CN114853781B - 一种hiv-1逆转录酶靶向共价抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HIV‑1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1及其制备方法和应用。所述化合物结构如下，本发明还涉及含有DW1的药物组合物。本发明还提供上述化合物以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)药物中的应用。

Description

一种HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1及其制备方法以及作为HIV-1抑制剂的应用。

背景技术

艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的重大传染性疾病。据WHO最新统计，截至2020年底，全球约有3770万HIV感染者，艾滋病的预防与治疗形势仍十分严峻。HIV属于逆转录病毒科、慢病毒属，分为HIV-1和HIV-2两个亚型，其中HIV-1致病力强，是AIDS的主要病原体。HIV-1的复制周期可分为吸附与融合、逆转录、整合、转录及翻译、装配、出芽与成熟等环节，理论上抑制复制周期的任意环节均可中断病毒的复制。目前共有30多种新化学实体分子被美国FDA批准上市，临床上艾滋病的治疗常采用将几种不同靶点药物联用的疗法，即“高效抗逆转录病毒疗法”。但由于HIV-1的遗传异质性和基因组的高度变异性，致使HIV-1对现有药物均产生不同程度的耐药性。此外，长期用药带来的毒副作用以及并发症等问题，也给患者带来沉重负担。因此，开发新作用机制的抗艾滋病药物一直是该领域的研究热点。

共价抑制剂是指能够与特定的靶标共价结合抑制其生物学功能的化合物。共价抑制作用与靶标具有更强的结合力，因此共价抑制剂具有显著提高化合物的抗耐药性、降低用药剂量、延长作用时间等优点。近年来，共价结合策略被越来越多的用于抗病毒药物的研发。针对现有HIV-1NNRTIs存在的抗耐药性差、药代动力学性质不佳的缺点，本项目以HIV-1RT为研究靶标，基于共价结合的抗耐药性药物设计策略，基于HIV-1RT与NNRTIs的共晶结构解析，设计了含有亲电基团氧磺酰氟共价弹头的化合物DW1，使其能够特异性地与NNIBP中Tyr318上羟基形成共价键结合，提高化合物与靶标的亲和力，进而提高化合物的活性和抗耐药性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1及其制备方法，本发明还提供了该化合物作为抗艾滋病药物的活性结果和应用。

本发明的技术方案如下：

1、一种HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1

一种HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1，或其药学上可接受的盐，具有如下所示的结构：

2、HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1的制备方法

HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1的制备方法，步骤包括：以2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶1为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与2,6-二甲基-4-氰基苯酚发生亲核取代生成中间体2；然后中间体2与3-苄氧基苯胺经Buchwald-Hartwig偶联反应生成中间体3，中间体3脱去苄基保护得中间体4，最后中间体4在二氯甲烷溶液中与咪唑磺酰氟三氟甲烷磺酸鎓盐反应生成目标产物DW1；

合成路线如下：

试剂及条件:(i)2,6-二甲基-4-氰基苯酚，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20℃；(ii)1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦，三(二亚苄基丙酮)二钯，碳酸铯，1,4-二氧六环，90℃；(iii)氢溴酸，醋酸，100℃；(ⅳ)二氯甲烷，20℃。

3、HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1的抗HIV-1活性及应用

对按照上述方法合成的共价抑制剂DW1进行了细胞水平的抗HIV-1(III_B)，单耐药突变株L100I、K103N、Y181C、Y188L、E138K以及双耐药突变株F227L+V106A的活性筛选。

其抗HIV-1活性和细胞毒性数据如图1所示。对HIV-1野生株，DW1具有强效的抑制活性，EC₅₀为11nM；对HIV-1多种临床常见突变株，DW1均具有强有效的活性。尤其是对临床最常见的单突变株K103N与Y181C，DW1表现出高效抗耐药性，EC₅₀值分别为20nM和38nM；对双突变株F227L+V106A，DW1同样具有高效地抑制活性，EC₅₀值为64nM。此外，DW1的细胞毒性极低，CC₅₀为125411nM。

4、HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1与HIV-1RT的分子对接

将化合物DW1与HIV-1RT用薛定谔软件进行分子对接(PDB code:3M8Q)，Pymol显示对接结果。如图2所示，目标化合物DW1在非核苷类逆转录酶抑制剂结合口袋中呈现马蹄形构象，它与逆转录酶的结合模式具有以下特征:(1)中心的嘧啶环和NH linker与K101的主链形成氢键作用；(2)左侧与氨基酸残基F227、Y188、Y181形成的疏水作用和π-π堆积作用；(3)右侧基团与K103、P236、V106等氨基酸残基形成范德华作用力。此外化合物右侧苯环3位上引入的氧磺酰氟基团与Tyr318位置相近，可发生共价结合形成共价键相互作用，验证了DW1是靶向于逆转录酶的共价抑制剂。

本发明的HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1可作为抗艾滋病药物候选药物用于制备抗艾滋病药物。

一种抗HIV-1药物组合物，包括本发明的HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

本发明提供了结构全新的HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1及其制备方法，本发明还提供了DW1抗HIV-1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1可作为抗艾滋病候选药物应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为HIV-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。

附图说明

图1是DW1的结构、细胞活性和细胞毒性数据图；

图2是DW1与HIV-1RT的共价结合分子对接图。

具体实施方式

通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

实施例1：4-((2-((3-羟基苯基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基(4)制备

称取3,5-二甲基-4-氰基苯酚(1.47g,10mmol)和碳酸钾(2.07g,15mmol)于50mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌15分钟，然后加入2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶(2.03g,10mmol)继续室温搅拌1小时(TLC检测反应完毕)。此时有大量的白色固体生成，慢慢地向其中加入200mL冰水，过滤，真空干燥箱干燥，然后在DMF/H₂O中重结晶得化合物2，收率93％，熔点258-260℃。ESI-MS:m/z 316.3(M+1)，C₁₅H₁₀ClN₃OS(315.02)。

