CN113024573B - 表鬼臼毒素衍生物及制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

表鬼臼毒素衍生物及制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表鬼臼毒素衍生物，具有通式I所示结构：

Description

表鬼臼毒素衍生物及制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种表鬼臼毒素衍生物及制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
鬼臼脂素是从美洲鬼臼和喜玛拉雅鬼臼中分离得到的天然抗肿瘤活性成分，但由于严重的毒副作用限制了其在临床上的应用。经结构改造后已有依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等鬼臼毒素类药物成功上市。依托泊苷(VP-16)作为第一个上市的半合成鬼臼毒素衍生物，主要用于治疗小细胞肺癌，对急性白血病、恶性淋巴瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌等也有效。
近年来发现的系列新化学结构修饰的鬼臼毒素类化合物除了对小细胞癌具有明显作用外，还对体外非小细胞肺癌细胞株也表现出良好的活性。目前，鬼臼毒素类衍生物其抗肿瘤作用机理主要有：(1)抑制细胞微管聚合，阻止细胞有丝分裂，使其停滞在中期。(2)抑制拓扑异构酶II(Topo-II)活性，形成稳定的DNA-Topo II-药物分子复合物，造成DNA断裂，引起细胞死亡。(3)抑制细胞对胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤等各类核苷的摄取，进而抑制细胞DNA、RNA以及蛋白质的合成。其中，通过抑制拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)为主要机制，也是目前此类药物的研究热点。
VP-16和VM-26作为Topo II抑制剂，仍存在抗瘤谱窄、骨髓抑制和胃肠道毒副反应等不足，所以对VP-16等鬼臼毒素类化合物进行结构改造，继续开展新一代鬼臼毒素类化合物的研究，获得新的抗瘤谱较广、毒副作用较小的化合物是新型抗肿瘤药物研发的方向。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新型表鬼臼毒素衍生物。
本发明的第二个目的是提供一种所述表鬼臼毒素衍生物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种所述表鬼臼毒素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明针对表鬼臼毒素结构中对抗肿瘤活性影响作用较大的4β-羟基为主要结构修饰位点，将取代苯基、取代吡啶基、五元杂环基、吲哚基等含不同取代基的芳香(杂)环基通过丙烯酰胺键引入至表鬼臼毒素结构母核的4β位中，形成4β-芳(杂)环丙烯酰胺大共轭体系，使其在具有一定的刚性和键长的同时，形成烯芳(杂)环与鬼臼4-酰胺的大共轭体系，这个特有结构的发明和成功合成，对保持和增强鬼臼化合物的抗肿瘤活性非常重要，可以使此类表鬼臼毒素衍生物嵌入到TopoⅡα结构中，与DNA形成一个十字交叉的稳定的空间结构，从而发挥抗肿瘤作用。
本发明提供的新型表鬼臼毒素衍生物：4′-去甲基表鬼臼毒素-4-脱氧-4β-4-芳(杂)环取代基丙烯酰胺类化合物，是一类与现有化合物结构不同的新型表鬼臼毒素衍生物，其制备方法简便可控易行，所得候选化合物有良好的肿瘤细胞抑制活性，具有良好的市场开发前景。
本发明的第一方面提供了一种新型表鬼臼毒素衍生物，具有通式I所示结构：
Figure BDA0002332759440000021
其中，R为取代或未取代的C4～C15芳基、取代或者非取代的C2～C15杂芳基、取代或未取代的C6～C15稠芳基、取代或未取代的C4～C-15稠杂芳基。
较优选的，所述通式I中，R为取代或未取代苯基、取代或未取代萘基、取代或未取代呋喃基、取代或未取代噻吩基、取代或未取代吡啶基、取代或未取代咪唑基、取代或未取代吲哚基、取代或未取代氮苯基咔唑基、取代或未取代的苯并呋喃基、取代或未取代的二苯并呋喃基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的二苯并噻吩基。
进一步较优选的，所述通式I中，R为C1～C3烷基取代的苯基、苯基、C1～C3烷氧基取代的苯基、硝基取代的苯基、卤素取代的苯基、三氟甲基取代的苯基、胺基取代的苯基、二氨基取代的苯基、噻吩基、C1～C3烷基取代的噻吩基、C1～C3烷氧基取代的噻吩基、卤素取代的噻吩基、呋喃基、C1～C3烷基取代的呋喃基、C1～C3烷氧基取代的呋喃基、卤素取代的呋喃基、咪唑基、C1～C3烷基取代的咪唑基、C1～C3烷氧基取代的咪唑基、卤素取代的咪唑基、吲哚基、C1～C3烷基取代的吲哚基、C1～C3烷氧基取代的吲哚基、卤素取代的吲哚基、吡啶基、C1～C3烷基取代的吡啶基、C1～C3烷氧基取代的吡啶基、卤素取代的吡啶基。
更优选的，所述通式I中，R为以下结构中的一种：
Figure BDA0002332759440000031
最优选的，所述表鬼臼毒素衍生物为以下结构的一种：
Figure BDA0002332759440000032
Figure BDA0002332759440000041
Figure BDA0002332759440000051
本发明的第二方面还提供了一种所述表鬼臼毒素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0002332759440000052
将化合物III与化合物II在有机溶剂、碱、缩合剂存在下进行缩合反应，获得通式I所示化合物。
所述碱、缩合剂与化合物II的摩尔比为(1.5～2.5):(1～2):1。
所述化合物II与化合物III的摩尔比为1:(1～2)。
