CN114249737B - 阿昔洛韦类三环核苷衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

阿昔洛韦类三环核苷衍生物及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于化学合成领域，具体公开了阿昔洛韦类三环核苷衍生物及其合成方法和应用。所述阿昔洛韦类三环核苷衍生物的结构式如下化合物2、4、6、7、8或9所示：
Figure DDA0003450859690000011
阿昔洛韦类三环核苷衍生物的合成方法，具体包括以下步骤：以阿昔洛韦或更昔洛韦或喷昔洛韦和1,1,3,3‑四甲氧基丙烷为原料，溶剂为AcOH，Ac2O为添加剂，在平行反应仪110℃反应2小时，即得化合物2、4或6；进一步，将化合物2或化合物4或化合物6为原料，K2CO3为添加剂，溶剂为甲醇，在常温下反应1h，即得化合物7、8或9。该合成方法简单，方便，收率高，反应选择性好。制得的阿昔洛韦类三环核苷衍生物具有一定的抑制HSV‑1病毒活性，在制备抗HSV‑1病毒的药物中具有一定前景。

Description

阿昔洛韦类三环核苷衍生物及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于化学合成领域，具体地，涉及化合物2、4、6、7、8、9所示的阿昔洛韦类三环核苷衍生物及其合成方法和应用。
背景技术
核苷类药物在结构上与天然的核苷存在着许多相似之处，可以在生物体内以假乱真，从而作用于蛋白质及核酸的合成。病毒性疾病是人类传染病中最棘手的问题，原因在于病毒寄宿在活体细胞内复制繁殖，难以被杀灭且易突变，从而反复攻击机体并最终导致传播。许多核苷类药物是病毒复制过程中酶的抑制剂，抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶的活性，嵌入正在合成的病毒DNA链，从而抑制或终止病毒DNA链的合成而发挥抗病毒的作用。自1962年第一种核苷药物碘苷(疱疹净，IDU)被研制出来并成功用于治疗疱疹性角膜炎以来，核苷类抗病毒药物的研究就引起了人们的广泛关注。
1977-1978年，Burroughs Wellcome公司研制开发了非环鸟苷阿昔洛韦(acyclovir，ACV)，这是第一个研制成功并上市的非环核苷类抗病毒药物，具有广谱抗菌、高效低毒、低耐受性的性能，对疱疹病毒(herpes virus)、巨细胞病毒(cytomeglo virus)及艾泼司坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)等引起的感染均有显著疗效。阿昔洛韦还适用于治疗眼科、皮肤科等疾病。另外，它与干扰素合用可治疗乙型肝炎。阿昔洛韦的结构做简单的修饰，把该非环核苷药物侧链上的氧原子换成碳原子，该化合物为9-(4-羟丁基)鸟嘌呤，简称为HBG，它对单纯性疱疹病毒有很好的抑制作用。更昔洛韦英文名Ganciclovir，简称缩写为GCV，它是人工合成的一种新的非环核苷类药物，是对抗巨细胞病毒非常有效和非常活跃的药剂，它无论在人的体外还是体内都是无毒且稳定的，在水中也是非常稳定的，并且在人体内容易代谢，是一种很好的抗病毒药物。在更昔洛韦的基础上做简单的修饰，把更昔洛韦侧链上的氧原子换成碳原子，得到一种新的化合物名为喷昔洛韦，英文名为Penciclovir，缩写简称为PCV，虽然它相对与更昔洛韦仅仅变了一个简单的原子，但他们的药效作用还是不同的，它对于抑制水痘病毒有很好的效果。
人们的研究发现，这些药物虽然能够在一定程度上抑制病情，但是存在毒副作用大，需要长期用药，患者易产生耐药性等缺点。因此我们可以通过对药物的衍生化，选择合适基团或者掺入其他杂环进行修饰可使原药或先导药物的药效得到增强，甚至产生新的药效。而掺入杂环修饰得到的稠合杂环化合物是一类具有多种生物学特性的化合物，并且用附加环修饰核苷的碱基部分通常会产生新的有趣的物理化学性质(例如，增强的亲脂性、荧光性)或生物学性质。一般来说，具有附加环的核苷类似物表现出有选择性和有效活性的关键病毒酶抑制剂。在此，我们发展了一种新的方法，将阿昔洛韦类的碱基部分用附加环修饰，得到阿昔洛韦类三环核苷衍生物。
