CN114177218A - 一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物及其制备方法 - Google Patents

一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种富含1‑脱氧野尻霉素的桑叶提取物及其制备方法。所述制备方法包括如下步骤：S1、预处理：将桑叶清洗、烘干、粉碎，得桑叶粉末；S2、超声处理：将桑叶粉末加入水中，进行超声处理，离心，取上清，得到上清液1和残渣；S3、酶解处理：残渣加入等质量的水，先用复合酶1酶解，再用复合酶2酶解，离心，取上清，得到上清液2；S4、过滤、浓缩、干燥：将S2中的上清液1和S3中的上清液2合并，进行膜过滤、膜浓缩和喷雾干燥。该方法得到的桑叶提取物提取率高，在很大程度上保留了桑叶中的活性成分，具有极强的降血糖效果，并且产品安全、品质好，色浅、具有植物清香。

Description

一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及桑叶提取技术领域，尤其涉及一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物及其制备方法。
背景技术
桑叶为桑科植物桑的叶片，呈卵形或宽卵形，长约15厘米，宽约10厘米，叶柄长约4厘米，叶片基部心脏形，顶端微尖，边缘有锯齿，叶脉密生白柔毛。老叶较厚黄绿色。嫩叶较薄，暗绿色。质脆易碎，握之扎手。全国大部分地区多有生产，尤以长江中下游及四川盆地桑区为多。味苦、甘，性寒。归肺、肝经。功效疏散风热、清肝明目。主治风热感冒、咳嗽头痛、目赤。临床上习惯认为经霜者质佳，称“霜桑叶”或“冬桑叶”。始载于《神农本草经》：气味苦甘寒，有小毒，主寒热出汗。桑叶作为药食同源的物质被收录于2015版《中国药典》中，通常被制作成饮片。
近年来，糖尿病已经成为发达国家和发展中国家最严重的健康问题之一。现如今，降低血糖的最常见方法仍是注射胰岛素、吃降糖药物，但吃药时常伴有不良副作用的出现，开发新型安全有效药物刻不容缓。
桑叶中富含黄酮、生物碱、多糖及γ-氨基丁酸等多种活性成分。桑叶中的生物碱，是桑叶中一种重要的活性成分，是重要的天然糖苷酶抑制剂。其分子结构类似葡萄糖，其中的氮元素能增强其取代二糖(或低聚糖)与糖苷酶结合，从而竞争性抑制糖苷酶活性。特别是1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)是桑叶的标志性生物碱，是桑叶中的特征活性指标。1-脱氧野尻霉素可以同小肠中的麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等2一糖苷酶结合，使二糖不能进一步分解为单糖所吸收，从而明显地抑制了食后血糖值急剧升高的现象。延缓糖尿病的发作和恶化。已有文献证实,在糖尿病发生发展中往往同时具有胰岛素抵抗和胰岛受损而胰岛素分泌不足的特征。因此，1-脱氧野尻霉素不仅可抑制血糖上升,并且可保护胰岛细胞,促进胰岛素分泌,从而发挥降血糖功效，对糖尿病的治疗开创了新方向。
目前，1-脱氧野尻霉素的市场价格昂贵(98％纯度1-脱氧野尻霉素约20万元/克)，其应用受到很大限制。目前已经发现，枯草杆菌、放线菌等微生物可以发酵产1-脱氧野尻霉素。但由于产量极低，一般为0.01g/L左右，目前仅仅局限于菌株初步筛选和改造，没有开展大规模发酵制备1-脱氧野尻霉素的尝试。利用桑叶为原料生产1-脱氧野尻霉素具有巨大的潜力。其优点在于原料来源丰富，价格低廉，是生产1-脱氧野尻霉素等活性物质的理想原料。但在桑叶中，其含量仅为0.11％，由此可见，要获得以其为主要成分的桑叶提取物并非易事。因此很有必要建立一种高效的1-脱氧野尻霉素提取方法。
目前，桑叶提取物的制备方法主要有蒸馏水提取和乙醇提取，所得提取物的有效成分控制指标多以DNJ作为代表，含量通常为1％以下。具体制备方法如下：