所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDCI)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)N,N,N’,N’-四甲基六氟磷酸酯(HATU)、氰基磷酸二乙酯(DEPC)中的至少一种，优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDCI)和/或1-羟基苯并三氮唑(HOBt)。
所述碱为有机碱，所述有机碱为三乙胺。
所述化合物III为3-(2-噻吩基)丙烯酸、3-(4-溴-2-噻吩基)丙烯酸、3-(3-甲基-2-噻吩基)丙烯酸、3-(2-呋喃基)丙烯酸、3-(1H-咪唑-2-基)-丙烯酸、3-(3-吡啶)丙烯酸、3-(2-吡啶)丙烯酸、3-(2-甲氧基吡啶-3-基)丙烯酸、吲哚-2-丙烯酸酸、吲哚-3-丙烯酸、2，4-二甲氧基肉桂酸、2,3-二甲氧基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-硝基肉桂酸、3-硝基肉桂酸、肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、4-氯肉桂酸、4-溴肉桂酸、4-氟肉桂酸。
所述制备方法为以下三种方法的一种：
方法一：将摩尔比为1:1:1的化合物III、EDCI、HOBt加入有机溶剂中搅拌混合均匀，向反应液中加入化合物II和三乙胺，化合物II、三乙胺与化合物III的摩尔比为(0.5～0.8):(1.1～2):1，TLC检测反应完全，得到通式I所示化合物；
方法二：冰浴下，将摩尔比为1:1的化合物III、化合物II加入干燥的有机溶剂中，冰浴下搅拌，依次加入氰基磷酸二乙酯和三乙胺，氰基磷酸二乙酯、三乙胺与化合物III的摩尔比为1:(1.5～2.5):1，在冰浴下继续反应，TLC检测反应完全，得到通式I所示化合物；
方法三：室温下，将化合物III和HATU加入至干燥的有机溶剂中搅拌，加入三乙胺，反应液变黄，继续搅拌加入化合物II的盐酸盐，化合物III、HATU、三乙胺、化合物II的摩尔比为(1.1～2):(1.1～2):(2～4):1，TLC检测原料点消失，得到通式I所示化合物。
所述有机溶剂为卤代烃类溶剂和/或酰胺类溶剂。
所述卤代烃类溶剂为氯代烃类溶剂。
所述氯代烃类溶剂为二氯甲烷。
所述酰胺类溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
所述有机溶剂与化合物II的体积质量比为2mL/g～8mL/g。
所述缩合反应的温度较佳地为5℃～25℃。
所述缩合反应的进程可以采用本领域中的常规测试方法(如TLC或HPLC)进行监控，反应时间较佳地为0.5～12小时。
所述缩合反应结束后，还包括后处理的操作。所述后处理的方法和条件可为本领域后处理常规的方法和条件，较佳地为将缩合反应结束后的反应液，加水淬灭，采用酯类溶剂(例如乙酸乙酯)或卤代烃类溶剂(例如二氯甲烷)萃取(次)，有机层依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗、水和盐水(饱和氯化钠水溶液)洗涤，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥有机层，过滤，除去溶剂，经柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯体系梯度洗脱)分离纯化即得目标化合物。
本发明的第三方面还提供了一种所述表鬼臼毒素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤为肺癌、肝癌或白血病。
所述肿瘤为人非小细胞肺癌细胞、人早幼粒白血病细胞、人肝癌细胞或小鼠淋巴白血病细胞。所述人非小细胞肺癌细胞为人非小细胞肺癌细胞株A549，所述人早幼粒白血病细胞为人早幼粒白血病细胞株HL-60，所述人肝癌细胞为人肝癌细胞株HepG2，所述小鼠淋巴白血病细胞为小鼠淋巴细胞白血病细胞株L1210。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供了一类具有良好的肿瘤细胞抑制活性的新型化合物：4′-去甲基表鬼臼毒素-4-脱氧-4β-4-芳(杂)环取代基丙烯酰胺类化合物，其制备方法和后处理简便可控易行，具有良好的市场开发前景。
本发明的试验证明，本发明公开的所述表鬼臼毒素衍生物具有良好的肿瘤抑制活性，可以作为抗肿瘤药物使用，对白血病、肝癌、肺癌等疾病有效。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
下述实施例中，如未作特别说明，其投料比一般是指摩尔比。室温是指5～25℃。冰浴是指-5～5℃。
本发明实施例制备的通式I所示化合物的方法如下所示：
4β-氯代乙酰胺基-4-去氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(3)的合成
Figure BDA0002332759440000071
室温下，将4′-去甲基表鬼臼毒素(化合物2)(13g，33.1mmol)加入至氯乙腈(25g，331mmol)中，滴加0.15mL质量分数为80％的浓硫酸，搅拌，约1min后有白色固体生成，至不再有白色固体生成时加入50mL异丙醇，抽滤，滤饼继续用100mL异丙醇洗涤两次，再用水洗至中性，置于真空干燥箱(40℃)干燥4h，得到白色固体粉末(化合物3)15.7g，收率99.9％。
ESI-MS：476(M+H)+，493(M+H3O)+.
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):8.60(dd,NH,1H),8.20(d,OH，重水交换消失，1H),6.89(d,DMEP-5H,1H),6.52(d,DMEP-8H,1H),6.23(s,H-2′,6′,2H),6.00(d,-OCH2O,2H),5.19(dd,DMEP-H-4,1H),4.50(d,DMEP-H-1,1H),4.34(t,H-11α,1H),3.79(t,H-11β,1H),4.19(sCH2,2H),3.89(s,2’,6’-O-CH3,6H),3.21(dd,s,H-1,1H),3.15(m,3H,1H).