发明内容
本发明的目的在于提供阿昔洛韦类三环核苷衍生物及其合成方法和应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：阿昔洛韦类三环核苷衍生物，其结构式如化合物2、4、6、7、8或9所示：
Figure BDA0003450859680000021
更昔洛韦、喷昔洛韦与阿昔洛韦结构近似，为了进一步细分，其中：化合物2、7是阿昔洛韦类三环核苷衍生物，化合物4、8是更昔洛韦类三环核苷衍生物，化合物6、9是喷昔洛韦类三环核苷衍生物；上述化合物的碱基部分属平面型结构。
本发明的技术方案之二是：阿昔洛韦类三环核苷衍生物的合成方法，具体包括以下步骤：
(1)以阿昔洛韦或更昔洛韦或喷昔洛韦和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(TMOP)为原料，溶剂为AcOH，Ac2O为添加剂，在平行反应仪110℃反应2h，即得化合物2、4或6。
进一步，为了得到更多的三环核苷衍生物，还包括步骤(2)：将步骤(1)所得产物通过加入K2CO3水解，将乙酰氧基水解成羟基，即得；具体为：
以步骤(1)所得产物化合物2或化合物4或化合物6为原料，K2CO3为添加剂，溶剂为甲醇，在常温下反应1h，即得化合物7、8或9。
进一步，步骤(1)：阿昔洛韦或更昔洛韦或喷昔洛韦：TMOP：添加剂：溶剂的用量关系为1mmol：1.2mmol：10mmol：4mL。
进一步，步骤(2)：化合物2或化合物4或化合物6：K2CO3：溶剂的用量关系为1mmol：4mmol：10mL。
为了确保产物的品质，步骤(1)还包括对反应液进行后处理的步骤，即浓缩反应液，以THF为洗脱剂通过柱层析分离纯化，分离出目标产物。
为了确保产物的品质，步骤(2)还包括对反应液进行后处理的步骤，即浓缩反应液，以MeOH:DCM＝10:1(v/v)的甲醇和二氯甲烷混合液为洗脱剂通过柱层析分离纯化，分离出目标产物。
具体的，化合物2、4、6、7、8、9的合成方法如下：
化合物2的合成方法为：阿昔洛韦和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(TMOP)为原料，Ac2O为添加剂，溶剂为AcOH，平行反应仪110℃反应2小时，1,1,3,3-四甲氧基丙烷选择性地对阿昔洛韦的亚氨基进行连接，并发生环合，从而构建了结构新颖的阿昔洛韦三环核苷衍生物。合成的反应式如路线1所示：
路线1
Figure BDA0003450859680000031
反应条件：TMOP(1.2equiv),Ac2O(10.0equiv),AcOH,110℃,2h.
化合物4的合成方法为：更昔洛韦和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(TMOP)为原料，Ac2O为添加剂，溶剂为AcOH，平行反应仪110℃反应2小时，1,1,3,3-四甲氧基丙烷选择性地对更昔洛韦的亚氨基进行连接，并发生环合，合成的反应式如路线2所示：
路线2
Figure BDA0003450859680000041
反应条件：TMOP(1.2equiv),Ac2O(10.0equiv),AcOH,110℃,2h.
化合物6的合成方法为：喷昔洛韦和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(TMOP)为原料，Ac2O为添加剂，溶剂为AcOH，平行反应仪110℃反应2小时，1,1,3,3-四甲氧基丙烷选择性地对喷昔洛韦的亚氨基进行连接，并发生环合，合成的反应式如路线3所示：
路线3
Figure BDA0003450859680000042
反应条件：TMOP(1.2equiv),Ac2O(10.0equiv),AcOH,110℃,2h.