1、蒸馏水提取：在烘干后的样品加入蒸馏水，恒温煮沸提取，过滤后收集滤液，滤渣加入蒸馏水进行再提取。但该方法温度高，时间长，易破坏活性物质的成分，只能进行初步分离提取植物体内游离的未与其他成分(蛋白等)结合的DNJ。
2、乙醇提取：在烘干后的样品加入乙醇浸提，过滤收集滤液，滤渣再用乙醇提取，旋转蒸发滤液，回收乙醇并将滤液浓缩，离心后取上清，通过阳离子交换树脂纯化。采用乙醇提取制备的桑叶提取物，会使桑叶产品味道、颜色和水溶性欠佳。并且乙醇用量大，提取时间长对活性成分具有一定的破坏作用。
综上，传统生产工艺生产出来的桑叶提取物目前存在以下问题：
1、1-脱氧野尻霉素的提取效率低；
2、产品的功效不高；
3、产品的味道、颜色和水溶性欠佳；
4、产品存在有机溶剂残留，影响了产品的安全性。
如何提高1-脱氧野尻霉素的提取效率，制备具有良好降糖效果的桑叶提取物已成为已成为桑叶提取物发展的关键问题。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物及其制备方法，其解决了现有技术中存在的1-脱氧野尻霉素提取效率较低、功效不高的问题。
本发明提供一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
S1、预处理：将桑叶清洗、烘干、粉碎，得桑叶粉末；
S2、超声处理：将桑叶粉末加入水中，进行超声处理，离心，取上清，得到上清液1和残渣；
S3、酶解处理：残渣加入等质量水，先用复合酶1酶解，再用复合酶2酶解，离心，取上清，得到上清液2；
S4、过滤、浓缩、干燥：将S2中的上清液1和S3中的上清液2合并，进行膜过滤、膜浓缩和喷雾干燥，得到桑叶提取物。
优选地，步骤S2中，桑叶粉末和水的质量比为1:10-1:30；超声处理的温度为55-75℃、时间为1-3h。
在该料液质量比范围内提取效果最好。超声处理温度在该范围内，分子运动加速，增加了活性成分DNJ的溶解渗透，提高了提取率；如果温度过低会影响提取效果，而温度过高，蛋白质、糖类等分子会加速溶解扩散，提升粘度，加大传质阻力，反而阻碍DNJ从桑叶中提取出来。如果时间过短，提取效果不佳，时间过长会增加生产成本。
优选地，步骤S2中，离心转速为20000-30000r/min，时间为10-20min。
优选地，步骤S3中，复合酶1包括纤维素酶和β-葡聚糖酶，复合酶2包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；
其中，纤维素酶和β-葡聚糖酶的质量比为1:1；胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为2:1。
优选地，步骤S3中，复合酶1质量与残渣质量的比为0.2±0.02％，复合酶1酶解的pH值为4-5，温度为50-55℃，时间为2-4h。
复合酶1在该加酶量、pH、酶解温度和酶解时间范围内提取效果最好。如果酶的浓度过低影响提取效果；酶的浓度过高，提取率反而会下降，这是因为酶浓度过大，酶和部分酶解的纤维素、半纤维素会对桑叶活性成分DNJ形成包裹的现象，反而不利于DNJ的溶出。pH值在该范围内，DNJ有较好的溶解性，更利于溶出。pH值过大，提取率会下降。pH值过小，可能溶出过多杂质，使溶液的粘度过大，影响DNJ的提取。酶解温度在一定范围内升高，可以提高复合酶1的活性和反应速率，提高提取率，但温度过高，酶会失活，提取率反而会下降。在该酶解时间范围内，提取效率最好，时间过短会影响提取效果，时间过长会增加生产成本。
优选地，步骤S3中，复合酶2质量与残渣质量的比为0.2±0.02％，复合酶2酶解的pH值为7.8-8.5，温度为50-60℃，时间为2-4h。
复合酶2在该加酶量、pH、酶解温度和酶解时间范围内提取效果最好。如果酶的浓度过低会影响提取效果；酶的浓度过高，提取率会下降。pH值在该范围内，复合酶2的活性最好，从而有利于桑叶细胞膜和细胞内蛋白的酶解，利于DNJ的溶出；pH过低或过高，其活性均会受到影响，从而影响提取效果。酶解温度在该范围内，可以提高复合酶2的活性和反应速率，提取率升高，但温度过高，酶会失活，提取率反而会下降。在该酶解时间范围内，提取效率最好，时间过短会影响提取效果，时间过长会增加生产成本。