4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素(II)的合成
Figure BDA0002332759440000081
将4β-氯代乙酰胺基-4-去氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(化合物3)(15.7g，33.05mmol)加入至50mL冰醋酸中，升温至80℃，加入硫脲(2.52g，33.05mmol)，约10min内可看到反应液由浑浊变澄清，维持在80℃搅拌反应1.5h，有白色固体生成，反应结束后加入50mL冰醋酸稀释固体，抽滤，滤饼用无水乙醚(150mL×3)洗涤，真空干燥，得到白色4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素(II)固体11.6g，收率88％。
ESI-MS：400(M+H)+.
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):8.60(s,-NH2重水交换消失，2H),8.20(s,OH重水交换消失,1H),7.20(d,DMEP-H5,1H),6.80(d,DMEP-H8,1H),6.19(s,H-2’,6’,2H),6.00(d,-OCH2O,2H),4.78(d,DMEP-H-4,1H),4.57(d,DMEP-H-1,1H),4.34(m,H-11α,β,2H),3.60(s,2’,6’-O-CH3,6H),3.08(m,H-3,1H).
4β-4-芳(杂)环取代丙烯酰胺基-4′-去甲基表鬼臼毒素(通式I)的合成
Figure BDA0002332759440000082
方法一：室温下，将芳(杂)环取代丙烯酸酸化合物III(2.25mmol)、EDCI(2.25mmol)、HOBt(2.25mmol)加入20-50mL二氯甲烷中，搅拌0.5h，向反应液中加入4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素即化合物II(1.5mmol)和三乙胺(3mmol)，TLC检测反应完全，加水淬灭反应。浓缩后用乙酸乙酯抽提(5mL×3)，合并乙酸乙酯层，用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，过滤除去无水硫酸钠，滤液减压蒸干，所得固体经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱)，得到通式I所示化合物。
方法二：冰浴下，将芳(杂)环取代丙烯酸化合物III(1.5mmol)、4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素化合物II(1.5mmol)加入至干燥的3mL N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴下搅拌0.5h，依次加入氰基磷酸二乙酯(DEPC，1.5mmol)和三乙胺(3mmol)，在冰浴下继续反应，TLC检测反应完全。向反应液中加入5倍体积的水，乙酸乙酯萃取，有机层依次用质量分数为5％的盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，过滤除去无水硫酸钠，滤液减压抽干，所得固体经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱)，得到通式I所示化合物。
方法三：室温下，将芳(杂)环取代丙烯酸酸化合物III：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基六氟磷酸酯(HATU)(1.5eq：1.4eq)加入至干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF，3ml)中，搅拌5～15min，加入三乙胺(3eq)，反应液变黄。继续搅拌30min加入4β-氨基4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素化合物II的盐酸盐(1.0eq)。反应0.5～12h后TLC检测原料点消失，停止反应，加水淬灭反应。用乙酸乙酯抽提3次(EA，5ml×3)，合并乙酸乙酯层，用饱和NaHCO3溶液、5％的盐酸水溶液、水、盐水洗涤有机层。有机层用无水硫酸钠干燥过夜，过滤除去无水硫酸钠，滤液减压蒸干，所得固体经柱层析分离(二氯甲烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱)，得到通式I所示化合物。
所述化合物III为3-(2-噻吩基)丙烯酸、3-(4-溴-2-噻吩基)丙烯酸、3-(3-甲基-2-噻吩基)丙烯酸、3-(2-呋喃基)丙烯酸、3-(1H-咪唑-2-基)-丙烯酸、3-(3-吡啶)丙烯酸、3-(2-吡啶)丙烯酸、3-(2-甲氧基吡啶-3-基)丙烯酸、吲哚-2-丙烯酸酸、吲哚-3-丙烯酸、2，4-二甲氧基肉桂酸、2,3-二甲氧基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、2-硝基肉桂酸、3-硝基肉桂酸、肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、4-氯肉桂酸、4-溴肉桂酸、4-氟肉桂酸。
实施例1
4β-4-(2”-噻吩丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-1)的制备
Figure BDA0002332759440000101
将3-(2-噻吩基)丙烯酸(1.15mmol)按照方法二的配比投料和后处理，制备得到化合物I-1，白色固体181mg，收率为29.42％。
ESI-MS m/z:536,[M+H]+；558,[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.66-7.62(m,Ar-H,2H),7.56(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.15-7.13(m,Ar-H,1H),6.84(d,J＝15.6Hz,1H),6.80(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.55(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.03-6.05(s,H-2’,6’,2H),5.98((d,J＝6.0Hz,OCH2O,2H),5.72(d,J＝7.6Hz,NH,重水未交换,1H),5.41-5.44(s,m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.62(d,J＝4.8Hz,1H),4.45-4.49(m,DMEP-H,H11a,1H),3.85-3.90(m,DMEP-H,H11b,1H),3.80(s,OCH3,6H),3.40-3.44(m,DMEP-H,H3,1H),2.88-2.93(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例2
4β-4-((4”-溴)-2”-噻吩丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-2)的制备
Figure BDA0002332759440000102
将3-(4-溴-2-噻吩基)丙烯酸(1.15mmol)与4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素II(1.15mmol)按照方法二投料和后处理，制备得到化合物I-2，白色固体275mg，收率为39.01％。
ESI-MS m/z:614,[M+H]+；636,[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.50-7.58(m,Ar-H,2H),7.55(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),6.84(d,J＝15.6Hz,1H),6.81(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.54(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.02-6.04(s,H-2’,6’,2H),5.97((d,J＝6.0Hz,OCH2O,2H),5.74(d,J＝7.6Hz,NH,重水未交换,1H),5.41-5.44(s,m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.62(d,J＝4.8Hz,1H),4.34-4.39(m,DMEP-H,H11a,1H),3.75-3.80(m,DMEP-H,H11b,1H),3.73(s,OCH3,6H),3.40-3.45(m,DMEP-H,H3,1H),2.93-2.98(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例3
4β-4-((3”-甲基)-2”-噻吩丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-3)的制备
Figure BDA0002332759440000111
将3-(3-甲基-2-噻吩基)丙烯酸(1.15mmol)与4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素II(1.15mmol)按照方法二投料和后处理，制备得到化合物I-3，白色固体255mg，收率为40.39％。
ESI-MS m/z:550,[M+H]+；574,[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.66(d,Ar-H,1H),7.55(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.11(m,Ar-H,1H),6.84(d,J＝15.6Hz,1H),6.81(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.57(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.28(s,H-2’,6’,2H),5.99((d,J＝6.0Hz,OCH2O,2H),5.72(d,J＝7.6Hz,NH,重水未交换,1H),5.38-5.42(s,m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.57(d,J＝5.2Hz,1H),4.35-4.39(m,DMEP-H,H11a,1H),3.75-3.80(m,DMEP-H,H11b,1H),3.65(s,OCH3,6H),3.38-3.44(m,DMEP-H,H3,1H),2.96-3.05(m,DMEP-H,H2,1H),2.26(s,CH3,3H).
