CN114209816B - 甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物及其制备方法、应用 - Google Patents
甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种甘油葡萄糖苷‑SOD偶联物及其制备方法和应用，所述甘油葡萄糖苷‑SOD偶联物由SOD和甘油葡萄糖苷制备而成，其中，SOD和甘油葡萄糖苷通过酯建相连。本发明提供的甘油葡萄糖苷‑SOD偶联物具有良好的稳定性和生物活性，与SOD相比，其稳定性更高，生物活性更强，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一类具有清除超氧阴离子自由基作用的金属蛋白酶，广泛分布在微生物、植物和动物体内。SOD通过专一催化超氧阴离子自由基(O2-)产生歧化反应而清除超氧阴离子自由基，从而防御生物体内氧中毒，具有抗炎、抗癌、抗衰老和抗辐射等作用。目前，SOD广泛应用于药品、化妆品和食品行业，但仍因体内半衰期短较短体、稳定性较差等缺点，使应用受到限制。
发明内容
为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物及其制备方法和应用。本发明通过以N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为催化剂活化SOD上的羧基，甘油葡萄糖苷(Glucosylglycerol,GG)通过酯键连接到SOD分子骨架上，从而成功制备得到甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物，其具有良好的稳定性和生物活性，因此具有良好的实际应用价值。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物，其由超氧化物歧化酶和甘油葡萄糖苷制备而成。
在本发明的实施方式中，超氧化物歧化酶和甘油葡萄糖苷通过酯键相连。
在本发明的一些较优的实施方式中，超氧化物歧化酶的分子量为30～40KDa，甘油葡萄糖苷的分子量为254.24Da。
本发明所述甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物的结构简式为GG～SOD，简称为GS。在本发明的实施方式中，本发明所述的甘油葡萄糖苷-SOD偶联物可以结构简式的形式表示，也可以GS表示。
在本发明的实施方式中，本发明采用酯键连接超氧化物歧化酶和甘油葡萄糖苷，使超氧化物歧化酶在弱酸性条件下可以从GS偶联物中释放出来，成为游离状态，快速到达病灶周围发挥抗氧化作用。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物的方法，其包括：N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)与4-二甲氨基吡啶(DMAP)作为催化剂活化超氧化物歧化酶上的羧基，加入甘油葡萄糖苷(GG)，GG的羟基与超氧化物歧化酶上的羧基进行酯化反应，即得。
在本发明的实施方式中，反应结束后可进行纯化的步骤。本领域技术人员可通过本领域的已知方法对本发明的偶联物选择适宜的纯化方法。作为示例，在本发明的一些实施方式中，本发明提供了一种较优的纯化方法，其包括进行透析和冻干。比如，在一些具体地实施方式中，可采用透析袋法进行透析，将反应产物倒入预处理的透析袋中，用水或者DOSO透析一至多次后，除去杂质，进行滤膜过滤后预冻，然后放入冷冻干燥机中冻干，即可。
其中，在纯化得到GS后，经超声处理，在溶解介质中可形成分散良好、粒度均一的球型结构。
进一步地，在本发明所述的制备甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物方法，包括：
制备GS偶联物：将50mg超氧化物歧化酶溶解于二氯甲烷中，分别加入200mg DCC以及250mg DMAP，振荡混匀后，室温条件下活化。加入20mg GG，继续反应，反应完成后，反应产物经纯化即得GS偶联物；经过超声法处理，在溶解介质中可以形成分散良好、粒度均一的球型结构。
在制备GS偶联物的过程中，超氧化物歧化酶活化反应时间控制为15～55min；加入GG后反应48h；反应产物纯化步骤包括透析、干燥；超声功率为40W，时间为2～10min。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述第一方面中所述的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物包含上述第一方面中所述的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物和至少一种药学上可接受的辅料或药物载体。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述药物组合物可以胃肠道给药或非胃肠道给药，所述剂型包括但不限于可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒等。