优选地，步骤S3中，离心转速为20000-30000r/min，离心温度为25±5℃，离心时间为10-20min。
优选地，步骤S4中，所述膜过滤中的膜孔径为500-3000D，膜过滤的温度为20-30℃；膜浓缩中的膜孔径为100-300D。
膜过滤可除去溶液中残余的酶，同时可以除去大分子色素等杂质。膜浓缩可除去水和小分子无机盐等。与现有技术中采用的各种柱层析等精制手段相比，膜过滤和膜浓缩可最大程度的保留桑叶提取物中的活性成分。
另一方面，本发明还提供了由上述制备方法得到的富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物。
再一方面，本发明还提供了一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明对桑叶先进行超声处理，再采用复合酶1+复合酶2对桑叶进行酶解处理，其技术原理如下：
(1)桑叶表面细胞的细胞壁含有纤维素和半纤维素，细胞膜含有蛋白质，这些均构成细胞的天然屏障，阻碍活性分子的释放。先利用超声处理可使细胞浆流动，细胞震荡，从而使细胞壁变薄或破裂，利于胞内活性成分的溶出，并且在随后进行酶解处理时，可使酶更易与纤维素、半纤维素和蛋白质接触，促进水解过程，从而利于细胞壁和细胞膜的酶解，使细胞内活性成分的溶出阻力减小，从而利于细胞内活性成分的释放和提取，增大提取率。
(2)先进行超声处理可显著降低纤维素、半纤维素的分子量，为随后的复合酶1酶解反应提供更适宜的底物，使复合酶1与底物之间的亲和力增强，从而提高了复合酶1的催化效率，进而提高了酶促降解效率；同时，先进行超声处理可破坏蛋白质的微结构，降低蛋白质的尺寸，有利于蛋白质的渗透，同时超声处理会破坏蛋白质的二级结构，使复合酶2与底物蛋白质之间的亲和力增强，从而有利于酶促反应的进行。因此，超声处理可使底物发生降解，更适用于复合酶1和复合酶2的作用，从而提高酶促水解效率，加快酶促反应进程。
综上，超声和复合酶1+复合酶2的协同作用共同促进了DNJ的释放和提取，从而提高了生产效率、节约了成本，有望成为一种酶促反应新技术。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明对桑叶先进行超声处理，再采用复合酶1+复合酶2对桑叶进行酶解处理，之后通过膜过滤和膜浓缩对桑叶进行除杂、脱色处理，三者配合使用，提高了1-脱氧野尻霉素的提取效率、在很大程度上保留了桑叶中的活性成分，并且具有使桑叶提取物具有很高的溶解度和降血糖效果。发明人在实验过程中，筛选了不同种类的酶，包括纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、普鲁兰酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶等，意外发现纤维素酶和β-葡聚糖酶组成的复合酶1和胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶2配合使用，效果最好，提取率最高，四种酶之间具有协同作用。发明人在实验过程中，还对超声处理和酶解处理的顺序进行了比较，意外发现，与酶解过程同时进行超声处理或者酶解之后进行超声处理的方法相比较，本发明中将桑叶先进行超声提取，再进行酶解处理的方法可使1-脱氧野尻霉素的得率明显提高。
本发明采用膜分离技术对桑叶进行脱色、除杂处理，克服了桑叶水煮后颜色黑绿、异味严重的问题，得到色浅、具有植物清香的桑叶提取物，从而大大方便了桑叶可食用性。本发明生产过程中不使用有机溶剂，不产生溶剂残留，极大提高了产品的安全性。
因此，采用超声提取和复合酶酶解联用，可以优势互补，在温和可控的条件下提取更多的生物碱等活性成分。反应条件温和、酶解时间短，对提取物的结构和理化性质无影响，得到的桑叶提取物在很大程度上保留了桑叶中的活性成分，具有极强的降血糖效果，并且产品安全、品质好，色浅、具有植物清香。
附图说明
图1为本发明实施例1中桑叶提取物的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。