实施例4
4β-4-(2”-呋喃丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-4)的制备
Figure BDA0002332759440000112
将3-(2-呋喃基)丙烯酸(1.15mmol)与4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素II(1.15mmol)按照方法二投料和后处理，制备得到化合物I-4，白色固体165mg，收率为27.65％。
ESI-MS m/z:520,[M+H]+；542,[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.80(m,Ar-H,1H),7.55(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.00(m,Ar-H,1H),6.84(d,J＝15.6Hz,1H),6.80(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.65(m,Ar-H,1H),6.54(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.03(s,H-2’,6’,2H),5.97(d,J＝6.0Hz,OCH2O,2H),5.73(d,J＝7.2Hz,NH,重水未交换,1H),5.40-5.43(s,m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.64(d,J＝4.8Hz,1H),4.40-4.44(m,DMEP-H,H11a,1H),3.86-3.90(m,DMEP-H,H11b,1H),3.78(s,OCH3,6H),3.40-3.43(m,DMEP-H,H3,1H),2.86-2.93(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例5
4β-4-(1”H-2”-咪唑丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-5)的制备
Figure BDA0002332759440000121
室温下，将3-(1H-咪唑-2-基)-丙烯酸(207mg，1.5mmol)与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基六氟磷酸酯(HATU)(532mg，1.4mmol)按方法三加入至2ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌10min后，加入三乙胺(0.42ml，3mmol)，反应液变黄。继续搅拌30min后加入4β-氨基4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素II盐酸盐(435mg，1mmol)。2.5h后TLC检测原料点消失，停止反应。加10ml水淬灭反应。经方法三后处理得到147mg白色固体化合物I-5。收率：27.68％。
ESI-MS m/z:532,[M+H]+；554,[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:13.47(s,1H),7.55(d,J＝15.2Hz,Hb,1H),7.43(d,Ar-H,1H),7.23(d,Ar-H,1H),6.84(d,J＝15.2Hz,1H),7.03(d,Ar-H,DMEP-H,1H),6.60(d,Ar-H,DMEP-H,1H),6.38(s,H-2’,6’,2H),6.00(d,J＝9.2Hz,OCH2O,2H),5.79(d,J＝7.2Hz,NH,重水未交换,1H),5.43-5.48(s,m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.64(d,J＝5.2Hz,1H),4.39-4.42(m,DMEP-H,H11a,1H),4.19-4.21(m,DMEP-H,H11b,1H),3.98-4.01(m,DMEP-H,H3,1H),3.68(s,OCH3,6H),3.36–3.23(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例6
4β-4-(3”-吡啶丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-6)的制备
Figure BDA0002332759440000131
将3-(3-吡啶)丙烯酸(1.5mmol)与4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素II(1mmol)按照方法三投料和后处理，得到化合物I-6，白色固体201mg，收率为37.08％。
ESI-MS：565(M+Na)+,1107(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.87(d,J＝8.1Hz,Ar-H,1H),8.71(dd,J＝4.8,1.6Hz,Ar-H,1H),8.24(m,Ar-H,1H),8.19(m,Ar-H,1H),7.57(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),6.89(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.84(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),6.57(1H,s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.32(s,H-2’,6’,2H),5.98(d,OCH2O,2H),5.76(d,J＝6.8Hz,NH,重水未交换,1H),5.44-5.47(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.54(d,J＝5.2Hz,H1,1H),4.37-4.39(m,DMEP-H,H11a,1H),3.74-3.89(m,DMEP-H,H11b,1H),3.67(s,OCH3,6H),3.41-3.43(m,DMEP-H,H3,1H),2.99–3.12(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例7
4β-4-(2”-吡啶丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-7)的制备
Figure BDA0002332759440000132
将3-(2-吡啶)丙烯酸(1.5mmol)与4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素II(1mmol)按照方法三投料和后处理，得到化合物I-7，白色固体183mg，收率为33.76％。
ESI-MS：565(M+Na)+,1107(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.87(d,Ar-H,1H),7.76(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.27-7.61(m,Ar-H,3H),7.35(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),6.89(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.58(1H,s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.34(s,H-2’,6’,2H),5.99(d,J＝6.8Hz,OCH2O,2H),5.78(d,J＝6.8Hz,NH,重水未交换,1H),5.47-5.54(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.55(d,J＝4.8Hz,H1,1H),4.38-4.41(m,DMEP-H,H11a,1H),3.85-3.89(m,DMEP-H,H11b,1H),3.70(s,OCH3,6H),3.40-3.43(m,DMEP-H,H3,1H),2.99–3.10(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例8