化合物7的合成方法为：化合物2为原料，K2CO3为添加剂，溶剂为甲醇，在常温下反应1h，K2CO3使化合物2上的乙酰氧基水解成羟基，得到目标化合物7，合成的反应式如路线4所示：
路线4
Figure BDA0003450859680000043
反应条件：K2CO3(4.0equiv),MeOH,rt,1h.
化合物8的合成方法为：化合物4为原料，K2CO3为添加剂，溶剂为甲醇，在常温下反应1h，K2CO3使化合物4上的乙酰氧基水解成羟基，得到目标化合物8，合成的反应式如路线5所示：
路线5
Figure BDA0003450859680000044
反应条件：K2CO3(4.0equiv),MeOH,rt,1h.
化合物9的合成方法为：化合物6为原料，K2CO3为添加剂，溶剂为甲醇，在常温下反应1h，K2CO3使化合物6上的乙酰氧基水解成羟基，得到目标化合物9，合成的反应式如路线6所示：
路线6
Figure BDA0003450859680000051
反应条件：K2CO3(4.0equiv),MeOH,rt,1h.
本发明涉及的“eqviv”、“当量”含义相同，均是指物质的量当量。
本发明涉及的“常温”、“rt”含义相同，均是指温度范围为25–30℃。
本发明的技术方案之三是：上述阿昔洛韦类三环核苷衍生物或上述方法合成得到的阿昔洛韦类三环核苷衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用，优选在制备抗HSV-1(单纯疱疹病毒1型)病毒药物中的应用。
优选的，上述方法合成的化合物7、8或9在制备抗HSV-1病毒药物中的应用；更优选的，上述方法合成的化合物7在制备抗HSV-1病毒药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
本发明提供了结构新颖的阿昔洛韦类三环核苷衍生物及其合成方法，本方法使用对环境友好的AcOH作为溶剂，Ac2O为添加剂，该实验过程操作简单，方便，收率高，该反应的化学选择性好，从而构建了一系列结构新颖的阿昔洛韦类三环核苷衍生物，基于所述合成方法，本发明合成了结构新颖的阿昔洛韦类三环核苷衍生物。
该方法以1,1,3,3-四甲氧基丙烷与阿昔洛韦类化合物在酸性条件下环合，为三环核苷类化合物的合成提供了新的方法与思路。本发明制得的阿昔洛韦类三环核苷衍生物具有一定的抑制HSV-1病毒活性，其中化合物7与阳性药阿昔洛韦接近，因此，本发明提供的阿昔洛韦类三环核苷衍生物在制备抗HSV-1病毒的药物中具有一定前景。
具体实施方式
以下具体实施例仅用于详细说明本发明的具体实施方式，并不限制本发明的权利要求书请求保护的范围。
以下具体实施方式中，
TMOP为1,1,3,3-四甲氧基丙烷来源于Innochem(纯度98％)；Ac2O指Aceticanhydride(乙酸酐)来源于国药集团有限公司(纯度98.5％)；AcOH指Acetic acid(乙酸)来源于aladdin(纯度99.5％)；阿昔洛韦来源于damas-beta(纯度98％+)；更昔洛韦来源于damas-beta(纯度98％+)；喷昔洛韦来源于Ark Pharm(纯度99.98％)；
平行反应仪：联华玻璃仪器(ETS-D5)。
旋转蒸发仪：EYELA(OSB-2100)；真空隔膜泵：WELCH(115046)。
对比例1
化合物2的制备:
Figure BDA0003450859680000061
操作如下：阿昔洛韦1(22.5mg,0.1mmol),AcOH(0.4mL)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(25uL,0.15mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌32小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物2(6.7mg,22％yield).Yellow solid,mp:133–135℃.1H NMR(500MHz,CDCl3:AcOH-d4＝18:1)δ9.42–9.38(m,1H),8.94(s,1H),8.06(d,J＝2.4Hz,1H),7.14–7.11(m,1H),5.68(d,J＝4.1Hz,2H),4.14–4.05(m,2H),3.80–3.71(m,2H),1.98–1.91(m,3H).13C{1H}NMR(125MHz,CDCl3:AcOH–d4＝18:1)δ171.2,161.4,152.7,150.4,149.7,142.1,137.6,118.1,110.0,72.5,67.5,62.6,20.3.HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd forC13H14N5O4304.1046,Found 304.1039；IR(KBr)v(cm-1):1725,1630,1570,1537,1475,1378,1268,1211.