实施例1桑叶提取物的制备
1)经收割的新鲜桑叶清洗、烘干、粉碎，得桑叶粉末；
2)加入15倍质量的水，于70℃左右，超声波2h；采用管式离心机离心20min，转速20000r/min，得上清液和残渣，清洗残渣继续离心，得上清液和残渣，将两次得到的上清液合并得到上清液1；
3)将步骤2)中得到残渣中加入等质量的水，调节料液的pH值为4.5，添加残渣质量0.2％的复合酶1，水解过程中维持体系温度55℃，pH4.5，时间为3h；调节pH至7.8，添加残渣质量0.2％的复合酶2，继续酶解3h，温度55℃；将步骤3)中得到的酶解液采用管式离心机离心10min，转速20000r/min，温度在25℃，得到上清液2；
4)将步骤2)得到的上清液1和步骤3)得到的上清液2混合后采用膜过滤，膜孔径为3000D，得到产品稀料液，固形物含量约5±2％，过程中控制料液及环境温度为25℃；
5)将步骤4)中得到的已除酶的产品稀料液采用膜设备(膜孔径100D)浓缩至固形物含量20％以上，得到产品浓缩液1；
6)将步骤5)中得到的产品浓缩液1过0.22μm孔径滤芯以除去微生物，得到产品浓缩液2；
7)将步骤6)中得到的产品浓缩液2喷雾干燥得到粉末状固体产品(进风200±10℃、出风90±5℃)；
8)将步骤7)中的粉末状固体产品进行包装得到成品。
实施例2桑叶提取物的制备
1)经收割的新鲜桑叶清洗、烘干、粉碎，得桑叶粉末；
2)加入10倍质量的水，于55℃左右，超声波3h；采用管式离心机离心15min，转速25000r/min，得上清液和残渣，清洗残渣继续离心，得上清液和残渣，将两次得到的上清液合并得到上清液1；
3)将步骤2)中得到残渣中加入等质量的水，调节料液的pH值为4，添加残渣质量0.22％的复合酶1，水解过程中维持体系温度50℃，pH4，时间为2h；调节pH至8.5，加入添加残渣质量0.22％的复合酶2，继续酶解2h，温度60℃；将步骤3)中得到的酶解液采用管式离心机离心15min，转速30000r/min，温度在30℃，得到上清液2；
4)将步骤2)得到的上清液1和步骤3)得到的上清液2混合后采用膜过滤，膜孔径需500D，得到产品稀料液，固形物含量约5±2％，过程中控制料液及环境温度为20℃；
5)将步骤4)中得到的已除酶的产品稀料液采用膜设备(膜孔径300D)浓缩至固形物含量20％以上，得到产品浓缩液1；
6)将步骤5)中得到的产品浓缩液1过0.22μm孔径滤芯以除去微生物，得到产品浓缩液2；
7)将步骤6)中得到的产品浓缩液2喷雾干燥得到粉末状固体产品(进风200±10℃、出风90±5℃)；
8)将步骤7)中的粉末状固体产品进行包装得到成品。
实施例3桑叶提取物的制备
1)经收割的新鲜桑叶清洗、烘干、粉碎，
2)加入30倍质量的水，于75℃左右，超声波1h；采用管式离心机离心10min，转速30000r/min，得上清液和残渣，清洗残渣继续离心，得上清液和残渣，将两次得到的上清液合并得到上清液1；
3)将步骤2)中得到残渣中加入等质量的水，调节料液的pH值为5，添加残渣质量0.18％的复合酶1，水解过程中维持体系温度53℃，pH5，时间为4h；调节pH至8，加入添加残渣质量0.18％的复合酶2，继续酶解4h，温度50℃；将步骤3)中得到的酶解液采用管式离心机离心20min，转速25000r/min，温度在20℃，得到上清液2；
4)将步骤2)得到的上清液1和步骤3)得到的上清液2混合后采用膜过滤，膜孔径1000D，得到产品稀料液，固形物含量约5±2％，过程中控制料液及环境温度为30℃；
5)将步骤4)中得到的已除酶的产品稀料液采用膜设备(膜孔径200D)浓缩至固形物含量20％以上，得到产品浓缩液1；
6)将步骤5)中得到的产品浓缩液1过0.22μm孔径滤芯以除去微生物，得到产品浓缩液2；
7)将步骤6)中得到的产品浓缩液2喷雾干燥得到粉末状固体产品(进风200±10℃、出风90±5℃)；
8)将步骤7)中的粉末状固体产品进行包装得到成品。
对比例1
与实施例1不同之处在于：步骤3)不包括复合酶1的酶解步骤；