4β-4-(2”-甲氧基-3”-吡啶丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-8)的制备
Figure BDA0002332759440000141
将3-(2-甲氧基吡啶-3-基)丙烯酸(1.5mmol)与4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素II(1mmol)按照方法三投料和后处理，得到化合物I-8，白色固体123mg，收率为21.50％。
ESI-MS：595(M+Na)+,1167(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.79(dt,Ar-H,1H)，7.67(d,Ar-H,1H),7.55(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),6.89(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.84(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),6.54(1H,s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.32-6.34(m,H-2’,6’,Ar-H,3H),5.98(d,OCH2O,2H),5.77(d,J＝6.8Hz,NH,重水未交换,1H),5.44-5.47(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.54(d,J＝4.8Hz,H1,1H),4.32-4.36(m,DMEP-H,H11a,1H),3.92(s,OCH3,3H),3.87(s,OCH3,6H),3.62-3.67(m,DMEP-H,H11b,1H),3.40-3.43(m,DMEP-H,H3,1H),2.98–3.10(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例9
4β-4-(1”H-2”-吲哚丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-9)的制备
Figure BDA0002332759440000151
将吲哚-2-丙烯酸酸(1.5mmol)与4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素II(1mmol)按照方法一投料和后处理，得到化合物I-9，白色固体137mg，收率为24.12％。
ESI-MS：591(M+Na)+,1159(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:11.54(s,1H),7.60(d,J＝8.0Hz,Ar-H,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,Ar-H,1H),7.22(m,Ar-H,1H),7.19(m,Ar-H,1H),7.03(s,Ar-H,1H),7.57(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),6.88(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.84(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),6.57(1H,s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.30(s,H-2’,6’,2H),6.00(d,OCH2O,2H),5.74(d,J＝6.8Hz,NH,重水未交换,1H),5.48-5.52(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.56(d,J＝5.2Hz,H1,1H),4.37-4.39(m,DMEP-H,H11a,1H),3.99-4.04m,DMEP-H,H11b,1H),3.66(s,OCH3,6H),3.45-3.48(m,DMEP-H,H3,1H),3.05–3.08(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例10
4β-4-(1”H-3”-吲哚丙烯酰胺基)-4-脱氧-4′-去甲基表鬼臼毒素(I-10)的制备
Figure BDA0002332759440000152
将吲哚-3-丙烯酸(1.5mmol)与4β-氨基-4′-去甲基表鬼臼毒素II(1mmol)按照方法一投料和后处理，得到化合物I-10，白色固体159mg，收率为27.99％。
ESI-MS：591(M+Na)+,1159(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:11.61(s,1H),9.02(m,Ar-H,1H),7.56(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.32-7.55(m,Ar-H,2H),7.00-7.06(m,Ar-H,2H),6.91(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.84(d,J＝15.2Hz,Ha,1H),6.59(1H,s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.32(s,H-2’,6’,2H),6.00(d,J＝11.8Hz,OCH2O,2H),5.79(d,J＝6.8Hz,NH,重水未交换,1H),5.50-5.54(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.56(d,J＝5.2Hz,H1,1H),4.39-4.41(m,DMEP-H,H11a,1H),3.80-3.89(m,DMEP-H,H11b,1H),3.67(s,OCH3,6H),3.46-3.49(m,DMEP-H,H3,1H),3.06–3.14(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例11
4β-4-(2”，4”-二甲氧基苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素I-11的合成
Figure BDA0002332759440000161
将2，4-二甲氧基肉桂酸(115mg，0.55mmol)、1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(96mg，0.5mmol)、1-羟基苯并三唑(70mg,0.5mmol)加入二氯甲烷(10ml)中，搅拌30min，再加入化合物4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)，室温搅拌(方法一)，TLC检测反应完全，加水淬灭反应。分离有机层，水洗后浓缩，柱层析制备得到化合物I-11，白色固体227mg，收率77.08％。
ESI-MS：590(M+H)+,612(M+Na)+,1201(2M+Na)+.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.90(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),6.90(s,s,Ar-H,DMEP-H 1H,),6.62(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.51-6.59(m,2Ar-H+Ha,3H),6.40(s,2H),6.03-6.05(m,OCH2O,2H),5.76(d,J＝7.2Hz,1H,NH,重水未交换),5.44-5.47(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.68(d,J＝4.8Hz,1H),4.51-4.55(m,DMEP-H,1H),3.95-4.01(m,OCH3+DMEP-H,4H),3.92(s,OCH3,3H),3.89(s,OCH3,6H),3.06-3.10(m,DMEP-H,1H),2.95-2.99(dd,J1＝4.8Hz,J2＝14.0Hz,DMEP-H,H2,1H).