对比例2
化合物2的制备:
Figure BDA0003450859680000071
操作如下：阿昔洛韦1(22.5mg,0.1mmol),Ac2O(48uL,0.5mmol),AcOH(0.4mL)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(25uL,0.15mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌32小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物2(10.3mg,34％yield).Yellow solid,mp:133–135℃.1H NMR(500MHz,CDCl3:AcOH-d4＝18:1)δ9.42–9.38(m,1H),8.94(s,1H),8.06(d,J＝2.4Hz,1H),7.14–7.11(m,1H),5.68(d,J＝4.1Hz,2H),4.14–4.05(m,2H),3.80–3.71(m,2H),1.98–1.91(m,3H).13C{1H}NMR(125MHz,CDCl3:AcOH–d4＝18:1)δ171.2,161.4,152.7,150.4,149.7,142.1,137.6,118.1,110.0,72.5,67.5,62.6,20.3.HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C13H14N5O4304.1046,Found 304.1039；IR(KBr)v(cm-1):1725,1630,1570,1537,1475,1378,1268,1211.
实施例1
化合物2的制备:
Figure BDA0003450859680000072
操作如下：阿昔洛韦1(22.5mg,0.1mmol),Ac2O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2.0小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物2(27.0mg,89％yield).Yellow solid,mp:133–135℃.1HNMR(500MHz,CDCl3:AcOH-d4＝18:1)δ9.42–9.38(m,1H),8.94(s,1H),8.06(d,J＝2.4Hz,1H),7.14–7.11(m,1H),5.68(d,J＝4.1Hz,2H),4.14–4.05(m,2H),3.80–3.71(m,2H),1.98–1.91(m,3H).13C{1H}NMR(125MHz,CDCl3:AcOH–d4＝18:1)δ171.2,161.4,152.7,150.4,149.7,142.1,137.6,118.1,110.0,72.5,67.5,62.6,20.3.HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C13H14N5O4304.1046,Found304.1039；IR(KBr)v(cm-1):1725,1630,1570,1537,1475,1378,1268,1211.
实施例2
化合物4的制备:
Figure BDA0003450859680000081
操作如下：更昔洛韦3(25.5mg,0.1mmol),Ac2O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2.0小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物4(27.5mg,73％yield).Yellow solid,mp:120–122℃,1HNMR(500MHz,CDCl3)δ9.42(d,J＝6.6Hz,1H),8.95(s,1H),8.08(s,1H),7.13(dd,J＝6.5and 3.5Hz,1H),5.74(s,2H),4.12(s,1H),4.10(s,2H),4.02–3.92(m,2H),1.91(s,6H).13C{1H}NMR(125MHz,CDCl3)δ170.9,161.4,152.7,150.3,149.8,142.2,137.7,118.0,110.0,74.9,71.8,62.8,20.1.HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C16H18N5O6 376.1257,Found 376.1249；IR(KBr)v(cm-1):3456,1744,1716,1635,1224,1070,1032.
实施例3
化合物6的制备:
Figure BDA0003450859680000091
操作如下：喷昔洛韦5(25.3mg,0.1mmol),Ac2O(95uL,1.0mmol),AcOH(0.4mL)和1,1,3,3-四甲氧基丙烷(20uL,0.12mmol)依次加入25mL玻璃密封管中，封管中的盖子盖紧，将反应混合物放在平行反应仪中110℃下搅拌2.0小时。反应完后，冷却至室温，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以THF为洗脱剂，分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物6(32.5mg,87％yield).Yellow solid,mp:111–113℃.1HNMR(500MHz,CDCl3)δ9.46(dd,J＝7.1and 1.7Hz,1H),8.96(t,J＝2.8Hz,1H),7.98(s,1H),7.10(dd,J＝7.1and 3.7Hz,1H),4.41(t,J＝7.2Hz,2H),4.16–4.08(m,4H),2.05(s,6H),2.04–1.99(m,3H).13C{1H}NMR(125MHz,CDCl3)δ171.4,161.1,152.9,150.3,149.5,142.1,137.7,118.7,109.8,63.5,41.5,34.8,28.8,20.5.HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd forC17H20N5O5 374.1464,Found 374.1460；IR(KBr)v(cm-1):3446,1729,1635,1540,580,448,433.