对比例2
与实施例1不同之处在于：步骤3)不包括复合酶2的酶解步骤；
对比例3
与实施例1不同之处在于：步骤3)同时加入复合酶1和复合酶2，pH6.5，时间3h；对比例4
与实施例1不同之处在于：步骤3)为将步骤2)中得到残渣中加入等质量的水，同时加入果胶酶和纤维素酶，加入量分别为残渣质量的0.2％，水解过程中维持体系温度55℃，pH4.5，时间为3h；
对比例5
与实施例1的不同之处在于：不包括步骤2)；
对比例6
与实施例1的不同之处在于：不包括步骤3)；
对比例7
与实施例1的不同之处在于：先进行步骤3)，再进行步骤2)；
对比例8
与实施例1的不同之处在于：不包括步骤2)，在步骤3)中加入超声处理2h；
对比例9醇提制备桑叶提取物
1)经收割的新鲜桑叶清洗、烘干、粉碎，得桑叶粉末；
2)加入15质量的70％乙醇浸提2h，提取温度为50℃，过滤收集滤液，滤渣再用乙醇提取1次，旋转蒸发滤液，回收乙醇并将滤液浓缩，离心后取上清；将上清液上阳离子交换树脂纯化。
应用例1活性成分的含量检测
检测方法：准确称取制备的0.5g桑叶提取物于100mL烧杯中，加入80％甲醇溶液，超声30min后定容至10mL。精确称取2mg 1-脱氧野尻霉素标准品，用80％甲醇配制成2、1、0.5、0.125、0.05mg/mL的标准溶液。分别取待测样品提取液、1-脱氧野尻霉素标准品各20μL，加入0.4mol/L硼酸钾缓冲液(pH8.5)20μL,5mmol/LFMOC-CL溶液(溶解于50％乙腈)30μL，混匀后于20℃水浴中反应20min,之后加入20μL0.1mol/L的甘氨酸，让剩余的衍生化试剂反应5min以终止反应，最后加入910μL0.1％的醋酸水溶液，混匀后用0.45μL的一次性针头过滤器过滤后，取10μL进样分析。
色谱条件：岛津C18(4.6mm×250mm,5μm),流动相A为0.1％醋酸，流动相B为乙腈，体积比为60:40，流速1.0mL/min,进样量10μL，柱温30℃，波长265nm。
绘制峰面积Y对浓度x(μg/m1)的标准曲线，得线性方程为y＝3595.5x+4167.2，R2＝0.9995。计算桑叶中DNJ的含量并计算提取率，实施例1中桑叶提取物的色谱图如图1所示。检测结果如表1、表2所示。
表1活性成分检测
Figure BDA0003336095030000081
Figure BDA0003336095030000091
表2提取收率
收率％
实施例1 48.00
实施例2 46.86
实施例3 45.42
对比例1 18.33
对比例2 17.53
对比例3 21.50
对比例4 21.11
对比例5 18.12
对比例6 15.97
对比例7 36.88
对比例8 39.68
对比例9 17.14
由结果可知：实施例1-3的1-脱氧野尻霉素含量和提取率高于对比例1-9，由对比例1-4可知，加入复合酶1和复合酶2的效果优于单独加入复合酶1或复合酶2的效果；先加入复合酶1再加入复合酶2的效果优于同时加入复合酶2和复合酶2的效果和同时加入果胶酶和纤维素酶的效果；由对比例5-8可知，先进行超声处理再进行酶解处理的效果优于单独超声处理或单独酶解处理的效果；并且优于先进行酶解处理再进行超声处理和超声酶解处理同时进行的效果；由对比例9可知，本发明的提取效果优于现有的醇提制备桑叶提取物的效果。
应用例2降糖效果检测
方法：利用PNPG法检测桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率。实验结果如表3所示。
表3对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
Figure BDA0003336095030000092
Figure BDA0003336095030000101
由结果可知：实施例1-3制备的桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于对比例1-9，由此可知，本发明方法制备的产品的具有极强的降血糖效果。