实施例12
4β-4-(2”，3”-二甲氧基苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-12)
Figure BDA0002332759440000171
将2,3-二甲氧基肉桂酸(115mg，0.55mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得220mg化合物I-12，收率74.70％。
ESI-MS：590(M+H)+,612(M+Na)+,628(M+K)+,1201(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.93(d,J＝15.6Hz,1H),7.09-6.92(m,3H),6.81(m,1H),6.54(d,1H),6.48(d,J＝15.6Hz,1H),6.03-6.05(m,2H),5.98-5.96(m,OCH2O,2H),5.72(d,J＝7.2Hz,1H),5.39(d,1H),5.37(m,1H),4.61(d,J＝4.8Hz,1H),4.45(m,1H),3.93-3.88(s,s,m,OCH3+OCH3+DMEP-H,3H,3H,1H),3.79(s,OCH3,6H),3.00(m,1H),2.88-2.92(m,1H).
实施例13
4β-4-(3”-甲氧基苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-13)
Figure BDA0002332759440000172
将3-甲氧基肉桂酸(0.60mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得209mg化合物I-13，收率74.77％。
ESI-MS：560(M+H)+,582(M+Na)+,598(M+K)+,1141(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.66(d,J＝15.6Hz,1H),7.28-7.32(m,1H),7.10(d,J＝7.6,1H),7.02(s,1H),6.92-6.95(m,1H),6.82(s,1H),6.55(s,1H),6.38(d,J＝15.6Hz,1H),6.33(s,2H),5.98(d,J＝6.0Hz,OCH2O,2H),5.74(d,J＝7.2Hz,NH,1H),5.37-5.41(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.62(d,J＝4.8Hz,1H),4.45-4.49(m,1H),3.87-3.92(m,1H),3.83(s,OCH3,3H),3.80(s,OCH3,6H),2.980-3.04(m,1H),2.87-2.92(m,1H).
实施例14
4β-4-(2”-甲氧基苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-14)
Figure BDA0002332759440000181
将2-甲氧基肉桂酸(98mg，0.55mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得217mg化合物I-14，收率77.64％。
ESI-MS：560(M+H)+,582(M+Na)+.596(M+Na+NH4)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.92(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.44-7.47(m,Ar-H,1H),7.33-7.37(m,Ar-H,1H),6.92-6.98(m,Ar-H,2H),6.83(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.55(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),6.55(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.33(s,H-2’,6’,2H),5.97-5.99(m,OCH2O,2H),5.72(d,J＝7.6Hz,NH,重水未交换,1H),5.38-5.41(m,H4+OH,OH重水交换,,2H),4.62(d,J＝4.8Hz,H1,1H),4.45-4.49(m,DMEP-H,H11a,1H),3.90(s,OCH3,3H),3.89-3.94(m,DMEP-H,H11b,1H),3.80(s,OCH3,6H),2.99-3.03(m,DMEP-H,H3,1H),2.88-2.93(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例15
4β-4-(2”-硝基苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-15)
Figure BDA0002332759440000182
将2-硝基肉桂酸(97mg，0.55mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得177mg化合物I-15，收率61.67％。
ESI-MS：575(M+H)+,597(M+Na)+,1171(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.05-8.10(m,Hb+Ar-H,2H),7.54-7.68(m,Ar-H,3H),6.85(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.57(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.34(s,H-2’,6’,2H),6.34(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),5.99-6.01(m,OCH2O,2H),5.88(d,J＝7.2Hz,NH,重水未交换,1H),5.39-5.42(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.63(d,J＝5.2Hz,H1,1H),4.47-4.52(m,DMEP-H,H11a,1H),3.89-3.94(m,DMEP-H,H11b,1H),3.81(s,OCH3,6H),3.03-3.06(m,DMEP-H,H3,1H),2.88-2.93(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例16
4β-4-(3”-硝基苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-16)
Figure BDA0002332759440000191
将3-硝基肉桂酸(97mg，0.55mmol)按照方法一与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得171mg化合物I-16，收率59.58％。
ESI-MS：597(M+Na)+,1171(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.03-8.08(m,Hb+Ar-H,2H),7.52-7.65(m,Ar-H,3H),6.82(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.55(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.32(s,H-2’,6’,2H),6.32(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),5.98(d,J＝6.8Hz,OCH2O,2H),5.86(d,J＝6.8Hz,NH,重水未交换,1H),5.37-5.40(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.61(d,J＝5.2Hz,H1,1H),4.45-4.49(m,DMEP-H,H11a,1H),3.87-3.92(m,DMEP-H,H11b,1H),3.79(s,OCH3,6H),3.00-3.04(m,DMEP-H,H3,1H),2.86-2.91(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例17