实施例4
化合物7的制备:
Figure BDA0003450859680000092
操作如下：化合物2(30.3mg,0.1mmol),K2CO3(55.3mg,0.4mmol)和MeOH(1.0mL)依次加入10mL反应瓶中，在常温下搅拌1小时。反应完后，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以MeOH:DCM＝10:1(v/v)为洗脱剂分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物7(23.3mg,89％yield).Yellow solid,mp:103–105℃.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.42–9.38(m,1H),8.94(s,1H),8.06(d,J＝2.4Hz,1H),7.14–7.11(m,1H),5.68(d,J＝4.1Hz,2H),5.45(s,1H),4.14–4.05(m,2H),3.80–3.71(m,2H).13C{1H}NMR(125MHz,DMSO-d6)δ161.4,152.7,150.4,149.7,142.1,137.6,118.1,110.0,72.5,67.5,62.6.HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C11H12N5O3262.0940,Found 262.0932；IR(KBr)v(cm-1):1628,1543,1531,1462,1361,1248.
实施例5
化合物8的制备:
Figure BDA0003450859680000101
操作如下：化合物4(37.5mg,0.1mmol),K2CO3(55.3mg,0.4mmol)和MeOH(1.0mL)依次加入10mL反应瓶中，在常温下搅拌1小时。反应完后，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以MeOH:DCM＝10:1(v/v)为洗脱剂分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，物得到产物8(24.8mg,85％yield).Yellow solid,mp:110–112℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.42(d,J＝6.6Hz,1H),8.95(s,1H),8.08(s,1H),7.13(dd,J＝6.5and 3.5Hz,1H),5.74(s,2H),4.12(s,1H),4.10(s,2H),4.02–3.92(m,2H),3.90(s,1H),3.85(s,1H).13C{1H}NMR(125MHz,DMSO-d6)δ170.9,161.4,152.7,150.3,149.8,142.2,137.7,118.0,110.0,74.9,61.0,61.0.HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd forC12H14N5O4292.1046,Found 292.1038；IR(KBr)v(cm-1):3412,1621,1210,1061,1010.
实施例6
化合物9的制备:
Figure BDA0003450859680000111
操作如下：化合物6(37.5mg,0.1mmol),K2CO3(55.3mg,0.4mmol)和MeOH(1.0mL)依次加入10mL反应瓶中，在常温下搅拌1小时。反应完后，先将反应液转移至25mL的圆底烧瓶中，在30℃的水浴锅中通过旋转蒸发仪在真空隔膜泵中蒸发浓缩反应液5min，反应液旋干后直接通过柱层析分离纯化，以MeOH:DCM＝10:1(v/v)为洗脱剂分离出目标产物，然后再将目标产物蒸发浓缩成固体，得到产物9(25.0mg,86％yield).Yellow solid,mp:106–108℃.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.46(dd,J＝7.1and 1.7Hz,1H),8.96(t,J＝2.8Hz,1H),7.98(s,1H),7.10(dd,J＝7.1and 3.7Hz,1H),4.41(t,J＝7.2Hz,2H),4.16–4.08(m,4H),3.94(s,1H),3.91(s,1H),1.69(s,2H),1.40(s,1H).13C{1H}NMR(125MHz,CDCl3)δ161.1,152.9,150.3,149.5,142.1,137.7,118.7,109.8,63.5,63.5,41.5,34.8,26.6.HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C13H16N5O3290.1253,Found 290.1231；IR(KBr)v(cm-1):3431,1621,1531,576,431.
