridostatin类化合物的制备方法，与实施例1的区别仅在于第 (2)步。
将化合物4(70mg，0.13mmol)和化合物3(86mg，0.26mmol)加入5mL 无水DMF中，再加入TEA(0.20mL，1.43mmol)，氩气氛围下升温至60℃，反应24h。减压蒸馏除去溶剂，加入DCM/MeOH混合溶剂重结晶，过滤并收集滤饼，柱色谱分离提纯，洗脱剂为DCM/MeOH(20/1，v/v)，得到15mg 白色固体(化合物5)，产率11％。
实施例3
本实施例的Pyridostatin类化合物的制备方法，与实施例1的区别仅在于第 (2)步。
将化合物4(70mg，0.13mmol)和化合物3(430mg，1.30mmol)加入5 mL无水DMF中，再加入TEA(0.20mL，1.43mmol)，氩气氛围下升温至60℃，反应24h。减压蒸馏除去溶剂，加入DCM/MeOH混合溶剂重结晶，过滤并收集滤饼，柱色谱分离提纯，洗脱剂为DCM/MeOH(20/1，v/v)，得到31mg 白色固体(化合物5)，产率23％。
试验例
用实施例1中的化合物4和化合物5对多种癌细胞和正常细胞的抑制率进行实验研究。上述两种化合物的体外抗肿瘤药物筛选实验是以多种癌细胞和正常细胞为实验对象，通过MTT比色法检测样品体外抗肿瘤活性。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
按细胞培养中的方法将需要测试的细胞消化处理，移除胰酶，加入1mL 完全培养基重悬细胞，取10μL进行细胞计数，将细胞浓度调整至1×10 5个 /mL。向96孔板中每孔加入1×104个细胞(100μL/孔)，置于细胞培养箱中孵育24h，吸出上清，分别加入含有化合物4、化合物5的完全培养基，孵育72h，每组样品有3个重复孔。
孵育结束后，吸出含有Pyridostatin类化合物的完全培养基，加入100μL 基础培养基和10μL MTT溶液，重新放入培养箱中孵育4h，轻轻吸出上清液，每孔加入200μL二甲基亚砜，震荡混匀后检测OD492。
细胞存活率(％)＝(实验组OD492-空白组OD492)/(对照组OD492-空白组 OD492)×100％
根据测试结果，绘制Pyridostatin类化合物浓度与细胞存活率的拟合曲线， IC50代表抑制细胞增殖率为50％时，对应Pyridostatin类化合物的浓度。
实验结果如表1所示：
表1化合物5和化合物4的细胞毒性值
由表1可知，化合物5对正常细胞的毒性较弱，对肿瘤细胞的毒性较强。而化合物4对正常细胞的毒性较强，对肿瘤细胞的毒性较弱。实验结果表明，化合物5可以选择性抑制肿瘤细胞增殖。
所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.如式a所示的Pyridostatin类化合物或其药学上可接受的盐，
式a中，2≤n≤6；
R1为Ra和Rb独立地为C1～C6烷基，或者，Ra和Rb与其连接的O形成环；
R2为H、卤素、烷氧基中的一种。
2.根据权利要求1所述的Pyridostatin类化合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，
所述Ra和Rb与其连接的O形成的环为
R2为2≤l≤6，1≤k≤6，1≤m≤5，
Q为氧原子或氮原子，Rc为H或C1～C4烷基。
3.根据权利要求1或2所述的Pyridostatin类化合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述Pyridostatin类化合物的结构式为
4.根据权利要求1或2所述的Pyridostatin类化合物在药学上可接受的盐，其特征在于，所述盐为无机酸盐或有机酸盐；
所述无机酸盐为盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐；
所述有机酸盐为乙酸盐、三氟乙酸盐、丙二酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐。
5.一种如权利要求1～4任意一项所述的Pyridostatin类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在碱性条件下，将式b所示的化合物和R1-G进行反应；
R1-G中，G为离去基团；
R1为Ra和Rb独立地为C1～C6烷基，或者，Ra和Rb与其连接的O形成环；
式b中，2≤n≤6；
R2为H、卤素、烷氧基中的一种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述离去基团为氯原子、溴原子、咪唑基、琥珀酰亚胺氧基、4-硝基苯氧基或烷氧基。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，，式b所示的化合物和R1-G的摩尔比为1:(2～10)；所述反应的温度为0～60℃，时间为24-96h。
8.如权利要求1～4任意一项所述的Pyridostatin类化合物或其药学上可接受的盐在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂或者预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述真核生物为哺乳动物；
所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞和肺癌细胞中的一种或多种。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1～4任意一项所述的Pyridostatin类化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
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Light-mediated in cell downregulation of G-quadruplex-containing genes using a photo-caged ligand;Murat, Pierre et al.;ChChemical Communications;第49卷(第76期);8453-8455 *

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