4β-4-(苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-17)
Figure BDA0002332759440000201
将肉桂酸(74mg，0.55mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得172mg化合物I-17，收率65.03％。
ESI-MS：552(M+Na)+,1081(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.68(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.36-7.50(m,Ar-H,3H),6.92-6.98(m,Ar-H,2H),6.81(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.54(1H,s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.38(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),6.32(s,H-2’,6’,2H),5.97(2d,J＝6.8Hz,OCH2O,2H),5.72(d,J＝6.8Hz,NH,重水未交换,1H),5.36-5.39(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.61(d,J＝4.8Hz,H1,1H),4.44-4.48(m,DMEP-H,H11a,1H),3.86-3.91(m,DMEP-H,H11b,1H),3.78(s,OCH3,6H),2.99-3.02(m,DMEP-H,H3,1H),2.86-2.91(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例18
4β-4-(3”，4”-二甲氧基苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-18)
Figure BDA0002332759440000202
将3,4-二甲氧基肉桂酸(1.0mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法二制得312mg化合物I-18，收率52.97％。
ESI-MS：590(M+H)+,612(M+Na)+,628(M+K)+,1201(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.62(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),6.85-7.09(m,Ar-H,3H),6.81(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.54(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.31(s,H-2’,6’,2H),6.26(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),5.95-5.97(m,OCH2O,2H),5.741(d,J＝7.2Hz,NH,重水未交换,1H),5.36-5.39(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.59(d,J＝4.8Hz,H1,1H),4.43-4.47(m,DMEP-H,H11a,1H),3.90(s,OCH3,3H),3.88(s,OCH3,3H),3.86-3.91(m,DMEP-H,H11b,1H),3.78(s,OCH3,6H),2.98-3.02(m,DMEP-H,H3,1H),2.86-2.91(m,DMEP-H,H2,1H)
实施例19
4β-4-(4”-氯苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-19)
Figure BDA0002332759440000211
将4-氯肉桂酸(91mg，0.55mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得128mg化合物I-19，收率45.47％。
ESI-MS：586(M+Na)+,1149(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.63(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.34-7.42(m,Ar-H,AA’BB’,4H),6.80(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.54(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.35(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),6.31(,s,H-2’,6’,2H),5.96-5.98(m,OCH2O,2H),5.77(1H,d,J＝6.8Hz,NH,重水未交换,1H),5.35-5.39(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.60(d,J＝4.8Hz,H1,1H),4.42-4.47(m,DMEP-H,H11a,1H),3.84-3.89(m,DMEP-H,H11b,1H),3.78(s,OCH3,6H),2.99-3.02(m,DMEP-H,H3,1H),2.85-2.90(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例20
4β-4-(4”-溴苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-20)
Figure BDA0002332759440000221
将4-溴肉桂酸(114mg，0.55mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得139mg化合物I-20，收率45.80％。
ESI-MS：630(M+Na)+,1239(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.62(d,J＝15.2Hz,Hb,1H),7.34-7.53(m,Ar-H,AA’BB’,4H),6.80(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.55(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.37(d,J＝15.6Hz,Ha,1H),6.32(s,H-2’,6’,2H),5.97(d,J＝6.0Hz,OCH2O,2H),5.73(d,J＝7.6Hz,NH,重水未交换,1H),5.35-5.39(m,H4+OH,OH重水交换,2H),4.61(d,J＝5.2Hz,H1,1H),4.43-4.47(m,DMEP-H,H11a,1H),3.85-3.90(m,DMEP-H,H11b,1H),3.79(s,OCH3,6H),3.00-3.03(m,DMEP-H,H3,1H),2.85-2.90(m,DMEP-H,H2,1H).
实施例21
4β-4-(4”-氟苯丙烯酰胺基)-4-脱氧-4’-去甲表鬼臼毒素(I-21)
Figure BDA0002332759440000222
将4-氟肉桂酸(83mg，0.55mmol)与4β-氨基-4’-O-去甲表鬼臼毒素(0.50mmol)反应，按照方法一，制得137mg化合物I-21，收率50.09％。