称取三(二亚苄基丙酮)二钯(0.15g，0.16mmol)、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(0.1g，0.16mmol)于50mL圆底烧瓶中，加10mL二氧六环溶解室温搅拌15分钟，加入3-(苄氧基)苯胺(0.38g，1.91mmol)与碳酸铯(0.77g，2.37mmol)继续搅拌10分钟后加入中间体2(0.5g，1.58mmol)，在N₂保护下加热回流12h，TLC检测反应。反应结束后冷却至室温，加饱和食盐水20mL，用乙酸乙酯萃取，分离有机相，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离，得中间体3。收率48％，熔点234-236℃。ESI-MS:m/z 479.2(M+1)，C₂₈H₂₂N₄O₂S(478.15)。

称取中间体3(0.4g，0.84mmol)置于50mL圆底烧瓶中，加入2mL氢溴酸和2mL醋酸，100℃加热6小时，TLC检测反应。反应结束后冷却至室温，蒸干反应液并向残余物中加入饱和食盐水20mL，用乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离，得关键中间体4。收率31％，熔点154-156℃。ESI-MS:m/z 389.4(M+1)，C₂₁H₁₆N₄O₂S(388.10)。

实施例2：2,6-二甲基苯氧基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)氨基)苯基硫代氟酸盐(DW1)的制备

称取化合物4-((2-((3-羟基苯基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氧基)-3,5-二甲基(0.39g,1.0mmol)和咪唑磺酰氟三氟甲烷磺酸鎓盐(0.65g,2.0mmol)于20mLDCM中，室温条件下搅拌8h(TLC检测反应完毕)。减压蒸出溶剂，然后向残留底物中加入20mL乙酸乙酯，饱和食盐水溶液洗涤3次，每次10mL，分取有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。快速柱层析分离得到目标化合物DW1。收率：77％，熔点:268-270℃。ESI-MS:m/z 471.2(M+1),493.5(M+Na).C₂₁H₁₅FN₄O₄S₂(470.05).

实施例3：目标化合物的体外抗HIV活性测试实验

测试原理

化合物体外抗HIV活性筛选采用MTT法。MTT全称为溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮(商品名：噻唑蓝)，可用于检测细胞的存活和生长。检测原理为：MTT可以与活的细胞内琥珀酸脱氢酶结合还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。二甲基亚砜可以溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测其在590nm下的吸光度(A)值可以间接的反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度(EC₅₀)即可得出目标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度(CC₅₀)。

测试材料和方法

(1)HIV-1(III_B)、各种HIV-1耐药株：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究所提供。

(2)MT-4细胞：由比利时鲁汶大学医学院Rega研究院提供。

(3)MTT：购自美国Sigma公司。

(4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。

(5)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用MTT比色法测定细胞活力，用酶标仪中记录在590nm下的吸光度(A)值,计算出EC₅₀和CC₅₀。

(6)MTT比色法：加入样品溶液培养一段时间后，向每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续培养若干小时后，弃染色液，并向每孔加入150μL DMSO，充分混合，用酶标仪中测定590nm下的吸光度值。

实验方法

在96孔细胞培养板上，加入50μL含1×10⁴MT-4细胞培养液，再分别加入20μL感染HIV-1的MT-4细胞混悬液(每毫升含100倍CCID₅₀)或者空白培养基(毒性测定)，然后加入不同浓度的待测化合物溶液，每个浓度设计3个复孔。接着细胞在5％CO₂氛围，37℃下培养5天，向每个孔中加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，继续培养2小时，然后加入DMSO，使用酶标仪测定反应溶液在540nm处的吸收度，计算化合物不同浓度下的细胞增值率P％。同时设空白和药物对照组和阳性药物对照组，由此计算化合物保护50％的细胞免于HIV诱导的细胞病变所需浓度(EC₅₀)。活性结果如图1所示。

Claims (5)

1.一种HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1或其药学上可接受的盐，其特征在于具有如下所示的结构：

2.如权利要求1所述的HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1或其药学上可接受的盐，其特征在于所述药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐。

3.如权利要求1所述的HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1的制备方法，其特征在于步骤如下：

以2,4-二氯噻吩并[2,3-d]嘧啶1为初始原料，首先在N,N-二甲基甲酰胺溶液中与2,6-二甲基-4-氰基苯酚发生亲核取代生成中间体2；然后中间体2与3-苄氧基苯胺经Buchwald-Hartwig偶联反应生成中间体3，中间体3脱去苄基保护得中间体4，最后中间体4在二氯甲烷溶液中与咪唑磺酰氟三氟甲烷磺酸鎓盐反应生成目标产物DW1；

合成路线如下：

试剂及条件:(i)2,6-二甲基-4-氰基苯酚，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20℃；(ii)1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦，三(二亚苄基丙酮)二钯，碳酸铯，1,4-二氧六环，90℃；(iii)氢溴酸，醋酸，100℃；(ⅳ)二氯甲烷，20℃。

4.一种如权利要求1所述HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1或其药学上可接受的盐在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒药物中的应用。

5.一种药物组合物，包含权利要求1所述HIV-1逆转录酶靶向共价抑制剂DW1和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。