应用例3感官检测
方法：对实施例1-3制备的桑叶提取物的口味、颜色和气味进行感官检测。
结果：实验结果如表4所示。
表4感官检测
口味 颜色 气味
实施例1 柔和 浅褐色 植物清香
实施例2 柔和 浅褐色 植物清香
实施例3 柔和 浅褐色 植物清香
由结果可知：本发明制备的桑叶提取物的口味柔和，颜色浅褐色，具有植物清香，方便食用。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、预处理：将桑叶清洗、烘干、粉碎，得桑叶粉末；
S2、超声处理：将桑叶粉末加入水中，进行超声处理，离心，取上清，得到上清液1和残渣；
S3、酶解处理：残渣加入等质量的水，先用复合酶1酶解，再用复合酶2酶解，离心，取上清，得到上清液2；
S4、过滤、浓缩、干燥：将S2中的上清液1和S3中的上清液2合并，进行膜过滤、膜浓缩和喷雾干燥，得到桑叶提取物。
2.如权利要求1所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤S2中，桑叶粉末和水的质量比为1:10-1:30；超声处理的温度为55-75℃、时间为1-3h。
3.如权利要求1所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤S2中，离心转速为20000-30000r/min，时间为10-20min。
4.如权利要求1所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤S3中，复合酶1包括纤维素酶和β-葡聚糖酶，复合酶2包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；
其中，纤维素酶和β-葡聚糖酶的质量比为1:1；胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为2:1。
5.如权利要求1所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤S3中，复合酶1质量与残渣质量的比为0.2±0.02％，复合酶1酶解的pH值为4-5，温度为50-55℃，时间为2-4h。
6.如权利要求1所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤S3中，复合酶2质量与残渣质量的比为0.2±0.02％，复合酶2酶解的pH值为7.8-8.5，温度为50-60℃，时间为2-4h。
7.如权利要求1所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤S3中，离心转速为20000-30000r/min，离心温度为25±5℃，离心时间为10-20min。
8.如权利要求1所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述膜过滤中的膜孔径为500-3000D，膜过滤的温度为20-30℃；膜浓缩中的膜孔径为100-300D。
9.一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物，由权利要求1-8任一项所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
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Denomination of invention: A mulberry leaf extract rich in 1-deoxynojirimycin and its preparation method

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Pledgor: HUBEI REBORN BIOTECH CO.,LTD.

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