ESI-MS：570(M+Na)+,1117(2M+Na)+.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.65(d,J＝15.6Hz,Hb,1H),7.04-7.49(m,Ar-H,1H),6.80(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.54(s,Ar-H,DMEP-H,1H),6.31(s,H-2’,6’,2H),6.30(d,J＝15.6Hz,1H),5.96-5.98(m,OCH2O,2H),5.75(d,J＝7.6Hz,NH,1H),5.36-5.39(m,H4+OH,2H),4.60(d,J＝5.2Hz,H1,1H),4.43-4.47(m,DMEP-H,H11,1H),3.85-3.89(m,DMEP-H,H11,1H),3.78(s,OCH3,6H),2.98-3.02(m,DMEP-H,H3,1H),2.85-2.90(m,DMEP-H,H2,1H).
应用实施例1
实施例1～21制备的表鬼臼毒素衍生物抑制肿瘤细胞的活性实验
1、实验目的
在体外用MTT法实验测定实施例1～21制备的表鬼臼毒素衍生物对人体肿瘤细胞株的细胞毒作用。
2、仪器设备
(1)CO2细胞培养箱，PHARMASCIENTIFIC。
(2)酶联免疫检测仪，Labsystems,wellscan,MK.2。
(3)垂直单面双人超净工作台。
(4)倒置生物显微镜，37XB/37×BTV。
3、实验材料及配制
(1)细胞株：急性粒细胞白血病细胞(HL-60)，淋巴细胞白血病细胞株(L1210)，人肝癌(HepG2)，非小细胞肺癌细胞株(A549)。
(2)培养基：DMEM细胞培养基(GIBCO)：含10％灭活新生小牛血清(上海赛达生物药业有限公司)；L-谷氨酰氨(进口分装，SANGON)；丙酮酸钠；1×105U.L-1青霉素，100mg.L-1链霉素；无菌过滤，4℃保存。
IMDM细胞培养基：含20％灭活胎牛血清，GIBCO双抗；用于HL-60细胞。
(3)0.25％胰蛋白酶溶液(Trypsin)：Invitrogen公司，-20℃保存。
(4)磷酸缓冲液(PBS)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，溶于1L双蒸水，121℃高压消毒20min，4℃保存。
(5)MTT(AMRESCO)溶液：用PBS配成5mg/ml溶液。
(6)溶解液：每100ml去离子双蒸水含SDS10g，异丁醇5ml，浓硫酸0.12ml。
(7)样品：实施例1～21制备的表鬼臼毒素衍生物。
(8)对照品：依托泊苷注射液，江苏恒瑞医药股份有限公司。
4、实验方法
实施例1～21制备的表鬼臼毒素衍生物对上述肿瘤细胞株的细胞毒性通过MTT法测得。具体步骤如下：
(1)人肝癌(HepG2)、非小细胞肺癌细胞株(A549)、淋巴细胞白血病细胞株(L1210)的细胞培养：
①将细胞从液氮中取出，在37℃水浴中迅速解冻，细胞在无菌操作台中移入10ml无菌离心管中加6ml DMEM细胞培养基，1000转/分离心5分钟。弃去上清液，沉淀中加入5-6ml DMEM细胞培养基，滴管吹打使其悬浮后移入细胞培养瓶中，置37℃细胞培养箱内。②次日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞瓶中DMEM细胞培养基〔除L1210(小鼠淋巴白血病细胞株)悬浮细胞〕，加入5-6ml DMEM细胞培养基，置37℃细胞培养箱内。③隔日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞瓶中DMEM细胞培养基〔除L1210(小鼠淋巴白血病细胞株)悬浮细胞〕，加入PBS(pH7.4)2-3ml晃动清洗，倒掉PBS溶液后再重复一次清洗。在培养瓶中加入3-5滴0.25％胰蛋白酶溶液晃动均匀，加盖置于37℃细胞培养箱内3分钟左右，于显微镜下观察发现细胞自培养瓶壁上脱离，加DMEM细胞培养基2ml，滴管吹打使细胞完全脱离瓶壁后，分别移入2个干净培养瓶中，加入DMEM细胞培养基5-6ml吹打均匀，置于37℃细胞培养箱内。L1210(小鼠淋巴白血病细胞株)悬浮细胞取出1－2ml悬浮液，分别移入2个干净培养瓶中，加入DMEM细胞培养基5-6ml，置于37℃细胞培养箱内。④隔日，重复③步骤。在整个培养过程中，贴壁细胞不允许生长过密，悬浮细胞始终保持对数生长期。
(2)急性粒细胞白血病细胞(HL-60)的细胞培养：
①将细胞从液氮中取出，在37℃水浴中迅速解冻，细胞在无菌操作台中移入10ml无菌离心管中加6ml相应细胞培养基，1000转/分离心5分钟。弃去上清液，沉淀中加入5-6mlIMDM培养基，滴管吹打使其悬浮后移入细胞培养瓶中，置37℃细胞培养箱内。②次日，自培养箱中取出细胞，HL-60悬浮细胞将培养基移入10ml无菌离心管中1000转/分离心5分钟，弃去上清液后，沉淀细胞中加入相应培养基吹匀后，置37℃细胞培养箱内。③隔日，HL-60悬浮细胞取出1-2ml悬浮液，移入干净培养瓶中，加入IMDM细胞培养基，置于37℃细胞培养箱内。④隔日，重复③步骤。在整个培养过程中，贴壁细胞不允许生长过密，悬浮细胞始终保持对数生长期。
(3)样品制备：将样品(实施例1～21制备的表鬼臼毒素衍生物)溶解于二甲亚砜中，得到浓度为10mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀释，得到浓度分别为1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的稀释样品。
对照品制备：将VP-16溶解于PBS中，得到浓度为1mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀释，得到浓度分别为1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的稀释样品。
(4)将稀释好的样品加入平底96孔板中，每孔10μg，每点作两个平行测试。将DMSO相应作梯度稀释后加入板中，作为对照。
(5)取处于对数生长期的细胞，细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％小牛血清的DMEM培养基(HL-60为IMDM培养基)中，经苔盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至2×105细胞/ml。
(6)在平底96孔板中，每孔加入90微升细胞，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
(7)将加入细胞的平底96孔板在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48小时。
(8)每孔中加入20μl 5mg/mlMTT溶液，继续在培养箱中保温3～4小时。
(9)每孔加入100μl溶解液，继续在培养箱中保温过夜，使生成的甲臢晶体充分溶解。测定490nm光OD值。
(10)根据光吸收值计算化合物处理后细胞相对存活率。计算公式如下：
细胞相对存活率＝(药物处理组的光吸收值-背景光吸收值)/(DMSO处理组的光吸收值-背景光吸收值)×100％
(11)计算化合物对各肿瘤细胞的IC50。
利用MTT法对实施例1～21制备的表鬼臼毒素衍生物进行体外肿瘤细胞增殖抑制活性筛选，以依托泊甙为阳性对照，所得结果见表1。
表1 MTT法所测活性结果
Figure BDA0002332759440000251
Figure BDA0002332759440000261
HL-60为人早幼粒白血病细胞株；HepG2人肝癌细胞株；A549人肺癌细胞株；L1210为小鼠淋巴细胞白血病细胞株。
结论：实施例1～21制备的表鬼臼毒素衍生物对HL-60、L1210、HepG2和A549细胞株均有抑制作用，大部分化合物对L1210、HepG2的抑制活性好于VP-16或与之相当。同时从表1可见，本发明的大部分化合物对VP-16无效的A549细胞株也有抑制作用，有的活性较好。而且，本发明的绝大部分化合物对HL-60细胞株的抑制活性均好于上市药物VP-16。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (2)

1.一种表鬼臼毒素衍生物，其特征在于，所述表鬼臼毒素衍生物为以下结构的一种：
Figure FDA0003499340170000011
2.一种权利要求1所述的表鬼臼毒素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人非小细胞肺癌细胞、人肝癌细胞或小鼠淋巴白血病细胞。
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