实施例1-6制备的化合物对疱疹病毒(HSV-1)的作用实验
1.材料
样品：实施例1-6制备的化合物2,4,6,7,8,9.
仪器:电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；多功能搅拌机，常州国华仪器厂；4℃离心机，Thermo公司；光学显微镜，荧光显微镜，OLYMPUS公司；TS-8S摇床，Qilinbeier公司；低速离心机，中科创新股份有限公司；0.22uM滤膜，Milipore公司；-80℃冰箱，Thermo公司；CO2恒温培养箱，Thermo公司；96孔细胞培养板，Thermo公司；流式细胞分选仪，BD公司；旋涡震荡仪，海门市其林贝尔仪器有限公司；超净工作台，苏州净化设备公司；高压灭菌锅，SANYO；电子恒温水浴锅，上海森信仪器公司；制冰机，德国SCOTSMRA公司。
试剂：DMSO，Sigma公司；L-谷氨酰胺，胎牛血清，GIBCO公司；0.01mol/LpH7.4 PBS缓冲液干粉，索莱宝；DMEM培养基，Thermo公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，美国SIGMA公司；阿昔洛韦，湖北科益制药有限公司。
实验细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)，来自ATCC；HSV-1由武汉大学医学病毒学研究所提供。
2.实验方法
主要试剂的配置
(1)谷氨酰胺溶液：称取谷氨酰胺粉末2.922g，溶于100mL灭菌水中，配成200mmol/L的溶液，待粉末溶解完全，过0.22um微孔滤膜除菌，分装至1mLEP管，-20℃保存。
(2)细胞维持液：含2％胎牛血清、1％双抗溶液(青霉素、链霉素)和1％谷氨酰胺溶液的DMEM培养液，密封4℃保存。
(3)MTT溶液用0.01mol/LpH 7.4的PBS缓冲液溶解，配成5mg/mL溶液，0.22um滤膜过滤除菌，分装，避光4℃保存。
(4)DMEM完全培养基：含10％胎牛血清、1％双抗溶液(青霉素、链霉素)和1％谷氨酰胺溶液的DMEM培养液，4℃保存备用。
(5)化合物2,4,6,7,8,9的溶解
用电子天平称取一定质量的化合物固体粉末，用DMSO溶解为所需浓度。
(6)细胞培养
Vero细胞用DMEM完全培养基连续传代3次，保持对数生长期供实验用。
(7)病毒培养
(a)Vero细胞长至单层，弃培养液。取出-80℃保存的HSV-1病毒，迅速融解，将200uL的病毒悬液加入培养瓶(25mL)，于37℃，5％CO2培养箱中吸附2h，期间每隔15min缓慢摇晃几次，使吸附均匀。
(b)2h后，加入细胞维持液9mL，继续培养。当观察到培养瓶中的细胞变圆并且开始有大量脱落时，将培养瓶立即转移到-80℃冰箱中，在存冻期间将培养瓶拿出来，反复冻融三次，使细胞裂解充分并将病毒释放出来，并按照每管1.5mL的比例将病毒分装到事先放好的2mL病毒冻存管中，-80℃保存备用。
(8)病毒滴度测定
(a)将生长良好的Vero细胞以每孔100μL，细胞密度为1.5×105cells/mL铺在96孔板中；
(b)待细胞长成致密单层后，小心的取出病毒原液，将病毒原液放在冰上进行溶解；
(c)在生物安全柜中拿出10个已经灭过菌的血清瓶，依次排好并做好标记，先依次在10个血清瓶中分别加入900μL的细胞维持液，再吸取100μL已经完全溶解好的病毒原液加入到其中一个血清瓶中，将这个浓度标记为10-1，接着从10-1浓度的血清瓶中吸出100μL的病毒混合液加入到另外一个血清瓶中，将这个浓度标记为10-2，按照同样的方法，以此类推，分别稀释出10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的浓度梯度；
(d)小心的取出96孔板，弃去板中原有的细胞生长液，然后用枪头将残余的细胞培养基吸净，向96孔板中缓慢地加入事先稀释好的病毒浓度梯度，每个浓度梯度做8个复孔，每个孔加100μL，同时取8个复孔设置成没有感染病毒组，即为细胞对照组，每个复孔加入100μL的细胞维持液，然后放到培养箱中继续培养；