常用的药学上可接受的辅料为赋形剂，比如溶剂、粘合剂、填充剂、润湿剂等，这些可在制备成特定的剂型时选择加入。如有需要，还可加入调味剂、着色剂、稳定剂、润滑剂等其他辅料。本领域技术人员可使用本领域公知的技术将本发明的GS配制成药物组合物或药物制剂。比如可根据由沈阳药科大学主编的现代药物制剂丛书进行药物制剂的制备。以及，除本发明中提到的，合适的药用辅料还可以是本领域已知的其他类型，例如作者Paul JSheskey等人编著的《药用辅料手册》(Handbook of Parmaceutical Excipients)中所记载的，该书目前已修订至第八版，第一版公开于1986年，第八版公开于2017年。
所述药物载体可以是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或载体，用于将药物活性成分递送至动物或人体内。载体可以是液体或固体，并按照计划的给药方式进行选择。蛋白和脂质体也是药物载体。
在本发明的第四方面，本发明提供了上述第一方面中所述的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物或上述第三方面中所述的药物组合物或上述第四方面中所述的药物制剂在制备治疗与抗氧化相关的疾病的药物和/或抗肿瘤药物中的用途。
在本发明中，所述与抗氧化相关疾病包括但不限于心血管疾病、老年性白内障和关节炎等；所述肿瘤包括但不限于包括黑色素瘤、乳腺肿瘤、肺部肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤和肾脏肿瘤。
在本发明一些实施方式中，所述治疗与抗氧化相关的疾病的药物为抗氧化的药物、抗炎的药物和/或自身免疫性疾病的药物。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种治疗与抗氧化相关的疾病的方法，其包括向受试者施用有效剂量的本发明的GS偶联物或包含该偶联物的药物组合物或药物制剂。其中，所述治疗与抗氧化相关的疾病包括全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎和/或自身免疫性溶血性贫血。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述治疗有效量是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
相较于现有技术，本发明的优势在于：本发明中的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物与超氧化物歧化酶相比，增强了超氧化物歧化酶的抗氧化和抗肿瘤活性，整合甘油葡萄糖苷分子有助于大分子稳定及抗癌的生理功能，使获得偶联物生物活性更强、稳定性更强。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1：实施例1中GS偶联物的纯化图
图2：实施例1中分离组分的电泳图；
图3：实施例1中GS偶联物粒径形态图；
图4：实验例1中SOD和GS偶联物的细胞毒性测定；
图5：实验例2中SOD和GS偶联物对TNF-α分泌的影响；
图6：实验例3中SOD和GS偶联物对IL-6分泌的影响；
图7：实验例4中SOD和GS偶联物对IL-1β分泌的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：甘油葡萄糖苷-SOD偶联物(GG～SOD，GS)的制备
制备步骤如下：
取50mg SOD溶于二氯甲烷中，加入4当量的DCC及5当量的DMAP，振荡混匀后室温反应45min。活化结束后，加入1当量的GG继续反应48h。DMSO透析三次，水透析4次，除去未反应的杂质。0.22μm滤膜过滤后，预冻放入冷冻干燥机中冻干，获得GS偶联物。经过超声法处理，在溶解介质中可以形成分散良好、粒度均一的球型结构。
采用纯化仪和SDS-PAGE鉴定GS结构，结果如图1、图2所示，已成功制备出GS偶联物。球形结构，如结果如图3所示。
实验例1：SOD和GS偶联物的细胞毒性测定
实验过程如下：
(1)实验药物：SOD、实施例1制备的GS偶联物，两组药物中SOD浓度一致。
(2)实验方法：采用CCK-8法测定样品对细胞毒性的影响。细胞选用小鼠腹腔巨噬细胞。简而言之，细胞以每孔1×104个细胞的比例接种于含10U/mL、39U/mL、156U/mL、625U/mL和1250U/mL样品的96孔板中。每个浓度10个复孔。在孵箱中孵育48h后，测定细胞存活率，检测波长为450nm。以细胞存活率为指标评价样品对细胞的毒性作用。
细胞毒性测定结果见图4。由图可以看出，在不同浓度的酶活力下，细胞存活率与正常细胞相比无显著差异，当最大剂量为1250U/mL时，SOD和GS两种样品均未表现出明显的细胞毒性，表明GG对SOD的修饰并未明显增加细胞毒性。
实验例2：SOD和GS偶联物对TNF-α分泌的影响
实验过程如下：
(1)实验药物：SOD、实施例1制备的GS偶联物，两组药物中SOD浓度一致。
(2)实验方法：将小鼠腹腔巨噬细胞进行分组，每组包括4个平行孔，①正常对照组；②模型对照组(加PBS)；③GS组(20、100、500U/mL)；④SOD+GG组；⑤GG组。除正常对照组，其它实验组均同时加入LPS。各组对应药物和LPS(1μg/mL)共孵育24h，取上清，离心，采用鼠TNF-α的ELISA试剂盒测定各炎症因子的水平。