(e)每隔2h仔细观察细胞的病变情况，同时做好详细的实验记录，记录下每个浓度梯度的致细胞病变效应(CPE)值，单个孔的细胞病变情况评价方法用“+”表示(“++++”：75％～100％细胞病变；“+++”：50％～75％细胞病变；“++”：25％～50％细胞病变：“+”：0～25％细胞病变)；
(f)直到观察发现细胞的病变情况不再发生变化后方可停止观察记录，将每个浓度梯度中的细胞的病变孔数统计下来，利用Reed Muench公式计算HSV-1的半数组织感染量(TCID50)。
公式为：
Figure BDA0003450859680000131
TCID50＝细胞病变大于50％的稀释度的对数值+距离比。
结果表明：病毒的TCID50为10-4，即接种滴度为10-4的病毒每孔100μL，可使50％的细胞发生病变。因此确定实验用病毒滴度为100TCID50，即10-2。(9)实施例1-6制备的化合物2,4,6,7,8,9对Vero细胞毒性实验
将对数生长期的Vero细胞以1.5×104/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁至单层时，弃掉旧培养基，PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入不同浓度的药物(药物用细胞维持液稀释)，每个浓度100μL，设三个复孔，同时设立阳性药对照组(阿昔洛韦，ACV)、正常细胞对照组和空白组。37℃条件下5％CO2培养箱培养3天后，培养孔中各加入浓度为5mg/mL的MTT溶液50uL，37℃条件下5％CO2培养箱培养4h后加入50uLDMSO，摇床震荡10分钟，待化合物完全溶解后，用酶标仪在570nm波长测定OD值。细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)*100％。
(10)实施例1-6制备的化合物2,4,6,7,8,9在体外抗HSV-1病毒的药效学实验
将对数生长期的Vero细胞以1.5×10-4/孔接种于96孔板中培养24h，待细胞贴壁至单层后，弃掉培养液，用0.01mol/LpH 7.4的PBS缓冲液洗涤细胞3次，每孔加入100TCID50/100μL的病毒悬液，置37℃条件下5％CO2培养箱吸附2h，弃掉病毒液，分别将不同浓度的药物加入96孔板中，200uL/孔，每个浓度设5个复孔。同时设置阳性药对照组(阿昔洛韦，ACV)、病毒对照组和正常细胞对照组，置37℃条件下5％CO2培养箱培养72h，观察细胞病变(CPE)。当病毒对照组达到75％-100％病变时，记录细胞病变情况，并用MTT法测定波长在570nm时各组细胞的OD值。病毒抑制率＝(实验组OD值-病毒组OD值)/(对照组OD值-病毒组OD值)*100％。
(11)实施例1-6制备的化合物对Vero细胞毒性测试结果
光学显微镜下观察正常细胞对照组基本没有发生病变，生长良好；实施例1-6制备的化合物对Vero细胞的毒性作用表现为细胞皱缩、变圆、变长，颗粒增加，细胞界限模糊；用MTT法测得各组分OD值及各组存活率见表1-1、1-2，并测得在浓度为31.25ug/mL时，所对应的细胞存活率均大于80％。
表1-1阳性对照药和化合物2、4、6对细胞存活率的影响
Figure BDA0003450859680000141
表1-2化合物7、8、9对细胞存活率的影响
Figure BDA0003450859680000142
Figure BDA0003450859680000151
(12)实施例1-6制备的化合物在体外抗HSV-1的药效学实验结果
把待观察的细胞做完细胞爬片和DAPI染色后，在荧光显微镜下观察到正常细胞对照组基本没有发生病变，生长良好，实验所设病毒对照组细胞75％以上明显变圆，细胞间融合、脱落、碎裂，给药组均有不同程度的细胞病变，但仍有部分细胞保持正常形态。
本申请检测了6个化合物的抗病毒活性，如表2-1、2-2所示。随着化合物浓度的增大，病毒所致细胞病变不同程度减少，在25ug/mL时均能有一定程度的抑制HSV-1所致细胞病变，且对HSV-1抑制率达到50％以上，其中化合物7在浓度为50ug/mL时，对HSV-1的抑制率达81.1％，与阳性药阿昔洛韦接近。
表2-1阳性对照药和化合物2、4、6对HSV-1的抑制率
Figure BDA0003450859680000152
表2-2化合物7、8、9对HSV-1的抑制率
Figure BDA0003450859680000153
Figure BDA0003450859680000161
表3显示了实施例1-6制备的化合物在浓度为3.125μg/mL-6.25μg/mL之间，大部分细胞均发生病变，最后发生病变性死亡，而化合物2、4、6在浓度为12.5μg/mL-50μg/mL时，对HSV-1的抑制效果较弱。化合物7、8、9在50μg/mL-25μg/mL浓度下能抑制>50％的HSV-1感染，其中化合物7在50μg/mL时能抑制>75％的HSV-1感染，因此化合物7对HSV-1的抑制效果最好。
表3阳性对照药和实施例1-6制得的化合物对HSV-1的抑制效果
Figure BDA0003450859680000162
注：“+”：1％～25％细胞发生病变；“++”：25％～50％细胞发生病变；“+++”：50％～75％细胞发生病变；“++++”：75％～100％细胞发生病变。
3.实验结论
用6个新合成的化合物采用CPE法，观察细胞病变效应和抗HSV-1病毒活性研究。用MTT法计算细胞存活率，在浓度为31.25ug/mL时，各化合物处理的细胞存活率均大于80％。各化合物在25ug/mL时均能有一定程度的抑制HSV-1所致细胞病变，且对HSV-1抑制率达到50％以上，表现出具有一定的生物活性；化合物7、8、9在50μg/mL-25μg/mL浓度下能抑制>50％的HSV-1感染。化合物7作用于Vero细胞毒性最小，且病毒抑制效果最好，与阳性药阿昔洛韦接近。

Claims (9)

1.阿昔洛韦类三环核苷衍生物，其特征在于，其结构式如化合物2、4、6、7、8或9所示：
Figure FDA0003972395040000011
2.权利要求1所述的阿昔洛韦类三环核苷衍生物的合成方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)以阿昔洛韦或更昔洛韦或喷昔洛韦和1,1,3,3-四甲氧基丙烷为原料，溶剂为AcOH，Ac2O为添加剂，在110℃反应2h，即得化合物2、4或6。
3.权利要求2所述的阿昔洛韦类三环核苷衍生物的合成方法，其特征在于，还包括步骤(2)：以步骤(1)所得产物化合物2或化合物4或化合物6为原料，K2CO3为添加剂，溶剂为甲醇，在常温下反应1h，即得化合物7、8或9。
4.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)：阿昔洛韦或更昔洛韦或喷昔洛韦：TMOP：添加剂：溶剂的用量关系为1mmol：1.2mmol：10mmol：4mL。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)：化合物2或化合物4或化合物6：K2CO3：溶剂的用量关系为1mmol：4mmol：10mL。
6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤(1)还包括对反应结束后所得反应液进行后处理的步骤：浓缩反应液，通过柱层析分离纯化。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(1)、(2)均还包括对反应结束后所得反应液进行后处理的步骤：浓缩反应液，通过柱层析分离纯化。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)通过柱层析分离所用洗脱剂为THF；所述步骤(2)通过柱层析分离所用洗脱剂为MeOH和DCM混合液，二者体积比为MeOH:DCM＝10:1。
9.权利要求1所述的阿昔洛韦类三环核苷衍生物或权利要求2-7任一所述方法合成的阿昔洛韦类三环核苷衍生物在制备抗HSV-1病毒药物中的应用。
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