SOD和GS偶联物对TNF-α分泌的影响实验结果见图5。由图中可以看出，用LPS作用24h后，模型对照组的平均水平是正常对照组的两倍，除GG组外，其它实验组均与模型对照组的TNF-α水平有显著性差异，且与正常对照组无明显差异。酶活量不同的GS组和SOD组之间无差异，且不同组间未表现出显著的剂量依赖性。同样，混合物组与SOD组相比也未有差异。因此，GS通过SOD酶的活性抑制了LPS诱导的TNF-α分泌的增加。
实验例3：SOD和GS偶联物对IL-6分泌的影响
实验过程如下：
(1)实验药物：SOD、实施例1制备的GS偶联物，两组药物中SOD浓度一致。
(2)实验方法：将小鼠腹腔巨噬细胞进行分组，每组包括4个平行孔，①正常对照组；②模型对照组(加PBS)；③GS组(20、100、500U/mL)；④SOD+GG组；⑤GG组。除正常对照组，其它实验组均同时加入LPS。各组对应药物和LPS(1μg/mL)共孵育24h，取上清，离心，采用鼠IL-6的ELISA试剂盒测定各炎症因子的水平。
SOD和GS偶联物对IL-6分泌的影响的结果见图6。由图可知，模型对照组细胞分泌的IL-6的水平显著高于正常组。GG组与模型组对比无显著性差异，表明GG对LPS刺激的IL-6水平升高没有明显的抑制作用。其余所有实验组IL-6的水平均与对照组有显著性差异。其中，同剂量的GS抑制能力要强于SOD，随着剂量增高，GS和SOD抑制IL-6分泌的能力略有增加，但未成显著的剂量依赖性。
实验例4：SOD和GS偶联物对IL-1β分泌的影响
实验过程如下：
(1)实验药物：SOD、实施例1制备的GS偶联物，两组药物中SOD浓度一致。
(2)实验方法：将小鼠腹腔巨噬细胞进行分组，每组包括4个平行孔，①正常对照组；②模型对照组(加PBS)；③GS组(20、100、500U/mL)；④SOD+GG组；⑤GG组。除正常对照组，其它实验组均同时加入LPS。各组对应药物和LPS(1μg/mL)共孵育24h，取上清，离心，采用鼠IL-1β的ELISA试剂盒测定各炎症因子的水平。
SOD和GS偶联物对IL-1β分泌的影响的实验结果见图7。由图可知，LPS刺激24h后，胞外上清液中IL-1β的水平显著增加，除GG组外，其它实验组IL-1β的水平均有不同程度的下降，且与模型对照组有显著性差异。GS与SOD不同剂量组间均不存在显著性差异。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物，其特征在于，其由超氧化物歧化酶和甘油葡萄糖苷制备而成，其中超氧化物歧化酶和甘油葡萄糖苷通过酯键相连；
所述甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物的制备方法为N,N'-二环己基碳二亚胺与4-二甲氨基吡啶作为催化剂活化超氧化物歧化酶上的羧基，加入甘油葡萄糖苷，甘油葡萄糖苷的羟基与超氧化物歧化酶上的羧基进行酯化反应，即得；
所述制备甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物是将超氧化物歧化酶溶解于二氯甲烷中，分别加入N,N'-二环己基碳二亚胺与4-二甲氨基吡啶，振荡混匀后，室温条件下活化；加入甘油葡萄糖苷，继续反应，反应完成后，反应产物经纯化即得甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物；经过超声法处理，在溶解介质中可以形成分散良好、粒度均一的球型结构。
2. 根据权利要求1所述的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物，其特征在于，超氧化物歧化酶的分子量为30-40 K Da，甘油葡萄糖苷的分子量为254.24 Da。
3. 根据权利要求1所述的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物，其特征在于，超氧化物歧化酶的用量为：50mg；甘油葡萄糖苷的用量为：20mg；N,N'-二环己基碳二亚胺的用量为：200mg; 4-二甲氨基吡啶的用量为：250mg。
4. 根据权利要求1所述的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物，其特征在于，超氧化物歧化酶活化反应时间控制为15-55 min；加入甘油葡萄糖苷后反应时间为48h；反应产物纯化步骤包括透析、干燥；超声功率为40 W，时间为2-10 min。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-4任一项所述的甘油葡萄糖苷-超氧化物歧化酶偶联物。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物通过胃肠道给药或非胃肠道给药，所述药物组合物的剂型包括可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括辅料和/或药物载体；所述辅料包括赋形剂，所述赋形剂包括溶剂、粘合剂、填充剂、润湿剂一种或几种组合；所述辅料还包括调味剂、着色剂、稳定剂、润滑剂一种或几种组合；所述药物载体包括溶剂、悬浮剂、载体。
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